204-0-25 DOI: 0.3724/SP.J.45.204.0025 苏云金芽胞杆菌 BRC-ZLL5 类细菌素的抑菌谱和理化特性 黄天培 吴小凤 3 潘洁茹 2 蒋捷 肖颖 张灵玲 关雄 福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室福州 350002 2 福州市疾病预防控制中心福州 350004 3 泉州市疾病预防控制中心泉州 36208 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol 204,20 ( 5 ) : 779-784 摘要为提升苏云金芽胞杆菌 (Bacillus thuringiensis, 简称 Bt) 生物农药产品附加值, 通过对其发酵上清液提取细菌素, 进一步研究 Bt 菌株 BRC-ZLL5 类细菌素 (Bacteriocin-like inhibitory substances,blis) 的抑菌谱和理化特性. 结果显示 :BRC-ZLL5 类细菌素对李斯特菌 铜绿假单胞杆菌 粪链球菌具有活性, 对 4 种肠道益生菌及自身无抗菌活性 ; 抑菌活性动态监测表明其活性集中于 6-8 h, 在 2 h 达到最大值 ; 分子量 (M r ) 小于.43 0 4 ; 具有较广的 ph 耐受范围 (ph 3-9) 和较强的耐热能力 (50-90 时活性极显著提高 ;2 高压灭菌 5 min 仍保持 32% 活性 ); 脂肪酶 Ⅱ 可极显著提高其活性 (P < 0.0), 蛋白酶 K α 胰凝乳蛋白酶 Ⅶ α 胰凝乳蛋白酶 Ⅱ 使其活性消失 (P < 0.0). BRC-ZLL5 类细菌素可望用于进一步开发, 本研究为高效利用 Bt 发酵上清液提供了依据. 图 4 表 参 27 关键词细菌素 ; 苏云金芽胞杆菌 ; 抑菌谱 ; 理化特性 CLC S476 Antibacterial spectrum and physiochemical property of bacteriocin-like inhibitory substances from Bacillus thuringiensis BRC-ZLL5 HUANG Tianpei, WU Xiaofeng 3, PAN Jieru 2, JIANG Jie, XIAO Ying, ZHANG Lingling & GUAN Xiong Key Laboratory of Biopesticide and Chemical Biology, Ministry of Education, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou 350002, China 2 Fuzhou Center for Disease Control and Prevention, Fuzhou 350004, China 3 Quanzhou Center for Disease Control and Prevention, Quanzhou 36208, China Abstract To add value to Bacillus thuringiensis (Bt) products, extraction of bacteriocins from Bt fermentation supernatants is needed. This paper aimed to study the extraction methods and the property of Bt bacteriocin-like inhibitory substances (BLIS). In this study, antibacterial spectrum and physiochemical property of Bt BRC-ZLL5 BLIS were investigated using Listeria monocytogenes (Lm) as one of the indicator strains. The results showed that BRC-ZLL5 BLIS were active against Listeria, Pseudomonas aeruginosa and Streptococcus faecalis, but not against itself and 4 probiotics. The activity of BRC-ZLL5 BLIS against Lm 00525 existed for 6-8 h after incubation, peaking at 2 h after incubation. The molecular weight (M r ) of BRC- ZLL5 BLIS was less than.43 0 4. The BRC-ZLL5 BLIS were ph stable (ph 3-9) and heat-resistant: compared with that at 4 C, the activity of BRC-ZLL5 BLIS was significantly increased after treatment at 50-90 C for 30 min; it retained 32% activity after treatment at 2 C for 5 min. The antibacterial activity of BRC-ZLL5 BLIS was increased with addition of lipase II (P < 0.0) while completely lost after treatment with proteinase K, α-chymotrypsin VII and α-chymotrypsin II (P < 0.0). This study provides a model for utilization of Bt fermentation supernatants with high efficiency. Keywords bacteriocin; Bacillus thuringiensis; antibacterial