行政院國家科學委員會補助專題研究計畫 成果報告 期中進度報告 血管新生與傷口癒合之關係研究 Investigation on the relationship between neovascularization and wound healing 計畫類別 : 個別型計畫 整合型計畫計畫編號 :NSC 94-2320-B-006-046 執行期間 : 94 年 08 月 01 日至 95 年 12 月 31 日 計畫主持人 : 黃玲惠教授共同主持人 : 謝式洲助理教授計畫參與人員 : 劉技謀 林獻珍 游小旻 林孝謇 張淑雅 李蕙齡 成果報告類型 ( 依經費核定清單規定繳交 ): 精簡報告 完整報告 本成果報告包括以下應繳交之附件 : 赴國外出差或研習心得報告一份 赴大陸地區出差或研習心得報告一份 出席國際學術會議心得報告及發表之論文各一份 國際合作研究計畫國外研究報告書一份 處理方式 : 除產學合作研究計畫 提升產業技術及人才培育研究計 畫 列管計畫及下列情形者外, 得立即公開查詢 涉及專利或其他智慧財產權, 一年 二年後可公開查詢 執行單位 : 國立成功大學生物科技研究所 中華民國 95 年 12 月 31 日
一 中文摘要 血管新生是傷口癒合過程中最關鍵的步驟, 因此探討血管新生的調控機制, 是傷口癒合研究的重要主題 第二型纖維母細胞生長因子 (bfgf) 是組織損傷後最先釋出的促血管新生因子, 為瞭解其在血管新生和傷口癒合的生理意義, 本計畫透過動物傷口癒合模式, 評估對於血管新生狀態以及整體傷口癒合品質的影響 本研究利用實驗室所研發之含透明質酸之膠原蛋白基質 (PCM-AH), 做為全深度傷口的覆蓋材料, 而以注射方式在傷口部位給予第二型纖維母細胞生長因子, 並在手術後第 6 12 24 與 120 天觀察傷口癒合和血管新生的結果, 試驗之基質包括 PCM-AH-bFGF bfgf PCM-AH Integra 及空白組 藉由分析傷口癒合速度 免疫細胞浸潤程度 間質細胞的移入增生與分化 上皮新生 細胞外基質的生成以及癒合組織的厚度等, 以完整評估傷口癒合的品質 而有關血管新生的探討上, 包括新生血管的管徑大小 血管脈絡的密度 管腔結構以及血管成熟度, 都是分析的重要項目 結果空白組與前三組的傷口閉合速度最快, 而 Integra 組卻有延遲的現象 ; 在癒合初期 PCM-AH-bFGF 與 bfgf 兩組有吸引發炎細胞移入的現象, 纖維母細胞的密度以 PCM-AH-bFGF bfgf 與 PCM-AH 三組較高 ; 在血管新生方面,PCM-AH 與 bfgf 兩組個別有促進血管新生的作用,PCM-AH-bFGF 組的血管新生有加成的現象 ; 新生皮膚厚度方面,PCM-AH-bFGF 組最接近週邊之正常組織 ; 上皮厚度則於初期各組皆有變厚的現象, 到 120 天仍未完全恢復到正常厚度, 需要更長時間的觀察 ; 在癒合組織型態 膠原蛋白走向以及彈性纖維表現上,PCM-AH-bFGF 與 PCM-AH 組皆有較接近正常皮膚組織的結果 本研究發現,PCM-AH 基質添加 bfgf 對於全深度皮膚傷口的癒合有進一步的良好促進效果, 在臨床上具有應用價值與潛力 關鍵字 : 血管新生 傷口癒合 第二型纖維母細胞生長因子 膠原蛋白基質 透明質 酸 I
二 英文摘要 Angiogenesis is the most critical issue in the wound healing process, therefore investigation of the control mechanism of angiogenesis is an important subject in wound healing. Fibroblast growth factor-2 (bfgf) is the first angiogenic factor released from wound site after tissue injures, the current study investigates its role on wound healing. In order to demonstrate the physiological functions of bfgf in wound healing, this project evaluated the effects of bfgf on angiogenesis, and the quality of regenerative tissues in animal model. The porous collagen-hyaluronan matrix (PCM-AH) has