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1 中国医药生物技术 21 年 8 月第 5 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 21, Vol. 5, No DOI:1.3969/cmba.j.issn X 论著角质细胞生长因子对 1C6 细胞和 4C18 细胞的促增殖作用张卫星, 刘彦隆, 于洋, 龚琦, 李校堃, 林绍强摘要目的观察角质细胞生长因子 (KGF) 对胸腺上皮来源 1C6 细胞和 4C18 细胞的促增殖作用方法鼠胸腺上皮髓质和皮质来源的 1C6 细胞 4C18 细胞和鼠腹腔巨噬细胞来源的 RAW 细胞, 分别经含不同浓度 ( ng/ml) 的 KGF 和不含 KGF 的完全培养液 ( 对照组 ) 作用和 72 h, 采用噻唑蓝 (MTT) 法测定细胞增殖率, 并绘制细胞增殖率曲线结果 MTT 法检测显示, 在低浓度 (< 2 ng/ml) 时, 1C6 细胞增殖率随 KGF 浓度增加不断升高 ;KGF 浓度为 2 ng/ml 时,1C6 细胞增殖率达最高值 ; 在高浓度 (> 2 ng/ml) 时,1C6 细胞增殖率随 KGF 浓度的增加逐渐下降 ; 与对照组比较, 浓度为 ng/ml 的 KGF 分别作用和 72 h 对 1C6 细胞均具有明显的促增殖作用 ( 均 P <.5) 在低浓度(< 1 ng/ml) 时, 4C18 细胞增殖率随 KGF 浓度增加不断升高 ;KGF 浓度为 1 ng/ml 时,4C18 细胞增殖率达最高值 ; 在高浓度 (> 1 ng/ml) 时,4C18 细胞增殖率随 KGF 浓度的增加逐渐下降 ; 与对照组比较, 浓度为 ng/ml 的 KGF 分别作用和 72 h 对 4C18 细胞均具有明显的促增殖作用 ( 均 P <.5) 但不同浓度的 KGF 对 RAW 细胞均未见促增殖作用结论 KGF 对胸腺上皮来源的 1C6 细胞和 4C18 细胞均具有明显的促增殖作用关键词成纤维细胞生长因子 7; 细胞增殖 ; 动物实验 ; 1C6 细胞 ; 4C18 细胞中国医药生物技术, 21, 5(4): 角质细胞生长因子 (keratinocyte growth factor, KGF) 又称成纤维细胞生长因子 7, 属于成纤维细胞生长因子家族, 是从人胚胎肺成纤维细胞培养上清中分离纯化获得的一种相对分子质量为 26 ~ 28 的单链多肽, 这种细胞因子具有促进小鼠角质细胞有丝分裂的作用, 因此被命名为角质细胞生长因子随后的一系列研究证明这种细胞因子的靶细胞为上皮细胞, 分泌细胞为各种来源的间质细胞, 其作用是促进上皮细胞的增殖和生长近年来的研究表明,KGF 具有广泛的生物学活性, 能促进多种细胞中 DNA 的合成, 与多种组织器官的形成和发育有关, 在胃肠 [1] 口腔黏膜 [2] 胸腺 [3] [4] 肺等多种器官的损伤修复中发挥重要作用在胚胎胸腺器官培养实验中,KGF 可诱导胸腺上皮祖细胞和成熟胸腺上皮细胞增殖 [5] ; 胚胎期 KGF 受体缺失小鼠由于胸腺上皮细胞缺乏增殖和分化能力而表现出明显的胸腺生成障碍 [6] 最近有报道称, KGF 可以明显促进老龄鼠萎缩胸腺的增生 [7], 同时 KGF 也可以促进正常小鼠胸腺和接受骨髓移植后小鼠胸腺的增生 [3] 研究表明 KGF 主要通过与胸腺上皮细胞表面的 KGF 受体结合而促进胸腺上皮细胞增殖, 最终导致胸腺增生但由于胸腺上皮细胞较难分离及其在体外存活时间较短, 因此 KGF 促胸腺上皮细胞增殖的分子机制以及信号途径尚不清楚 1C6 细胞和 4C18 细胞分别是鼠胸腺上皮髓质和皮质来源的细胞系, 在此我们拟利用体外细胞培养方法观察 KGF 对 1C6 细胞和 4C18 细胞的促增殖作用, 为探求 KGF 促胸腺增殖的分子机制提供参考 1 材料与方法 1.1 材料细胞系鼠胸腺上皮髓质来源的 1C6 细胞皮质来源的 4C18 细胞和鼠腹腔巨噬细胞来源的 RAW 细胞均由中国科学院动物研究所提供 1. 