spectrum; physiochemical property 单核细胞增生李斯特菌 (Listeria monocytohenes, 简称 收稿日期 Received: 204-0-4 接受日期 Accepted: 204-04-08 十二五 农村领域国家科技计划课题 (20AA0A203) 国家自然科学基金项目 (320574,307745) 和福建省教育厅高校领军人才项目 (k80202a) 资助 Supported by the National Science and Technology Project of the Twelfth Five-Year-Plan for the Rural Development in China (20AA0A203), the National Natural Science Foundation of China (320574, 307745), and the Leading Talents of Fujian Province Colleges (k80202a) 通讯作者 Corresponding author (E-mail: guanxfafu@26.com) Lm) 为人畜共患病原细菌, 是一种常见的引起畜禽肉和水产品污染的重要致病菌 [-2]. 受该菌感染引起的疾病, 临床死亡率极高, 可达 30%-70% [3]. 食源性李斯特菌虽未在我国暴发和流行, 但已有 Lm 引起孕妇发病从而导致围产儿死亡的案例报道, 以及 Lm 造成的脑膜炎和新生儿败血症等事件 [4]. 目前控制 Lm 常见的方法之一是在食品中添加防腐剂. 近年来, 细菌素 (Bacteriocin) 等生物防腐剂成为食品科学研究领域中的一个热点 [5]. 细菌素是由某些细菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的一类具有生物活性的多肽或蛋白质类物质.
780 苏云金芽胞杆菌 BRC-ZLL5 类细菌素的抑菌谱和理化特性 5 期 对于序列未知的细菌素或部分提纯的细菌素也常用类细菌素 (Bacteriocin-like inhibitory substances, 简称 BLIS) 的说法来代替 [6-7] [6]. 细菌素主要分为 4 大类 : 第 I 类是含有羊毛硫氨酸硫醚的一般小于.0 0 4 的细菌素 ; 第 II 类是不含电荷的球形分子 ; 第 Ⅲ 类是分子量 (M r ) 大于 3 0 4 的蛋白质 ; 第 Ⅳ 类是具有脂类或碳水化合物成分结构的细菌素. 每类的结构相似度很小, 全新结构的细菌素仍不断被发现. 在一般的情况下, 革兰氏阳性细菌产生的细菌素只可抑制革兰氏阳性菌的生长, 但也有某些特殊的细菌素, 如乳酸链球菌素 (Nisin) 对许多革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有抑菌活性 [8-9]. 目前, 乳酸链球菌素已被批准作为食品防腐剂, 广泛应用于食品工业中 [8]. 苏云金芽胞杆菌 (Bacillus thuringiensis, 简称 Bt) 是广泛应用的微生物杀虫剂 [0-]. 在工业化发酵生产 Bt 生物农药时, 生产企业主要利用其菌体沉淀制成产品, 对发酵上清液则进行无害化处理后废弃. 这不仅造成资源浪费, 也提高了生物农药的生产成本. 近年来研究发现 Bt 的发酵上清液也存在细菌素, 亦称为 苏云金菌素 (Thuricin) [2]. 这为高效利用 Bt 发酵上清液以提升生物农药产品附加值提供了新的契机. 潘洁茹等与本实验室合作, 从 Bt 墨西哥分离株 4AJ 得到分子量约为 6.5 0 3 的类细菌素, 其在 80 时仍有活性, 在 ph 值 6-9 时保持活性稳定 [0]. 本研究则拟以具有自主知识产权的 Bt BRC-ZLL5 为出发菌, 分离新的类细菌素, 明确其对 Lm 等肠道病原细菌的抑菌谱和对 4 种肠道益生菌的安全性, 研究其理化特性, 旨在为高效利用 Bt 发酵上清液提供参考依据. 材料与方法. 菌种与培养基.. 菌株 Bt 菌株 BRC-ZLL5 保存于福建农林大学生物农 药与化学生物学教育部重点实验室. 49 株肠道病原菌保存于 福州市疾病预防控制中心 ( 表 ). 肠道益生菌保加利亚乳杆 菌 GIMI.80 嗜酸乳杆菌 GIMI.208 购自广东省微生物研究所 微生物菌种保藏中心 ; 肠道益生菌婴儿双歧杆菌 CICC6069 两歧双歧杆菌 CICC607 购自广州环凯微生物科技有限公司...2 培养基 LB 液体培养基 (ρ/g L - ): 胰蛋白胨 0, 酵母提 取物 5, 氯化钠 0,pH 7.0-7.2. 2% LB 固体培养基 (ρ/g L - ): 在 LB 液体培养基中加入琼脂 20. TSB 液体培养基 (ρ/g L - ): 胰 蛋白胨大豆肉汤培养基粉末 (BD 公司 )30,pH 7.0-7.3. 0.7% 或.5%TSA 固体培养基 (ρ/g L - ): 在 TSB 液体培养基中添加琼脂 7 或 5,pH 7.3..2 方法.2. 试剂硫酸铵和十二烷基硫酸钠购自国药集团化学 试剂有限公司. 溶菌酶 RNA 酶 胰蛋白酶 蛋白酶 K α- 淀 粉酶 脂肪酶 -Ⅱ 脂肪酶 -Ⅶ 过氧化氢酶 α- 胰凝乳蛋白酶 -Ⅱ α- 胰凝乳蛋白酶 -Ⅶ 购自 Sigma-Aldrich 公司..2.2 BRC-ZLL5 类细菌素对李斯特菌活性和对益生菌安 全性测定采用琼脂打孔药剂扩散法 (Agar-well diffusion method) 测定 Bt BRC-ZLL5 类细菌素对 Lm 等李斯特菌菌株的 活性, 并进一步测定 Bt 对供试 4 种益生菌的安全性. 