been developed and proved to be adequate for full-thickness skin wounds in our laboratory. The current study is aimed at investigating the efficacy of combination of bfgf and PCM-AH on wound healing. Full-thickness wounds were created on the dorsal skin of Hartley Guinea pigs. The wounds were filled with PCM-AH -bfgf, PCM-AH, bfgf, or Integra respectively or left opened as blank controls. The wounds were observed grossly every other days and histologically at day 6, 12, 24 and 120 postoperatively. Our results demonstrated that the closer of most wounds was significantly faster than in the Integra group. Attraction of the infiltration of inflammatory cells into matrices was observed in the groups of PCM-AH-bFGF and bfgf at day 6 postoperatively. Promotion of fibroplasias at the wound sites was found in the groups of PCM-AH-bFGF, bfgf, and PCM-AH at day 6. Both the groups of PCM-AH and bfgf were found to promote angiogenesis in the wound sites, and further promotion was observed in the group of PCM-AH-bFGF. The thickness of regenerative skin was most close to the normal counterpart in the group of PCM-AH-bFGF. The thickness of epidermis in all groups was initially higher than normal epidermis and reduced along with time. In the study of tissue morphogenesis, the restoration and organization of collagen and elastin fibrils were the closest to the normal counterpart in the group of PCM-AH-bFGF, next to the groups of PCM-AH and bfgf. Based on the above results, it may conclude that the addition of bfgf to the PCM-AH matrix can further promote the speed and quality of wound healing and which is valuable in clinical applications. Keywords: angiogenesis, wound healing, fibroblast growth factor-2, collagen matrices, hyaluronan II
