第2 期 王朋云 莆田后海养殖牡蛎的形态学观察和分子鉴定 分子鉴定 101 制备条件相同 样本活体低温保存带回中国海洋大学海洋生 采 用 电 泳 方 法 对 牡 蛎 消 化 腺 组 织 中 的 IDH 物遗传学与基因资源利用实验室 立即解剖取牡 (异柠檬酸脱氢酶 和 S O D (过

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1 第 35卷第2 期 福建水产 2013 年 4 月 Vol. 35 No. 2 Journal of Fujian Fisheries Apr 文 章 编 号 : (2013) 莆田后海养殖牡蛎的形态学观察和分子鉴定 王朋云 (莆田市水产技术推广站 福 建 莆 田 ) 摘 要 对从莆田后海采集的人工养殖牡蛎群体样本进行数量性状分析 运 用 16S r R N A 和 C O I 条形码 技术进行分子鉴定 并 进 行 I D H 和 S O D 同エ酶电泳分析 結 果 表 明 后海 的 常 见 养 殖 牡 蛎 贝 壳 形 状 多 变 品种为葡萄牙牡蛎而非僧帽牡蛎 不同个体的同エ酶电泳结果显示为单态 关键词 后 海 牡 蛎 形态特 征 分子鉴 定 同エ酶 中图分类号 S917.4 文献标识码 A 牡 贩 (Ostreidae ) 属 软 体 动 物 门 Mollus 有诸多争议和不确定性 严重阻碍了该地区牡蛎 ca) 双 壳 纲 Bivalvia ) 翼 形 亚 纲 Pteriomor- 的种质标准制定 优新品系的遗传改良选育和养 phia ) 牡 贩 目 Ostreoida ) 牡 贩 总 科 Os- 殖的可持续性发展 本研究通过记录主要的可量 treoidea) 其地理分布广泛 是全球各临海国家 化形态性状指标 采 用 D N A 条形码检测技术进 重要的海水养殖品种之 一 中国是世界上牡蛎产 行分子鉴定 进行同エ酶电泳分析生化遗传学特 量最大的国家 福建地区牡顿养殖由来已久 其 征 其結果可为后海牡蜗种质资源的确认 保护 育苗 养殖面积和产量居均全国之首 和开发利用等提供基础参考依据 牡蛎的贝壳形态易受栖息环境的影响 外部 形态差异很大 给牡蛎的形态分类鉴定工作带来 一定的难度 随 着 D N A 分 子 标 记 技 术 同エ酶 1 材料与方法 材料 1. 1 电泳方法的开发和应用 传统的形态分类学手段 实验用牡蛎是 年秋季分批采自福建省 与分子生物学技术的结合板大地提髙了牡顿物种 莆 田 市 后 海 垦 区 养 殖 区 为海区半人工采苗养 鉴定的准确性 解决了牡蛎分类的难题[2] 殖 每批 随 机 取 150个活体样本 经牡顿养殖户 莆 田 后 海 位 于 兴 化 湾 内 西 南 岸 地处东经 初步判别为3 ~ 4 月 龄 贝 暂养于莆田市平海僧 '~ ',北 纬 25 17': ~ 25 19' 总面 帽牡蛎原种场 积 h m 2, 其 中 海 水 养 殖 面 积 h m 是莆田规模最大的围垦工程和海产品养殖区 方法 形态观察 以往后海常见的牡蛎分类趋向于被认定为 僧帽 用海水轻柔地清洗附在牡顿外壳的泥沙 对 牡蛎 ( Saccostrea cucullata)或 葡萄牙牡贩 ( Cras- 其主要可量化的性状指标进行测定和描迷 测量 sostrea angulata) 但由于缺乏相关科学依据支持 工具为游标卡尺 每 个 指 标 的 测 量 个 数 在 3 0 枚 后海牡蛎的种类 生态分布和生物多祥性一直存 以上 收 稿 日 期 作者简 介 王 朋 云 ) 男 硕 士 助理工程师 主要从事水产养殖和病害防治研究. E - mail ronghua_15@ vanoo. com. en