试剂 KGF 由吉林农业大学提供 ;DMEM 培养基购自美国 Gibco 公司 ; 噻唑蓝 (MTT) 购自北京赛百盛生物工程公司 ; 二甲基亚砜 (DMSO) 基金项目 : 国家高技术研究发展计划 (863 计划 )(27AA2Z11); 浙江省新苗人才计划 (28R4G2953) 作者单位 :32535 温州医学院药学院 ( 张卫星刘彦隆龚琦李校堃林绍强 );453 郑州, 河南省人民医院乳腺甲状腺外科 ( 于洋 ) 通讯作者 : 林绍强, shaotsiang@163.com 收稿日期 :

2 268 中国医药生物技术 21 年 8 月第 5 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 21, Vol. 5, No. 4 和牛血清白蛋白 (BSA) 购自美国 Sigma 公司 ; 1% 胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司方法.1 体外细胞培养将 1C6 细胞 4C18 细胞和 RAW 细胞分别置于 DMEM 培养液 ( 含 1% 胎牛血清 1 U/ml 青霉素 1 U/ml 链霉素 ) 中, 在 37 5% CO 2 饱和湿度的孵箱中培养, 2 ~ 3 d 传代 1 次.2 细胞增殖活性测定采用 MTT 法测定细胞增殖活性实验分 KGF 处理组和对照组, 每组各设 4 个复孔分别将 1C6 细胞 4C18 细胞和 RAW 细胞以 / 孔的密度接种于 96 孔板, 待细胞贴壁后,KGF 处理组分别加入含 ng/ml KGF 的完全培养液 2 μl, 对照组加入不含 KGF 的完全培养液 2 μl; 同时以加入 2 μl 完全培养液作为空白孔各组细胞经不同处理后分别继续培养和 72 h, 培养结束后每孔加入 2 μl MTT(5 mg/ml) 继续培养 4 h 吸弃培养上清液, 每孔加入 2 μl DMSO, 振荡 1 min, 使蓝紫色结晶充分溶解, 在酶标仪上测定各孔波长 492 nm 处吸光度 (A) 值按下列公式计算细胞增殖率 : 细胞增殖率 (%)=( 实验孔平均 A 值 - 对照孔平均 A 值 )/ 对照孔平均 A 值 1%, 并绘制细胞增殖率曲线 1.3 统计学处理应用 SPSS13. 统计学软件进行数据处理, 实验组与对照组检测结果的比较采用 Student s t 检验, 以 P <.5 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 KGF 对 1C6 细胞的促增殖作用不同浓度 ( ng/ml) 的 KGF 分别作用 1C6 细胞 24 h( 图 1A) 48 h ( 图 1B) 和 72 h( 图 1C),MTT 法测定 A 492 值并绘制细胞增殖率曲线, 结果显示在低浓度 A C B 图 1 不同浓度 ( ng/ml)kgf 作用不同时间对 1C6 细胞的促增殖作用 (A: 不同浓度 KGF 作用 1C6 细胞 24 h;b: 不同浓度 KGF 作用 1C6 细胞 48 h;c: 不同浓度 KGF 作用 1C6 细胞 72 h) Figure 1 Proliferative effect on 1C6 cells affected by different concentrations of KGF (25, 5, 1, 2, 4, 8 ng/ml) for different time. A: 1C6 cells were affected by 24 h; B: 1C6 cells were affected by 48 h; C: 1C6 cells were affected by 72 h.