一 前言 隨著生醫材料科學與細胞生物學的進步, 促成了組織工程學的誕生, 組織工程潛在的優勢包括促進緊急傷口修復, 使可預期的修復成正常的構造與功能, 及使損傷或退化的組織再生 為達到此一目標, 組織工程的研發主要包含了三大要素, 分別是提供細胞生長所需要的架構 (scaffold) 或基質, 細胞類型, 以及提供細胞生長與分化所需要的活性因子 (active ingredient) 人工皮膚是組織工程重要的發展產品之一, 本研究室所研發的膠原蛋白 - 透明質酸基質 (PCM-AH) 已證實具有促進傷口癒合的作用, 在本計畫更進一步的加入 bfgf, 觀察此種的使用方式是否對於傷口癒合能有更良好的促進效果 二 研究目的 本實驗室已經建構可以促進傷口癒合且使癒合組織結構優良的多孔性膠原蛋白 - 透明質酸基質, 並於體外細胞實驗證實基質中血管促進因子的添加, 不僅可以促進細胞的增生移入, 且可以造成血管的增生 而 bfgf 在傷口癒合過程中已證實有多種效果, 包括促進發炎細胞的浸潤 粒狀組織 ( granulation tissue ) 的形成 葡萄胺聚醣 (glycosaminoglycan, GAG) 與細胞外基質的沉積和規則性的排列 纖維母細胞的增生 癒合皮膚物理性張力的增加, 以及血管新生作用的進行等等 因此本計畫探討 血管新生與傷口癒合之關係研究, 希望合併膠原蛋白 - 透明質酸基質與 bfgf 的生物活性, 經由動物模式直接評估其影響血管新生與傷口癒合品質間的關聯性 三 文獻探討 生物體的皮膚主要具有避免水分散失, 以及細菌或毒性物質滲入的功能 不僅如此, 由於真皮層內的細胞外基質 (extracellular matrix) 能夠保存生長因子以及多醣類分子如葡萄胺聚醣等, 因此可影響甚至是調控細胞的生理活性 [1, 2], 所以皮膚完整性的維持十分重要 皮膚傷口癒合的機制可大致區分為四個連續的時期, 分別是止血發炎期 纖維增生期 收縮合成期以及組織重建期 [1, 3, 4] 當結締組織受到損傷後, 體內的凝血機制會立即啟動, 使纖維蛋白凝塊在傷口處形成, 同時該受傷組織將釋放促發炎反應的細胞激素, 誘導多核球浸潤並清除病原菌以及壞死的細胞或組織殘骸 [3, 4] 由於免疫細胞可在傷口部位分泌多種生長因子, 因此將刺激受傷組織的纖維母細胞大量增生同時生合成各種細胞外基質的組成份, 也促進內皮細胞進行血管新生作用 (angiogenesis)[2-4]; 而此產生的新生組織稱為粒狀組織 (granulation tissue) 為了修復受傷組織的結構與生理功能, 在收縮合成期的階段, 間質細胞會分泌大量的細胞外基質 當傷口癒合的階段進入組織重建期, 其首要的工作便是改變新生膠原蛋白纖維的排列 ; 而另一個特徵, 即是傷口部位的粒狀組織將轉變為疤痕組織, 究其原因乃是由於間質細胞和新生血管的消失所導致 [5]; 因此欲控制疤痕的規模與型態, 瞭解血管新生作用與粒狀組織退化之間的關聯性將是可行的研究方向 [5, 6] 雖然血管新生作用的活性在粒狀組織的生成時期最為旺盛, 其影響卻涵蓋了整個傷口癒合的過程 [2, 7, 8] 組織在受到損傷之後, 造成第二型纖維母細胞生長因子 (basic fibroblast growth factor, bfgf or FGF-2) 可自細胞內或細胞外基質中釋出 [9], 開始啟動血管新生的刺激訊號 ; 而因凝血反應所產生的凝血酶 (thrombin), 則可直接促進內皮細胞對血管內皮細胞生長因子 (vascular endothelial growth factor, VEGF) 的感受性, 進一 1
步誘使其表現 A 型明膠酶 (gelatinase A) 而順利瓦解血管基底膜 (basement membrane) 的結構, 以藉此脫離原有的血管 [6, 8] 血小板(platelet) 則是另一個在止血期刺激血管新生的主要因素, 其所分泌的細胞激素包括 VEGF PDGF TGF-β bfgf 以及血管生成素第一型 (angiopoietin-1) 等, 將促進內皮細胞的增生 爬行, 與管狀結構的生成 [6, 8] 一旦傷口適當止血並進入發炎時期, 由於巨噬細胞與單核球 (monocyte) 會大量浸潤並分泌多種細胞激素, 而這些激素均具有促血管新生的能力, 因此血管新生的活性將顯著提高 在傷口癒合的後期, 由於粒狀組織已取代原有的受傷部位, 同時大量累積的細胞外基質也需要重新排列以恢復原有結構的規則性和皮膚正常生理功能, 加上細胞激素不再存在而導致促血管新生因子的刺激訊號消失, 組織中的血管將開始發生退化現象 [6] 而內生性抑血管新生分子, 自然成為此時期調控機制的重心 ; 以周細胞為例, 其可分泌出活化形式的 TGF-β, 阻礙內皮細胞的增生, 而自第十八型膠原蛋白所裂解的血管內膜阻生素 (endostatin), 則具有降低傷口血管密度的功能 [2, 8, 10] 因此新生組織若很快地失去了細胞與血管的存在, 加上傷口產生過度收縮的情況, 最後將形成疤痕組織 ; 其不論對於傷口外觀或是生理功能, 均為不良的癒後情況 所以深入探討血管新生作用在傷口癒合中的進程, 將可瞭解主要調控的分子機制, 以實質的去協助解決因異常的血管新生而導致的傷口癒合問題 