个活性单位 (U) 等于 mm 2 抑菌圈面积 ( 扣除打孔产生的面积 ) [3]..2.3 BRC-ZLL5 类细菌素的发酵曲线测定从培养 0 h 开始, 表 供试病原细菌 Table Pathogenic bacteria used in this study 性质 Characteristics 革兰氏阳性菌 G + 革兰氏阴性菌 G - 单核细胞增生李斯特菌 Listeria monocytogenes (Lm) 种类 Species 菌株名称 Strain name 090, 097, 00522, 00525, 00526, ATCC 533, CMCC 54004 培养条件 Incubation condition 西尔李斯特菌 Listeria seeligeri (Ls) 0052 英诺克李斯特菌 Listeria inoccua (Lin) 00523 绵羊李斯特菌 Listeria ivanovii (Liv) 00524 蜡样芽孢杆菌 Bacillus cereus (Bc) 0938, ATCC 0987 粪链球菌 Enterococcus faecali a, c 尿肠球菌 Enterococcus urinary b, d 屎肠球菌 Enterococcus faecium ATCC 27270 藤黄微球菌 Micrococcus luteus a 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus ATCC 25923, ATCC 2923, 080202 表皮葡萄球菌 Staphylococcus epidermidis CMCC(B) 26069 大肠杆菌 Escherichia coli ATCC 0536, ATCC 8739, ATCC 25922, O57:H7, K88, K2, 739 沙门氏菌 Salmonella W09094, 090022, 090023, 090024, 肠炎沙门氏菌 a 丙型伤寒菌 a 肠炎沙门氏菌 ATCC 3076 鼠伤寒沙门氏菌 ATCC 33 奇异变形杆菌 Proteus mirabilis a 铜绿假单胞杆菌 Pseudomonas aeruginosa ATCC 5442, ATCC 9027 小肠结肠炎耶尔森氏菌 Yersinia enterocolitica a 志贺氏菌 Shigella 宋氏志贺氏菌 CMCC(B) 5592 福氏志贺氏菌 ATCC 2022 痢疾志贺氏菌 CMCC 5252 副溶血性弧菌 Vibrio parahaemolyticus ATCC 7802, CMCC 7202 创伤弧菌 Vibrio vulnificus ATCC 27562 阪崎肠杆菌 Enterobacter sakazakii ATCC 5329, ATCC 25944 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol
20 卷黄天培等 78 每 2 h 取样, 每次取 2 份. 一份样品用于测定其 D 600 nm, 监测菌 株生长情况 ; 另一份样品取上清液, 将其 ph 调至 6.8, 排除产酸的干扰, 并用 0.22 µm 细菌过滤器过滤, 测定其抑菌活性. 实验重复 3 次..2.4 BRC-ZLL5 类细菌素部分纯化将 Bt 菌株 BRC-ZLL5 于 250 ml TSB 培养基中培养至类细菌素活性最高时, 利用 20%- 00% 的硫酸铵进行分级沉淀得到类细菌素沉淀, 溶解于 0. mol/l ph 7.0 磷酸缓冲液, 制成抗菌液 [3], 检测抗菌活性. 实验重复 3 次..2.5 凝胶原位检测分析 BRC-ZLL5 类细菌素分子量将 70% 硫酸铵沉降的 BRC-ZLL5 类细菌素进行 Tricine-SDS-PAGE 电泳. 将凝胶切成 2 份, 份用于染色, 另外 份先浸泡于含有 25% 异丙醇和 0% 乙酸的溶液中, 洗涤 2 h 以洗去凝胶中的 SDS, 再浸泡于 % 曲拉通溶液中 30 min, 然后用无菌水润洗 24 h, 每 4 h 更换一次水, 最后转移至无菌培养皿中, 用无菌滤纸吸干胶条附近的水分, 覆盖上一层 20 ml 含有 80 µl Lm 的 0.7% TSA 固体培养基. 30 静置培养 2 h, 观察抑菌条带位置, 分析类细菌素大小..2.6 BRC-ZLL5 类细菌素抑菌谱以 52 株肠道病原细菌 7 株标准 Bt 菌株和 BRC-ZLL5 为供试菌株, 将 70% 硫酸铵沉降的 BRC-ZLL5 类细菌素进行抗菌活性检测..2.7 BRC-ZLL5 类细菌素理化特性 () 将部分纯化的类细 菌素分别溶解于 ph 为 3-6 的 50 mmol/l 柠檬酸缓冲液,pH 为 8-9 的 50 mm Tris-HCl 缓冲液中. 以溶解于 ph 为 7.0 的 50 mmol/ L 磷酸缓冲液中的样品作为对照, 将所有样品于 4 静置 2 h 后, 检测 ph 对类细菌素抑菌活性的影响. (2) 将部分纯化的 类细菌素分别经 40 50 60 70 80 90 和 00 水浴处理 30 min,2 高压加热处理 5 min, 以不处 理的类细菌素作为对照, 检测温度对类细菌素抑菌活性的影 响. (3) 将 α 淀粉酶 脂肪酶 Ⅱ 脂肪酶 Ⅶ RNA 酶 溶菌酶 过氧化氢酶 胰蛋白酶 蛋白酶 K α 胰凝乳蛋白酶 Ⅱ 和 α 胰凝 乳蛋白酶 Ⅶ 配成 00 mg/ml 浓度的母液, 然后分别加入到部 分纯化的类细菌素中至终质量浓度 mg/ml. 以不加酶的溶 解于 0. mol/l 磷酸缓冲液中 (ph 7.0) 的部分纯化的类细菌素 作为空白对照 CK; 以等量的 0. mol/l 磷酸缓冲液 (ph 7.0) 作为空白对照 CK2; 以溶解于 0. mol/l 磷酸缓冲液 (ph 7.0) 的上述酶类作为空白对照 CK3. 分别将以上配置好的样品放 于 37 水浴中保温 2 h, 检测酶对类细菌素抑菌活性的影响. 上述实验均重复 3 次..2.8 统计学分析试验结果求标准差与方差, 计算 SEM 和 LSD. 2 结果与分析 2. Bt BRC-ZLL5 类细菌素对李斯特菌的活性和益生菌的安全性为初步了解 Bt BRC-ZLL5 类细菌素的抑菌谱并明确其对人类肠道益生菌的安全性以利于安全用药, 以 0 株供试李斯特菌 ( 表 ) 和 4 种供试益生菌为靶标测定 Bt 菌株 BRC- ZLL5 的类细菌素活性. 结果表明,BRC-ZLL5 类细菌素对 Lm 00525 Lm 097 Lm 00522 Ls 0052 Lin00523 和 Liv 00524 的活性 ( 图 ) 分别为 85.40 U 79.42 U 04.85 U 226.83 U 29.64 U 和 68.96 U, 对保加利亚乳杆菌 GIMI.80 嗜酸乳杆菌 GIMI.208 两歧双歧杆菌 CICC6067 和婴儿双歧杆菌 CICC6069 共 4 种益生菌无活性 (0 U). 