3 中国医药生物技术 21 年 8 月第 5 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 21, Vol. 5, No A 图 2 不同浓度 ( ng/ml)kgf 作用不同时间 B C 对 4C18 细胞的促增殖作用 (A: 不同浓度 KGF 作用 4C18 细胞 24 h;b: 不同浓度 KGF 作用 4C18 细胞 48 h; C: 不同浓度 KGF 作用 4C18 细胞 72 h) Figure 2 Proliferative effect on 4C18 cells affected by different concentrations of KGF (25, 5, 1, 2, 4, 8 ng/ml) for different time. A: 4C18 cells were affected by different concentrations of KGF for 24 h; B: 4C18 cells were affected by 48 h; C: 4C18 cells were affected by 72 h. (< 2 ng/ml) 时, 细胞增殖率随 KGF 浓度的增加不断升高 ; 当 KGF 浓度为 2 ng/ml 时, 细胞增殖率达到最高值 ; 而在高浓度 (> 2 ng/ml) 时, 细胞增殖率随 KGF 浓度的增加又逐渐下降与对照组比较, 浓度为 ng/ml 的 KGF 分别作用和 72 h 对 1C6 细胞均具有明显的促增殖作用 ( 均 P <.5) 2.2 KGF 对 4C18 细胞的促增殖作用不同浓度 ( ng/ml) 的 KGF 分别作用 4C18 细胞 24 h( 图 2A) 48 h ( 图 2B) 和 72 h( 图 2C),MTT 法测定 A 492 值并绘制细胞增殖率曲线, 结果显示在低浓度 (< 1 ng/ml) 时, 细胞增殖率随 KGF 浓度的增加不断升高 ; 当 KGF 浓度为 1 ng/ml 时, 细胞增殖率达到最高值 ; 而在高浓度 (> 1 ng/ml) 时, 细胞增殖率随 KGF 浓度的增加又逐渐下降与对照组比较, 浓度为 ng/ml 的 KGF 分别作用和 72 h 对 4C18 细胞均具有明显的促增殖作用 ( 均 P <.5) 2.3 KGF 对 RAW 细胞的促增殖作用不同浓度 ( ng/ml) 的 KGF 分别作用 RAW 细胞和 72 h, MTT 法测定 A 492 值并绘制细胞增殖率曲线, 结果显示 KGF 对 RAW 细胞均无明显促增殖作用 3 讨论 KGF 作为一种有丝分裂原能特异性地促进上皮细胞的增殖和分化 [8], 本实验结果证明 KGF 对胸腺上皮髓质和皮质来源的 1C6 细胞和 4C18 细胞均具有明显的促增殖作用有研究报道,KGF 主要通过与胸腺上皮细胞表面 KGF 受体的结合而促进老龄鼠萎缩胸腺以及理化因素所致小鼠萎缩

4 27 中国医药生物技术 21 年 8 月第 5 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 21, Vol. 5, No. 4 [7, 胸腺的增生 9] 胸腺上皮构成了胸腺细胞赖以生存的微环境, 是 T 细胞发育和成熟的主要场所, 为骨髓来源的胸腺前体细胞提供了足够的生存空间, 因此胸腺上皮细胞的增生, 扩大了 T 细胞的生存环境, 促进胸腺细胞生成增加, 导致胸腺的增生 [1] 但是由于胸腺上皮细胞分离技术尚未成熟及其体外生存时间很短, 所以至今为止 KGF 与 KGF 受体信号途径对胸腺促增殖作用的具体机制, 以及该途径中上游或下游的作用因子尚未阐明本实验结果表明 KGF 对胸腺上皮髓质和皮质来源的 1C6 细胞和 4C18 细胞均具有明显的促增殖作用, 但是对腹腔巨噬细胞来源的 RAW 细胞无促增殖作用, 表明 KGF 可特异性对 1C6 和 4C18 细胞发挥促增殖作用这将为下一步探讨 KGF 促进胸腺增生的分子机制和信号途径提供可能性参考文献 [1] Johansson JE, Hasséus B, Johansson P, et al. Gut protection by palifermin during autologous haematopoietic SCT. Bone Marrow Transplant, 29, 43(1): [2] Beaven AW, Shea TC. Recombinant human keratinocyte growth factor palifermin reduces oral mucositis and improves patient outcomes after stem cell transplant. Drugs Today (Barc), 27, 43(7): [3] Rossi SW, Jeker LT, Ueno T, et al. Keratinocyte growth factor (KGF) enhances postnatal T-cell development via enhancements in proliferation and function of thymic epithelial cells. Blood, 27, 19(9): [4] Sadovski J, Kuchenbuch T, Ruppert C, et al. Keratinocyte growth factor prevents