當皮膚受到損傷而最早出現的促血管新生因子是 bfgf, 此分子應扮演了引發血管新生作用的關鍵角色 [14] FGF 最初是從牛的腦下垂體 (bovine pituitary gland) 內所萃取出來, 因為具有促進纖維母細胞株 NIH3T3 cells 增生的特性, 故以此來命名 [15-17] 目前已發現的 FGF, 有 20 個結構相近但功能相異的成員 [10], 其中第一型 (FGF-1 or afgf) 與第二型 (FGF-2 or bfgf) 和血管新生較為相關 [14, 18] 包括發炎細胞 內皮細胞和纖維母細胞, 均會表現 afgf 與 bfgf, 而此二者可透過肝素結合區 (heparin binding domain) 和細胞外基質中的蛋白多醣 (proteoglycans) 如硫酸肝素 (heparin sulfate) 等結合, 故可適當保存在組織中 : 因此當皮膚受到損傷, 即被釋出而發揮其生理活性 [14] 歸納已發表的研究文獻可知, 利用活體動物作為實驗系統來探討 FGF 在傷口癒合中所扮演的角色, 是最普遍的方式 Buntrock 等人於 80 年代初期將 FGF 注射到大鼠傷口中, 發現粒狀組織的生成和微血管的密度都有明顯增加 [19]; 而 McGee 等人根據實驗結果推測,bFGF 促進傷口癒合較佳的因素, 可能與促進膠原蛋白沉積和規則排列有關 [20] 另外在以豬或天竺鼠(guinea pig) 為動物模式的傷口試驗中, 研究者外加 bfgf 則可促進表皮新生的速度 [21, 22], 同時傷口在外觀上與對照組沒有任何差異 [22] Knighton 等人將 bfgf 添加在高分子聚合物中, 進一步移植到兔子的角膜 (cornea), 發現可引起發炎反應並刺激血管新生 [23]; 而在細胞或組織培養的條件下,bFGF 也證實可影響人類角膜內皮細胞增生與移動的情況 [24] 此外利用 bfgf 處理小鼠的缺氧性潰瘍, 可有效促進皮膚的癒合速度 [25], 或是增加癒合組織的拉伸強度 [26] 使用糖尿病鼠為模式動物來探討 bfgf 的研究顯示, 其可增加粒狀組織的成熟度 [27, 28] 與血管新生 [28, 29], 且刺激傷口部位細胞增生的效果較 TGF-β 更為顯著 [30] 而 Tsuboi 等人在開放性傷口的實驗中證實,bFGF 可改善糖尿病小鼠在免疫細胞浸潤 上皮新生 粒狀組織生成以及膠原蛋白累積的情況, 並提高局部微血管的密度 [31, 32]; 而其中吸引免疫細胞的特性可能與後續促血管新生因子的釋放有關 [33] 由於 bfgf 經由 2
影響血管新生作用而調控傷口癒合的機制尚未全盤清楚, 而著眼於其未來在臨床應用上將極具潛力, 因此我們以天竺鼠的背部全深度傷口作為實驗模式, 有系統的評估各項血管新生的指標, 以及傷口癒合的整體品質可瞭解 bfgf 促進血管新生對傷口癒合的意義 為了凸顯外加 bfgf 的生理活性, 本研究的動物實驗需要製造全深度傷口, 因此所移除的皮膚組織將包括真皮層在內, 使保存在細胞外基質中的生長因子可同時去除而不產生影響 然而理想的傷口癒合模式, 給予適當的基質骨架作為組織再生的模版是重要的條件之一 [10, 34], 除了可避免傷口脫水或伺機性的感染之外, 亦能促進周圍細胞的移入與增生, 使傷口組織癒合情況更佳 ; 而皮膚替代物的研發便是基於這樣的理念所採用的策略 [35, 36] 現階段對於大面積皮膚缺損的治療方式, 例如燒燙傷病人, 臨床上多將病患自體皮膚取下, 切割成篩網狀後再覆蓋於傷口處 ; 一旦傷口面積過大, 則自體皮膚的來源便會受到限制 [35] 雖然研究人員亦嘗試在實驗室中以培養方式製備自體表皮 (cultured epidermal autografts), 但由於過程耗時費力, 所以並不符合急迫性的需求 目前雖有數種相關人工皮膚替代物的產品 [35, 36], 可供臨床外科醫生選擇 ; 然而其價格過於高昂, 是實際應用上最大的考量 理想的皮膚替代物, 其性質應具有良好的生物相容性, 移植後不產生免疫排斥反應, 同時可經生物體代謝吸收, 使傷口癒合後能形成類似原正常皮膚之結構 [36]; 而符合這些要素的天然性分子中, 膠原蛋白是最適當的材料之一 膠原蛋白可自動物結締組織中萃取, 經過純化分析的步驟, 以不同方法製備出多樣的形式, 如凝膠狀 海綿狀或薄膜狀等 [37] 為了發展人工皮膚與組織工程的骨架模版, 本研究室已研發出具一系列專利之三維膠原蛋白基質製備技術 ; 在重組性膠原蛋白基質部分, 可不經化學交聯之處理即具有抗收縮的特性 [38] 另外我們更成功直接由結締組織製備出多孔性膠原蛋白基質 [39], 其除了擁有重組性膠原蛋白基質的優點之外, 同時更具有天然的結構強度, 較目前一般重組性膠原蛋白基質穩定, 適合作為組織工程的材料 本計畫即採用此多孔性膠原蛋白基質, 覆蓋於全深度傷口上, 提供足夠空間使細胞能在基質中進行移動與增生 四 研究方法 1. 