因此,BRC-ZLL5 类细菌素对 Lm 等李斯特菌有较好活性, 对 4 种肠道益生菌是安全的. 这有利于 BRC-ZLL5 类细菌素在杀灭李斯特等肠道有害菌的同时, 维护肠道益生菌菌群的稳定. 2.2 Bt BRC-ZLL5 类细菌素的抑菌活性动态抑菌活性动态监测结果表明,BRC-ZLL5 在 0-2 h 处于指数生长期, 其产生的类细菌素对 Lm 00525 的抗菌活性也逐渐增强, 在 2 h 时活性达到最大值 (60 U), 而在 2-24 h,bt 菌株 BRC-ZLL5 仍在缓慢生长, 但其抗菌活性却急剧下降, 至 23 h 时已经完全失去活性. 培养至 27 h 开始,Bt 菌株已进入稳定期, 但其抗菌活性也已消失, 不再恢复 ( 图 2). 活性的丧失可能是发酵后期 Bt 菌株本身产生的蛋白酶对类细菌素有一定降解作用, 从而引起发酵液的抑菌活性下降. 2.3 Bt BRC-ZLL5 类细菌素的部分纯化和分子量大小分析将 Bt 菌株 BRC-ZLL5 培养至类细菌素活性最高时期 (2 h), 用 20%-00% 的饱和硫酸铵进行纯化. 结果显示用 50% 饱和硫酸铵沉降类细菌素最好 : 与纯化之前相对比,BRC- ZLL5 类细菌素对 Lm 00525 的抗菌活性提高 60%, 由纯化前的 60 U( 图 2) 提高到纯化后的 250 U( 图 3A). Tricine-SDS- PAGE 分析结果表明,BRC-ZLL5 类细菌素为 20%-40% 饱和硫 图 Bt BRC-ZLL5 类细菌素对李斯特菌的抑菌活性. A:Lm 00525;B:Lm 097;C:Lm 00522;D:Ls 0052;E:Lin 00523;F:Liv 00524. 图片中的 CK 代表阴性对照 TSB 培养基,CK2 代表阴性对照 ddh 2 O. Fig. Antibacterial activities of Bt BRC-ZLL5 BLIS against Listeria. (A) Lm 00525; (B) Lm 097; (C) Lm 00522; (D) Ls 0052; (E) Lin 00523; (F) Liv 00524; CK represents negative control TSB medium; CK2 represents negative control ddh 2 O. Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报
782 苏云金芽胞杆菌 BRC-ZLL5 类细菌素的抑菌谱和理化特性 5 期 酸铵沉降后, 所分离的蛋白的条带相对较丰富 蛋白量也相对较多, 说明类细菌素的分离比较完全 ;50%-60% 硫酸铵沉降后蛋白的条带不够清晰, 即分离不完全 ; 而在 70%-00% 时类细菌素的分离比较完全 ( 图 3B). 为了得到尽可能多的类细菌素, 选择 70% 作为 Bt BRC-ZLL5 类细菌素硫酸铵沉降的质量分数. 将 BRC-ZLL5 类细菌素进行凝胶原位活性检测以分析分子量. 结果显示 BRC-ZLL5 类细菌素分子量 (M r ) 小于.43 0 4 ( 图 3C). 图 2 Bt BRC-ZLL5 类细菌素的抑菌活性动态监测. Fig. 2 Dynamics of antibacterial activities of Bt BRC-ZLL5 BLIS. 2.4 BRC-ZLL5 类细菌素抑菌谱测试上述类细菌素对供试除李斯特菌外的 39 株肠道病原细菌 ( 表 ) 及 BRC-ZLL5 自身的活性. 结果表明,BRC- ZLL5 类细菌素对铜绿假单胞杆菌和粪链球菌 a 具有较明显的抑菌效果 (76 U 和 9 U), 对 BRC-ZLL5 自身无抑制作用 (0 U). 这说明 BRC-ZLL5 可产生抑菌谱较窄的类细菌素,BRC- ZLL5 对自身所产类细菌素有免疫作用, 推测可能含有相关免疫基因. 2.5 Bt BRC-ZLL5 类细菌素理化特性 2.5. 类细菌素对 ph 的敏感性以 ph 值 7 时的活性为对照, BRC-ZLL5 类细菌素的 ph 值调整后, 其活性均至少显著上升 (P < 0.05), 其中在 ph5-6 其活性最高 (P < 0.0). 这表明 BRC-ZLL5 类细菌素在弱酸 中性和碱性中都具有较好的稳定性, 具有较广的 ph 耐受范围 (ph3-9)( 图 4A). 此外, 调酸 调碱都使 BRC-ZLL5 类细菌素活性提高的原因有待于利用结构生物学等手段进一步研究. 2.5.2 类细菌素对温度的敏感性 Bt BRC-ZLL5 类细菌素分别经 40 50 60 70 80 90 和 00 处理 30 min 或 2 处理 5 min 后, 检测活性. 结果表明, 经 50-90 处理时, 其活性较对照组极显著提高 (P < 0.0), 可能温度导致类细菌素的三级结构发生改变 ; 在 2 其抗菌活性出现极显著下降 (P < 0.0), 但仍保持了 32% 活性 ; 经 40 和 00 处理后的活性与 4 时的样品无显著差异 (P > 0.0)( 图 4B). 因此,BRC-ZLL5 类细菌素在 40-00 时活性保持稳定, 具有较好的耐热能力. 2.5.3 类细菌素对酶的敏感性 BRC-ZLL5 类细菌素经 α- 淀粉酶 RNA 酶 胰蛋白酶 3 种酶分别处理后, 其活性变化不明显 (P > 0.0); 经脂肪酶 -Ⅱ 处理后其活性极显著提高 (P < 0.0); 经 RNA 酶处理后, 活性极显著降低 (P < 0.0); 经脂肪酶 Ⅶ 和过氧化氢酶处理后, 活性显著降低 (P < 0.05); 用 图 3 Bt BRC-ZLL5 类细菌素的部分纯化和分子量大小分析. A: 不同浓度硫酸铵沉降的 Bt BRC-ZLL5 类细菌素活性. B: 不同浓度硫酸铵沉降的 Bt BRC-ZLL5 类细菌素 Tricine-SDS-PAGE 电泳 ;M:New England Biolabs 宽范围蛋白 marker(22 0 3 58.0 0 3 6.0 0 3 97.2 0 3 66.4 0 3 55.6 0 3 42.7 0 3 34.6 0 3 27.0 0 3 20.0 0 3 4.3 0 3 6.5 0 3 3.4 0 3 2.3 0 3 );-9:20%-00% 硫酸铵溶液沉降的类细菌素. C:Bt BRC-ZLL5 类细菌素的凝胶原位检测 ;:70% 硫酸铵沉降的 Bt BRC-ZLL5 的类细菌素 ;2: 凝胶原位检测类细菌素对 Lm 00525 的抗菌活性以分析类细菌素分子量大小 ;M:TaKaRa 低分子量蛋白 marker(200 0 3 6 0 3 97.2 0 3 66.4 0 3 44.3 0 3 29.0 0 3 20. 