intra-alveolar oedema in experimental lung isografts. Eur Respir J, 28, 31(1): [5] Berzins SP, Uldrich AP, Sutherland JS, et al. Thymic regeneration: teaching an old immune system new tricks. Trends Mol Med, 22, 8(1): [6] Revest JM, Suniara RK, Kerr K, et al. Development of the thymus requires signaling through the fibroblast growth factor receptor R2-IIIb. J Immunol, 21, 167(4): [7] Min D, Panoskaltsis-Mortari A, Kuro-O M, et al. Sustained thymopoiesis and improvement in functional immunity induced by exogenous KGF administration in murine models of aging. Blood, 27, 19(6): [8] Loprinzi CL, Martenson JA. Martenson, Keratinocyte growth factor: not yet ready for prime time. J Clin Oncol, 23, 21(8): [9] Alpdogan O, Hubbard VM, Smith OM, et al. Keratinocyte growth factor (KGF) is required for postnatal thymic regeneration. Blood, 26, 17(6): [1] Zhang L, Sun L, Zhao Y. Thymic epithelial progenitor cells and thymus regeneration: an update. Cell Res, 27, 17(1):5-55. Proliferative effect of keratinocyte growth factor on 1C6 cells and 4C18 cells ZHANG Wei-xing, LIU Yan-long, YU Yang, GONG Qi, LI Xiao-kun, LIN Shao-qiang Abstract Objective To observe proliferative effect of keratinocyte growth factor (KGF) on 1C6 cells and 4C18 cells originated from thymic epithelial cell. Methods 1C6 cells and 4C18 cells originated from the medulla and cortex of mouse thymic epithelial, and RAW cells from mouse peritoneal macrophage were cultured in complete culture medium with different concentrations (25, 5, 1, 2, 4, 8 ng/ml) of KGF and without KGF (control group) for 24, 48 and 72 h respectively, and cell proliferation rate was analyzed by MTT assay, at the same time proliferation curves were made. Results MTT assay showed that when KGF concentration was less than 2 ng/ml, the proliferation rate of 1C6 cells increased as the concentration raising, when KGF concentration was 2 ng/ml, the proliferation rate of 1C6 cells reached the peak value, and when KGF concentration was more than 2 ng/ml, the proliferation rate of 1C6 cells decreased gradually as the concentration declining. Compared with the control group respectively, the proliferative effects on 1C6 cells affected by concentrations of 1, 2, 4 ng/ml of KGF for 24, 48 and 72 h were obvious (all P <.5). When KGF concentration was less than 1 ng/ml, the proliferation rate of 4C18 cells increased