各種膠原蛋白基質的製備在傷口癒合的實驗中, 為探討透明質酸與 bfgf 對於傷口癒合的效果, 以膠原蛋白基質為主體, 共製備以下四種不同組成的基質 : 實驗使用之基質, 是以豬之真皮經物理化學方法處理, 並進行殺菌及去除細胞的動作, 將豬真皮製備成,1.5cm x 1.5cm 大小的多孔性基質, 再添加入經活化的透明質酸, 稱之 PCM-AH 而本研究的實驗組別主要有: PCM-AH-bFGF ( 添加 bfgf 於 PCM-AH) bfgf PCM-AH Open Wound 或 Integra 等四種傷口類型 (1) 膠原蛋白基質以本實驗室研發之專利技術, 直接由動物皮膚結締組織製備而得具良好孔洞性之膠原蛋白基質 (2) 含透明質酸之膠原蛋白基質篩選適當分子量之透明質酸分子, 溶解成低濃度的水溶液 ; 為了增加透明質酸 (HA) 於基質中的滯留效果, 將其活化後, 以 5 mg/ml 添加至膠原蛋白基質中, 進一步以冷凍乾燥的方式使基質回復至乾式的狀態 3
(3) 含高濃度之透明質酸膠原蛋白基質由實驗室中初步細胞培養的研究結果得知, 透明質酸含量的多寡會對細胞的活性產生不同的影響 因此在傷口癒合的實驗中, 提高透明質酸於基質中的含量是另一個重要的實驗條件, 取上一個步驟所製備之含透明質酸的膠原蛋白基質, 在進行基質植入手術前再以濃度為 5 mg/ml 的透明質酸水溶液充分浸潤, 作為實驗的一組基質 (4) 含 bfgf 與透明質酸之膠原蛋白基質同樣取第二種含透明質酸之膠原蛋白基質, 當基質植入手術完成時, 以注射方式打入適當劑量 bfgf 於基質中, 使膠原蛋白基質同時含有透明質酸與 bfgf 實驗中將同樣以注射的方式進行追加 bfgf 劑量的工作, 於手術後第 3 天進行 2. 各種膠原蛋白基質的孔洞結構分析將所製備之膠原蛋白基質以及含透明質酸之膠原蛋白基質, 經掃描式電子顯微鏡分析表層孔洞的通透性 ; 進一步製備成病理切片, 經染色處理觀察並定量各種基質中孔洞的大小與分布的情形 3. 動物傷口癒合模式的建立 (1) 傷口製備天竺鼠進行腹腔注射 ketamine-hcl (45mg/kg) 及 combelen (0.1ml/kg) 之全身麻醉, 在其背部剃除毛髮, 並以碘酒 75% 酒精擦拭消毒, 並以 lidocaine 局部麻醉 於背部製作 4 個 1.5cm 1.5cm 大小之全深度傷口 以生理食鹽水簡單清洗, 分別覆蓋上不同組成之膠原蛋白基質, 其中包括商品化產品 Integra 作為比較, 並以手術縫線固定之 貼上透氣貼布 Tegaderm 後, 於特定組別含透明質酸之膠原白基質中以注射方式給予 bfgf 實驗中以開放性傷口 (open wound) 作為對照組, 不操作覆蓋基質與縫合之工作 手術後之天竺鼠皆單獨飼養, 且每日有負責同學觀察照顧, 並於特定時間下犧牲天竺鼠, 取下背部癒合之傷口組織進行病理觀察 (2) 傷口表面癒合觀察在進行基質植入手術完成後, 每天描繪傷口的面積直至傷口完全閉合為止, 並詳細觀察紀錄傷口復原的情形 利用透明袋描繪傷口, 以影像軟體定量傷口的面積, 計算每天的變化量, 以原傷口面積作為 100%, 評估每天傷口癒合面積的百分比變化, 作為傷口癒合的速度的比較 (3) 動物犧牲於基質植入手術後第 6 天 第 12 天 第 24 天 第 120 天以及一年, 將天竺鼠犧牲取得各種植入基質之傷口部位的組織 所取得之樣本以冷凍切片的方式進行病理切片的製作, 作為本計畫第一部份免疫化學染色的分析樣品, 以探討各種基質影響癒後的情況 4. 癒合組織的外觀型態與結構分析取第 12 天 第 24 天與第 120 天的傷口皮膚製作組織切片並以病理染色, 如 H&E 免疫化學或免疫螢光染色, 來觀察與分析厚度 上皮新生 細胞增生活性等情況 5. 血管新生程度的評估由於本研究所製造的全深度傷口需藉由周遭結締組織細胞的移入 增生, 並分泌細胞外基質, 方可重新塑造新生的組織 ; 而此過程需仰賴足夠的養分供給, 因此血管新生作用是主要的關鍵 透明質酸與第二型纖維母細胞生長因子均具有促進血管新生的效果, 故針對癒合組織內新生血管的管徑大小 血管密度 管腔結構完整性, 以及血管成 4