0 3 4.3 0 3 ). Fig. 3 Partial purification of BRC-ZLL5 BLIS and analysis of molecular weight. (A) Activities of Bt BRC-ZLL5 BLIS extracted with ammonium sulfate fractionation; (B) Tricine-SDS-PAGE of Bt BRC-ZLL5 BLIS extracted with ammonium sulfate fractionation; M: New England Biolabs protein marker (22 0 3, 58.0 0 3, 6.0 0 3, 97.2 0 3, 66.4 0 3, 55.6 0 3, 42.7 0 3, 34.6 0 3, 27.0 0 3, 20.0 0 3, 4.3 0 3, 6.5 0 3, 3.4 0 3, 2.3 0 3 ); -9 represent Bt BRC-ZLL5 BLIS extracted with 20% - 00% ammonium sulfate, respectively; (C) Determination of molecular weight of BRC-ZLL5 BLIS with direct detection of bacteriocin activity in polyacrylamide gel; represents Bt BRC-ZLL5 BLIS extracted with 70% ammonium sulfate; 2 is a duplicate of covered with TSB agar containing Lm 00525 to detect the molecular weight of BRC-ZLL5 BLIS; M: TaKaRa protein marker (200 0 3, 6 0 3, 97.2 0 3, 66.4 0 3, 44.3 0 3, 29.0 0 3, 20. 0 3, 4.3 0 3 ). 蛋白酶 K α- 胰凝乳蛋白酶 -Ⅶ α- 胰凝乳蛋白酶 -Ⅱ 处理后, 其活性消失 (P < 0.0)( 图 4C). 蛋白酶 K 是一种切割活性较 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol
20 卷黄天培等 783 /U) 600 500 400 (A) /U) 600 500 400 (B) /U) 600 500 400 (C) Activity 300 200 Activity 300 200 Activity 300 200 00 00 00 0 7 3 4 5 6 8 9 ph 0 4 40 50 60 70 80 90 00 2 C 0 CK CK2 CK3 2 3 4 5 6 7 8 9 0 Enzyme 图 4 部分纯化的 BRC-ZLL5 类细菌素理化特性. A B C 分别代表 ph 值 温度和酶对 BRC-ZLL5 类细菌素活性的影响 ; 图 C 的 -0 代表 α- 淀粉酶 脂肪酶 Ⅶ 脂肪酶 Ⅱ RNA 酶 溶菌酶 过氧化氢酶 胰蛋白酶 蛋白酶 K α- 胰凝乳蛋白酶 Ⅶ α- 胰凝乳蛋白酶 Ⅱ;CK 为不加酶的溶解于 0. mol/l 磷酸缓冲液 (ph 7.0) 中的部分纯化的类细菌素阳性对照 ;CK2 为 0. mol/l 磷酸缓冲液 (ph 7.0) 阴性对照 ;CK3 为溶解于 0. mol/l 磷酸缓冲液 (ph 7.0) 的上述 0 种酶类阴性对照. 分别以 A 图中的 ph 7 条件 B 图中的 4 条件和 C 图的 CK 为参照条件, 各图柱形上方的 和 分别代表 LSD 方差分析结果为极显著差异 (P < 0.0) 或显著差异 (P < 0.05). Fig. 4 Physiochemical property of BRC-ZLL5 BLIS. (A), (B) and (C) represent the effects of ph value, temperature and enzyme on the activity of BRC-ZLL5 BLIS. -0 in Fig. 4(C) represent α-amylase, lipase VII, lipase II, RNase, lysozyme, catalase, trypsin, proteinase K, α-chymotrypsin VII and α-chymotrypsin II, respectively. CK-3 in Fig. 4(C) are controls: CK is the BRC-ZLL5 BLIS dissolved in 0. mol/l PBS; CK2 is 0. mol/l PBS; CK3 is the 0 above enzymes dissolved in 0. mol/l PBS. Compared with the conditions of ph 7 in Fig. 4(A), 4 ºC in Fig. 4(B) and CK in Fig. 4(C), the and above the columns of other samples indicate extremely significant differences by LSD (P < 0.0) and significant differences by LSD (P < 0.05), respectively. 