as the concentration raising, when KGF concentration was 1 ng/ml, the proliferation rate of 4C18 cells reached the peak value, and when KGF concentration was more than 1 ng/ml, the proliferation rate of 4C18 cells decreased gradually as the concentration declining. Compared with the control group respectively, the proliferative effects on 4C18 cells affected by concentrations of 5, 1, 2 and 4 ng/ml of KGF for 24, 48 and 72 h were obvious (all P <.5). But different concentration of KGF had no proliferation effect on RAW cells. Conclusion KGF could promote the proliferation of 1C6 cells and 4C18 cells originated from thymic epithelial cells. Key words Fibroblast growth factor 7; Ceu proliferation; Animal experimentation; 1C6 cell ; 4C18 cell

5 中国医药生物技术 21 年 8 月第 5 卷第 4 期 Chin Med Biotechnol, August 21, Vol. 5, No Author Affiliations: School of Pharmaceutical Science, Wenzhou Medical College, Wenzhou, China (ZHANG Wei-xing, LIU Yan-long, GONG Qi, LI Xiao-kun, LIN Shao-qiang); Surgery Department of Breast and Thyroid, Henan Provincial, 453 Zhengzhou, China (YU Yang) Correspongding Author: LIN Shao-qiang, shaotsiang@163.com Chin Med Biotechnol, 21, 5(4): 我国基因治疗 II 型糖尿病研究取得进展行业动态在日前举行的世博会荷兰生命科学周基因治疗专题研讨会上, 生物芯片上海国家工程研究中心滕晓坤博士所作的利用重新构建的葡萄糖激酶基因单点突变异构体对 Ⅱ 型糖尿病进行的基因治疗的研发成果报告引起中外研究者的广泛关注据国际糖尿病联盟推算, 全球糖尿病患者已近 2.5 亿人, 且以每年 1% 以上的速度递增 Ⅱ 型糖尿病 (T2DM) 被称作危及人类的世纪恶魔, 其危害性及蔓延的严重性为世人所知为此, 世界卫生组织已把糖尿病列为世界三大重大疾病之一, 并纳入全球高科技攻关项目滕晓坤博士自 26 年承担了杭州一元生物技术有限公司突变性葡萄糖激酶基因治疗 Ⅱ 型糖尿病实验课题后, 不断取得阶段性成果在所公布的动物实验数据中, 使用基因药物后, 血糖得到迅速控制和下降直至正常, 在 11 个月内没有出现反弹, 研究团队据此对基因治疗提出了整体激活的新概念传统的基因治疗机制多半是局限在目标细胞局部, 而滕晓坤等开展的此项用基因治疗 Ⅱ 型糖尿病研究, 是通过修复并激活胰岛发挥作用环节中的关键基因, 从而从源头上起到长久的符合人体生理状态的治疗效果专家认为, 这个项目改变了基因治疗常用的局部用药方法, 转而采用全身用药, 这是对糖尿病基因治疗的一大突破目前, 这一项目已进入中试后期阶段药效学有效治疗剂量定量工作已大部分完成, 并正在进入药理毒理的关键实验中, 这些工作完成后即进入申报临床实验阶段据了解, 生物芯片上海国家工程研究中心围绕以芯片技术作为核心的系统全面的生物学技术, 在全球范围内承接基因组学蛋白组学临床诊断和药物研发的研究和服务工作, 已先后和辉瑞默克强生礼来等多家国际跨国制药公司达成委托服务业务, 技术和质控水准得到国际一流企业的认可杭州一元生物技术有限公司董事长黄海东表示, 今年 1 月 6 日, 基因治疗 Ⅱ 型糖尿病的发明已申请了国际专利, 这表明我国在此项技术领域已处于世界领先地位研发这个新型生物制剂的目的, 就是要改变全球治疗 Ⅱ 型糖尿病只能依赖化合物药和替代依赖胰岛素治疗的现状目前, 科研人员正争分夺秒, 严格按国家规定加快研发步伐, 希望此项成果尽快造福于糖尿病患者

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5-25袁宏钧.indd 第 24 卷第 5 期 2015 年 5 月碘 131 doi:10.3978/j.issn.1005-6947.2015.05.005 http://dx.doi.org/10.3978/j.issn.1005-6947.2015.05.005 Chinese Journal of General Surgery, 2015, 24(5):643 647. Chinese Journal of