熟度進行一系列分析 五 結果與討論 由圖一觀察到 PCM-AH-bFGF bfgf 與 PCM-AH 三組與 open control 組在傷口閉 合的觀察上, 其閉合速度相當接近, 而 Integra 組卻有延緩癒合現象 傷口癒合初期的基質中細胞增生之比較的結果 ( 圖二 ) 得知, 第 6 天時 PCM-AH-bFGF 與 bfgf 兩組的發炎細胞的細胞密度較高, 恰與文獻中 bfgf 具有吸引 發炎細胞的特性相呼應, 而纖維母細胞的細胞密度則是 PCM-AH-bFGF bfgf 與 PCM-AH 三組較高, 然而三者在第 6 天還看不出太大差異, 但在第 12 天時, 卻觀察到 bfgf 組的纖維母細胞密度最高, 比較第 6 天將近增加為 3 倍左右, 其次為 open control 組 此外, 由於 bfgf 對纖維母細胞有促進增生的作用, 因此 bfgf 組的纖維母細胞密 度高於 open control 組 ; 在傷口表面收縮的數據當中, 收縮程度最小的是 Integra 組, 正巧 Integra 的細胞密度也都是最低, 而圖二在 Integra 組的人工基質中也可以明顯觀察到 移入的細胞數目並不多,PCM-AH-bFGF PCM-AH 兩組的纖維母細胞密度不論第 6 12 天皆無明顯之差異, 而且兩者的傷口收縮程度也相近, 這雖然也可指出傷口收縮與細 胞密度有關係, 但卻不知道為何添加 bfgf 看不出對纖維母細胞增生的促進作用 從圖四右圖可以看出第 12 24 天 PCM-AH-bFGF PCM-AH 與 bfgf 三組在厚度上 均有較厚的現象, 表示在纖維增生時期這三組纖維增生的速度有較快的現象, 但卻看不 出 PCM-AH 與 bfgf 共同處理的傷口與 bfgf 以及 PCM-AH 兩組有明顯的差異 圖五是上皮新生的定量,PCM-AH-bFGF PCM-AH 與 Integra 兩組由於有人工基質 的存在使得表皮細胞無法順利遷移上新生皮膚上, 然而 bfgf 組卻可見到相同的情形, 與 open control 組比起來,bFGF 組卻像是有基質在上頭阻擋表皮細胞遷移一般, 若再配 合厚度的比較, 在第 12 天的結果可以看出 open control 組是最薄最不成熟的表皮層, 然 而其他各組看起來卻形成較厚較成熟的表皮於新生皮膚上, 從圖五右第 24 120 天的定 量結果上可以看出表皮層有變厚的現象, 但其中 PCM-AH-bFGF bfgf 與 Integra 三組 在第 120 天卻出現不再增後的趨勢, 然而若要觀察各組表皮是否會恢復到與正常組織相 同的厚度, 可能要觀察更長的時間 從上皮新生的觀察, 並無法下結論去比較各組間的 優劣 在癒合後組織型態的比較上 ( 圖六 ), 發現 PCM-AH-bFGF 組可以看出是最接近正常 皮膚組織的形態, 其次 bfgf 與 PCM-AH 兩組也有接近正常皮膚組織的型態表現, 觀察 Integra 組可見其下層組織鬆散上層組織卻緊密的現象, 而 open control 組卻是全部緊密 的型態, 然而 bfgf 因有促進較佳膠原蛋白排列的結果, 因此 bfgf 組卻不會出現癒合 組織過於緊密的現象 5
120 傷口面積百分比 (%) 110 100 90 80 70 60 50 40 30 20 PCM-AH+bFGF bfgf PCM-AH Integra Open Control 10 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44 46 48 手術後天數 (Days) 圖一 傷口表面癒合情形 PCM-AH-bFGF(n=18) bfgf (n=23) PCM-AH(n=21) Integra (n=15) Open Control(n=9) 於天竺鼠全身度傷口外觀癒合結果 A1 A2 B1 B2 C1 C2 D1 D2 E1 E2 圖二 傷口癒合初期, 基質中之細胞增生情形 (A)PCM-AH-bFGF;(B)bFGF; (C)PCM-AH;(D)Integra ;(E)open control 左欄 A1 至 E1 為各組第 6 天的癒合組織中基質內的細胞增生情形, 右欄為各組第 12 天的癒合組織中基質內的細胞增生 6