广的丝氨酸蛋白酶, 它能切割脂族氨基酸和芳香族氨基酸的羧基端肽键. 胰凝乳蛋白酶是一种催化蛋白质肽键水解的内肽酶, 它的主要功能就是裂解肽键, 并且具有很强的专一性, 只会裂解芳香氨族氨基酸如苯丙氨酸 (Phe) 和酪氨酸 (Tyr) 羧基侧链, 说明 BRC-ZLL5 类细菌素含有芳香族氨基酸. 此外, 类细菌素活性受脂肪酶影响, 说明其活性结构可能含有甘油三酯的酯键. 3 讨论与结论 3. Bt 细菌素的分类目前, 已知 ( 部分 ) 氨基酸序列 Bt 细菌素均属于第二类 细菌素中不含羊毛硫氨酸的小于 0 0 3 的肽, 如 Thuricin S Bacthuricin F4 Thurincin H Thuricin 7 和 Thuricin CD [4-6]. 其中,Thurincin H Thurincin 7 和 Thuricin CD 具有完整的序 列信息 [6, 5-7]. 根据目前分类系统, 序列未知的分子量分别为.0 0 4.2 0 4.2 0 4 和. 0 4 的 Bt 细菌素 Tochicin Thuricin 7 Entomocidus HD9 和 Bacthuricin F03 等被称为类 细菌素 [8-2]. 本研究得到的细菌素分子量小于.43 0 4, 在明 确其序列前, 也称为类细菌素. 3.2 Bt 细菌素的抑菌谱 Bt 细菌素一般具有窄谱抑菌活性 : 类细菌素 Tochicin Thuricin 439 Bacthuricin F4 和 Bacthuricin F03 只能抑制 Bt 和 蜡质芽胞杆菌 (Bacillus cereus,bc) [8, 20-22] ;Thuricin H 能抑 制 Bc F4552 的生长 [23]. 细菌素 Thuricin CD 对主要对肉毒梭菌 有活性 [6]. 有些 Bt 类细菌素则有较宽的抑菌谱 : 如类细菌素 Thuricin 7 对 Bt Bc 化脓性链球菌 (Streptococcus Pyogenes) 和 Lm 有抗菌效果 [9] ; 类细菌素 Entomocidus HD9 能够抑制 Lm 致病性绿脓假单胞杆菌 (Pseudomonas aeruginosa) 和 少数真菌, 对人类细胞 Vero 无毒性 [50] ;Entomocin 0 主要对 Lm 幼虫芽孢杆菌 (Paenibacillus larvae) 起作用 [25]. 细菌素 Thuricin 7 会抑制 Bc ATCC 4579 和大肠杆菌 MM 294 的生 长 [26-27]. 而 BRC-ZLL5 的类细菌素除能抑制多种李斯特菌, 还 能抑制铜绿假单胞杆菌和粪链球菌. 3.3 Bt 细菌素的理化特性 Bt 细菌素的活性主要受 ph 值 温度和酶的影响 :() 细 菌素一般比较耐受 ph - [6]. BRC-ZLL5 类细菌素的 ph 耐受 范围在 ph 3-9, 与类细菌素 tochicin 一样 [8] ;( 2) 细菌素一般比 较耐热. 在 80 时, 类细菌素 Thuricin 439 Bacthuricin F03 和 4AJ 保留其活性 [0, 20-2]. Tochicin 在 90 仍保留活性, 但经 00 处理 30 min 失去活性 [8]. 大部分 Bt 细菌素在 00 处理 后仍保留部分活性, 但 20 处理 5 min 失去活性 [6, 26], 但也有 像 Entomocidus HD9 这样耐热性较强的, 在 20 处理后仍保 留 70% 活性 [24]. BRC-ZLL5 类细菌素经 2 处理仍具有 32% 活性 ;(3) 由于细菌素具有蛋白质特性, 因而在经过胃蛋白酶 胰蛋白酶等消化酶处理后, 有些细菌素的抑菌活性可能会有 不同程度的下降. 这表明某些细菌素可能无法直接适应胃肠 道的环境, 需先经过预处理才能使用 [9]. Tochicin Thuricin 7 Entomocidus HD9 Thuricin 7 等大部分 Bt 细菌素经蛋白酶 K 处理后丧失活性 [6, 8-9, 24, 26]. BRC-ZLL5 类细菌素经蛋白酶 K α 胰凝乳蛋白酶 Ⅶ α 胰凝乳蛋白酶 Ⅱ 处理后也会丧失活性, 但脂 肪酶 Ⅱ 可极显著提高其活性, 其机理有待深入研究. 本研究已分离纯化得到 Bt BRC-ZLL5 类细菌素, 明确了 其抑菌谱和理化特性, 后续还需要得到细菌素纯品, 并开展 大量深入研究以获得其基因信息, 解析其三维结构, 并运用 化学合成和生物合成等技术, 实现细菌素的大量合成或定向 改造, 以利于工厂化生产或增强其抑菌活性. Chin J Appl Environ Biol 应用与环境生物学报
784 苏云金芽胞杆菌 BRC-ZLL5 类细菌素的抑菌谱和理化特性 5 期 参考文献 [References] 何冬梅, 邓峰, 赖蔚苳, 严纪文, 宋曼丹, 朱海明, 柯昌文, 马聪. 单核细胞增生李斯特菌生物学研究进展 [J]. 华南预防医学, 2006, 32 (6): 26-29 [He DM, Deng F, Lai WB, Yan JW, Song MD, Zhu HM, Ke QW, Ma C. Advances on Listeria monocytogenes biology [J]. South China J Prev Med, 2006, 32 (6): 26-29] 2 宋爱莉, 杨左光. 奇特的单增李斯特茵 [J]. 航空航天医药, 200, 2 (3): 364-365 [Song AL, Yang ZG. Specific Listeria monocytogenes[j]. Aerospace Med, 200, 2 (3): 364-365] 3 Mclauchlin J, Mitchellb RT, Smerdon WJ, Jewell K. Listeria monocytogenes and listeriosis: a review of hazard characterisation for use in microbiological risk assessment of foods [J]. Int Food Microbiol, 2004, 92 (): 5-33 4 黄愈玲, 何晖, 李秀珍, 何洁仪, 肖扬, 丛黎达. 