情形 塑膠切片經 H&E 染色, 在顯微鏡下以數位影像擷取系統連續照相疊圖而成, bar 為 100μm 圖三 第 12 天傷口血管新生情形 (A)PCM-AH-bFGF;(B)bFGF;(C)PCM-AH; (D)Integra ;(E)open control H&E 染色 200 倍倍率擷取影像,bar 為 100μm 倍數 12 10 8 6 4 2 0 血 管 總 數 血 管 總 面 積 血 管 平 均 面 積 A/E B/E C/E D/E E/E 基質種纇 新生皮膚厚度百分比 (%) 120 100 80 60 40 20 0 PCM-AH+bFGF bfgf PCM-AH Integra Open Control 12 day 24 day 120 day 基質種類 圖四 左圖 : 第十二天傷口血管新生之比較 (A)PCM-AH-bFGF;(B)bFGF;(C) PCM-AH;(D)Integra ;(E)open control 右圖 : 第 12 24 120 天之新生皮膚厚度定量結果 第 12 天 PCM-AH-bFGF(n=6) bfgf(n=6) PCM-AH(n=8) Integra (n=4) Open control(n=3); 第 24 天 PCM-AH-bFGF(n=4) bfgf(n=4) PCM-AH (n=7) Integra(n=5) Open control(n=2); 第 120 天 PCM-AH-bFGF(n=5) bfgf(n=3) PCM-AH(n=3) Integra(n=3) Open control(n=3) 7
上皮移入傷口百分比 (%) 120 100 80 60 40 20 0 PCM-AH + bfgf bfgf PCM-AH Integra open control 12 day 24 day 基質種纇 新生表皮厚度百分比 (%) 250 200 150 100 50 0 12 day 24 day 120 day PCM-AH+bFGF bfgf PCM-AH Integra open Control 基質種纇 圖五 左圖 : 第 12 24 天上皮新生, 上皮移入傷口之距離 右圖 : 圖 3.8 第 12 24 120 天上皮新生之新生表皮厚度定量 第 12 天 PCM-AH-bFGF(n=3) bfgf(n=3) PCM-AH(n=3) Integra(n=3) Open control(n=3); 第 24 天 PCM-AH-bFGF(n=4) bfgf(n=4) PCM-AH(n=7) Integra(n=5) Open control(n=2); 第 120 天 PCM-AH-bFGF(n=3) bfgf(n=3) PCM-AH(n=3) Integra(n=3) Open control (n=3) A B C D E 圖六 第 24 120 天癒合組織型態比較 (A)PCM-AH-bFGF;(B)bFGF;(C)PCM-AH; (D)Integra ;(E)open control 上排為各組第 24 天的癒合組織型態, 下排為各組第 120 天的癒合組織型態 塑膠切片經 H&E 染色,100 倍倍率下以數位影像擷取系統連續照相兩次疊圖而成, 包含圖片左邊正常組織以及右邊之癒合組織,bar 為 100μm 8
六 結果自評 目前商品化的人工皮膚往往在移植後的一段時間, 會進行自體表皮的移植, 而且大 面積燒燙傷的病人, 其自體表皮來源不足, 在使用上也有所限制 隨著組織工程愈來愈 受重視, 在基質中培養纖維母細胞及表皮細胞也成為一股新的浪潮, 目的是希望細胞在 基質中會進行生長及分泌胞外基質, 進而製造出類似皮膚環境的表皮及真皮替代物 目 前這樣的技術已有不錯的發展, 甚至已經可以在實驗室中, 在基質表面培養出具有不同 結構部位的表皮層, 這雖然是一大突破, 但是實際應用在動物體上, 卻發現仍有所不足, 主要是因為含細胞的人工皮膚因缺乏血管運輸基質中細胞所需要的養分, 且因為厚度的 關係, 使得養分不易藉由擴散作用供給基質中的細胞, 導致所培養的表皮及真皮細胞在 移植到人體後的存活受到考驗 本研究使用了 bfgf, 於結果顯示,PCM-AH 添加入 bfgf 後有相當明顯促進血管新生之作用, 對於傷口癒合的促進與品質也有良好的效果 七 參考文獻 1. Martin, P., Wound healing--aiming for perfect skin regeneration. Science, 1997. 276(5309): p. 75-81. 2. Servold, S.A., Growth factor impact on wound healing. Clin Podiatr Med Surg, 1991. 8(4): p. 937-53. 3. Johnston, D.E., Wound healing in skin. Vet Clin North Am Small Anim Pract, 1990. 20(1): p. 1-25. 4. Kirsner, R.S. and W.H. Eaglstein, The wound healing process. Dermatol Clin, 1993. 11(4): p. 629-40. 