食品中李斯特菌污染状况调查 [J]. 疾病监测, 2005, 20 (7): 359-36 [Huang YL, He H, Li XZ, He JY, Xiao Y, Cong LD. Investigation of food contamination caused by Listeria in foods [J]. Dis Surveil, 2005, 20 (7): 359-36] 5 王凤芹, 刘芳, 徐为民, 王道营. 细菌素在食品保鲜中的研究进展 [J]. 内蒙古农业科技, 200 (3): 7-72 [Wang FQ, Liu F, Xu WM, Wang DY. Research development of bacteriocins in food preservation [J]. Inner Mongolia Agric Sci Technol, 200 (3): 7-72] 6 Abriouel H, Frane CM, Omar NB, Gálvez A. Diversity and applications of Bacillus bacteriocins [J]. FEMS Microbiol Rev, 20, 35 (): 20-232 7 尚雅婧, 张日俊. 细菌素应用的理论与实践 [J]. 中国畜牧兽医, 200, 37 (5): 26-29 [Shang YQ, Zhang RJ. Theory and practice on the appl ication of bacteriocins [J]. China Anim Husband Vet Med, 200, 37 (5): 26-29] 8 吴清平, 黄静敏, 张菊梅, 莫树平. 细菌素的合成与作用机制 [J]. 微生物学通报, 200, 37 (0): 59-524 [Wu QP, Huang JM, Zhang JM, Mo SP. Biosynthesis of bacteriocins and its mechanism of action [J]. Microbiol China, 200, 37 (0): 59-524] 9 谢建华, 吴锦瑞, 张日俊. 细菌素的生物学特性 作用机理和应用 [J]. 饲料工业, 2009, 30 (6): -5 [Xie JH, Wu JR, Zhang RJ. Biology, mode of action and application of bacteriocins [J]. Feed Ind, 2009, 30 (6): -5] 0 潘洁茹, 肖颖, 张巧铃, 李丽芬, 刘秀峰, 叶海梅, 黄天培, 郑能雄. 苏云金芽孢杆菌 4AJ 细菌素对单增李斯特菌的活性研究 [J]. 中华微生物学和免疫学杂志, 202, 32 (5): 408-409 [Pan JR, Xiao Y, Zhang QL, Li LL, Liu XF, Ye HM, Huang TP, Zheng NX. Activity of Bacillus thuringiensis 4AJ bacteriocin against Listeria monocytogenes [J]. Chin J Microbiol Immun, 202, 32 (5): 408-409] 黄天培, 张巧铃, 潘洁茹, 苏新华, 肖颖, 赖小华, 郭杨菁, 杨晓伟, 康榕, 关雄. 高效还原铬的苏云金芽胞杆菌菌株筛选 [J]. 应用与环境生物学报, 200, 6 (6): 879-882 [Huang TP, Zhang QL, Pan JR, Su XH, Xiao Y, Lai XH, Guo YJ, Yang XW, Kang R, Guan X. Screening of Bacillus thuringiensis with high chromium reducing capacity [J]. Chin J Appl Environ Microbiol, 200, 6 (6): 879-882] 2 Favret ME, Yousten AA. Thuricin: the bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis [J]. J Invertebr Pathol, 989, 53 (2): 206-26 3 Barboza-Corona JE, Vazquez-Acosta H, Salcedo-Hernández R. Bacteriocin-like inhibitor substances produced by Mexican strains of Bacillus thuringiensis [J]. Arch Microbiol, 2007, 87 (2): 7 26 4 Chehimi S, Delalande F, Sable S, Hajlaoui MR, Van Dorsselaer A, Limam F, Pons AM. Purification and partial aminoacid sequence of thuricin S, a new anti-listeria bacteriocin from Bacillus thuringiensis [J]. Can J Microbiol, 2007, 53 (2): 284-290 5 Lee H, Churey JJ, Worobo RW. Biosynthesis and transcriptional analysis of thurincin H, a tandem repeated bacteriocin geneticlocus, produced by Bacillus thuringiensis SF36 [J]. FEMS Microbiol Lett, 2009, 299 (2): 205-23 6 Rea MC, Sit CS, Clayton E, O Connor PM, Whittal RM, Zheng J, Vederas JC, Ross RP, Hill C. Thuricin CD, a posttranslationally modified bacteriocin with a narrow