5. Druecke, D., et al., Modulation of scar tissue formation using different dermal regeneration templates in the treatment of experimental full-thickness wounds. Wound Repair Regen, 2004. 12(5): p. 518-27. 6. Yang, G.P., et al., From scarless fetal wounds to keloids: molecular studies in wound healing. Wound Repair Regen, 2003. 11(6): p. 411-8. 7. Arnold, F. and D.C. West, Angiogenesis in wound healing. Pharmacol Ther, 1991. 52(3): p. 407-22. 8. Tonnesen, M.G., X. Feng, and R.A. Clark, Angiogenesis in wound healing. J Investig Dermatol Symp Proc, 2000. 5(1): p. 40-6. 9. Kurita, Y., et al., Immunohistochemical localization of basic fibroblast growth factor in wound healing sites of mouse skin. Arch Dermatol Res, 1992. 284(4): p. 193-7. 10. Li, J., Y.P. Zhang, and R.S. Kirsner, Angiogenesis in wound repair: angiogenic growth factors and the extracellular matrix. Microsc Res Tech, 2003. 60(1): p. 107-14. 11. Battegay, E.J., Angiogenesis: mechanistic insights, neovascular diseases, and therapeutic prospects. J Mol Med, 1995. 73(7): p. 333-46. 12. Brown, L.F., et al., Vascular permeability factor/vascular endothelial growth factor: a multifunctional angiogenic cytokine. Exs, 1997. 79: p. 233-69. 13. Gerwins, P., E. Skoldenberg, and L. Claesson-Welsh, Function of fibroblast growth factors and vascular endothelial growth factors and their receptors in angiogenesis. Crit Rev Oncol Hematol, 2000. 34(3): p. 185-94. 14. Nugent, M.A. and R.V. Iozzo, Fibroblast growth factor-2. Int J Biochem Cell Biol, 2000. 32(2): p. 115-20. 15. Benharroch, D. and D. Birnbaum, Biology of the fibroblast growth factor gene family. Isr J Med Sci, 1990. 26(4): p. 212-9. 16. Baird, A. and P.A. Walicke, Fibroblast growth factors. Br Med Bull, 1989. 45(2): p. 438-52. 17. Besser, D., M. Presta, and Y. Nagamine, Elucidation of a signaling pathway induced by FGF-2 leading to upa gene expression in NIH 3T3 fibroblasts. Cell Growth Differ, 1995. 9
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