spectrum of activity against Clostridium difficile [J]. Proc Nat Acad Sci, 200, 07: 9352-9357 7 Joerger MC, Klaenhammer TR. Cloning, expression, and nucleotide sequence of the Lactobacillus helveticus 48 gene encoding the bacteriocin helveticin J [J]. J Bacteriol, 990, 72: 6339 6347 8 Paik HD, Bae SS, Park SH, Pan JG. Identification and partial characterization of tochicin, a bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis subsp tochigiensis [J]. J Ind Microbiol Biotech, 997, 9 (4): 294-298 9 Cherif A, Ouzari H, Daffonchio D, Cherif K, Slama B, Hassen A, Jaoua S, Boudabous A. Thuricin 7: a novel bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis BMG.7, a new strain isolated from soil [J]. Lett Appl Microbiol, 200, 32 (4): 243-247 20 Melissa A, Saskia V, Douwe S. Isolation and characterisation of a novel bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis strain B439 [J]. FEMS Microbiol Lett, 2003, 220 (): 27-3 2 Kamoun F, Fguira IB, Belguith NB, Mejdoub H, Lereclus D, Jaoua S. Purification and characterization of a new Bacillus thuringiensis bacteriocin active against Listeria monocytogenes, Bacillus cereus and Agrobacterium tumefaciens [J]. Appl Biochem Biotech, 20, 65 (): 300-34 22 Kamoun F, Mejdoub H, Aouissaoui H, Reinbolt J, Hammami A, Jaoua S. Purification, amino acid sequence and characterization of Bacthuricin F4, a new bacteriocin produced by Bacillus thuringiensis [J]. J Appl Microbiol, 2005, 98 (4): 88-888 23 Kamoun F, Zouari N, Saadaoui I, Jaoua S. Improvement of Bacillus thuringiensis bacteriocin production through culture conditions optimization [J]. Prep Biochem Biotech, 2009, 39 (4): 400-42 24 Cherif A, Chehimi S, Limem F, Hansen B, Hendriksen N, Daffonchio D, Boudabous A. Detection and characterization of the novel bacteriocin entomocin9, and safety evaluation of its producer, Bacillus thuringiensis ssp. entomocidus HD9 [J]. J Appl Microbiol, 2003, 95 (5): 990-000 25 Cherif A, Rezgui W, RaddadibN, Daffonchio D, Boudabous A. Characterization and partial purification of entomocin 0, a newly identified bacteriocin from Bacillus thuringiensis subsp. entomocidus HD0 [J]. Microbiol Res, 2008, 63 (6): 684-692 26 Gray EJ, Lee KD, Souleimanov AM, Di Falco MR, Zhou X, Ly A, Charles TC, Driscoll BT, Smith DL. A novel bacteriocin, thuricin 7, produced by plantgrowth promoting rhizobacteria strain Bacillus thuringiensis NEB7: isolation and classification [J]. J Appl Microbiol, 2006, 00 (3): 545-554 27 Lee KD, Gray EJ, Mabood F, Jung WJ, Charles T, Clark SR, Ly A, Souleimanov A, Zhou X, Smith DL. The class IId bacteriocin thuricin 7 increases plant growth [J]. Planta, 2009, 229 (4): 747-755 应用与环境生物学报 Chin J Appl Environ Biol