2 第2 期 王朋云 莆田后海养殖牡蛎的形态学观察和分子鉴定 分子鉴定 101 制备条件相同 样本活体低温保存带回中国海洋大学海洋生 采 用 电 泳 方 法 对 牡 蛎 消 化 腺 组 织 中 的 IDH 物遗传学与基因资源利用实验室 立即解剖取牡 (异柠檬酸脱氢酶 和 S O D (过氧 化 物 歧 化 酶 蛎的新鲜肌肉组织 经こ醇固定后冷藏备用 采 2 种同エ酶进行分析[3 4],电 泳 结 束 后 在 特 定 酶 用蛋白酶K 消化和酚氯仿法提取牡蛎基因组 染 液 中 37て恒温染色[5 7] 经 D D W 漂 洗 醋酸 DNA0 固定后拍照分析 W] 根 据 NCBI GenBank数据库中已公布的牡蛎 序列设计引物扩增牡蛎的 16S i R N A, C O I 基因 序 列 所 用 引 物 由 上 海 英 俊 Invitrogen) 生物 技 术 有 限 公 司 合 成 16SF (5 - TCGCCTGTTT A T C A A A A A C A T S R ( 5 - C C G G T C T - 2 结果 2. 1 形态观察 后海养殖牡蛎的贝壳形状多祥 壳较薄 左 壳 固 着 较 大 凹 陷 较 深 鱗 片 粗 大 右壳较 平 鱗片同心环生 呈波纹状排列 无明显放射 G A A C T C A G A T C A C G T - 3 C O IF (5 - GGT- 肋 壳面颜色多变 通常呈淡黄色 杂有黑色或 CAACAATCATAAAGATATTGG-3 C O I R (5 - T A A A C T T C A G G G T G A C C A A A A A A T C A 紫褐色条纹 壳 内 面 白 色 图 1) 外套膜透明 边缘呈黒色 左 右 2 片 属 ニ 孔 型 鳃 左 右 各 1 P C R 扩 增 条 件 94て 预 变 性 5 1^1!; 94T 变性1 对 共 4 片 min, 55 C退火 1 min, 72て延伸 2 min 30 个循 环 延 伸 5 min P C R 扩增 产 物 经 1. 0 % 琼脂糖凝胶电泳 溴 化 乙 锭 E B ) 染色后紫外灯下分別选取单一目 的条带切胶回收 回 收 采 用 O M E G A 凝胶回收试 剂 盒 ( Gel Extraction Kit) 用 T4 D N A 连接酶将 目 标 片 段 連 接 到 质 粒 载 体 PMD18 - T 上 转人 E.coli D H 5 a, 由北京六合华大基因科技股份有 图1 Fig. 1 后海常见牡蛎的形态学特征 M o rp h o lo g ica l c h a ra c te ris tic s o f th e cu ltu re d o y s te r fro m th e H ou ha i B ay 限公司测序 测 序 结 果 采 用 NCBI blastn在线程序进行核 酸序列同源性分析 多序列对位分析采用Clustal X package, 采 用 M E G A 4 ( N J ) 进行系统进化 測 量 结 果 显 示 所 采 后 海 牡 蛎 样 本 的 壳 长 ( L ) 为 壳 高 H ) 的 倍 左壳较右壳 大 在壳长 ~ c m 壳高 ~ c m 体 重 W ) ~ g 肉重 0.94 ~ 树 构 建 Kimura 2 - parameter计 算 遗 传 距 离 值 g 条件 下 壳高壳长关系式为H = (重 复 次 计 算 bootstrap值 L (R2 = ), 体 重 壳 长 关 系 式 为 W 同エ酶电泳 牡蛎活体运送至中国海洋大学实验室后立即 解剖取其消化腺组织 用磷酸缓冲液清洗后放人 = e L ( R 2 = ), 由 关 系 式 的 R 2 值可知后海牡蛎个体间的贝壳形状变化极大 2. 2 分子鉴定 E P 管 内 取 3 0 个 体 密 封 放 入 - 80て超低温冰 P C R 成 功 地 从 后 海 牡 蛎 样 本 中 扩 增 出 16S 箱保存备用 称 取 0.2 g 组 织 样 品 加入预冷的 r R N A 和 C O I 基因的单ー目的条带 扩增产物经 缓 冲 液 冰 浴 匀 浆 1:5, W / V 0. 1 mol/l Tris - 测 序 拼 接 后 分 子 量 分 别 为 16S r R N A 基 因 532 HC1, p H 7.0, p - 巯 基 乙 醇 含 量 0. 1% ) 转人 E P 管内置于4 1 冰 箱 中 抽 提 1 h 然后在冷冻离 心机中 4 C r/min) 离心 15 min 取上 清液分装置- 2 0 T 保存备用 所有样品统ー处理 bp C O I 基 因 681 b p, 将 序 列 向 GenBank公共 核 算 数 据 库 提 交 获 得 登 录 号 为 KC KC 采 用 NCBI blastn在线程序进行核酸 序 列 同 源 性 捜 索 结 果 显 示 后 海 牡 蛎 的 16S

3 102 福 建 水 产 第 3 5 卷 r R N A 和 C O I 基 因 序 列 与 葡 萄 牙 牡 蛎 (Cras- sostrea angu lata) 的 相 关 序 列 相 似 性 极 高, 其 中 16S r R N A 基 因 序 列 相 似 性 为 99_ 62 %, C O I 基 因 序 列 相 似 性 为 %, 表 明 后 海 养 殖 的 牡 蛎 品 种 为 葡 萄 牙 牡 蛎 而 非 僧 帽 牡 蛎, 且 与 数 据 库 中 已 知 的 品 种 存 在 遗 传 差 异 1 6 S r R N A 和 C O I 基 因 序 列 去 除 引 物 后, 与 GenBank 中 僧 帽 牡 蜗 有 明 巨 牡 顿 ( Crassostrea ariakensis) 香 港 巨 牡 贩 ( Crassostrea hongkon- gensis 岩 牡 烦 ( Crassostrea nippona 熊 本 牡 烦 ( Crassostrea sikamea) ^ 葡 萄 牙 牡 贩 和 太 平 洋 牡 鹏 (Crassostrea gigas) 的 相 关 序 列 分 别 进 行 遗 传 距 离 和 序 列 相 似 性 分 析, 采 用 邻 接 法 构 建 系 統 发 育 树 后 海 牡 蛎 的 16S r R N A 序 列 KC 与 僧 帽 牡 蛎 的 序 列 AF ( type A, Hongkong) AF (type D, Hongkong) 和 AF ( Broome, Western Australia) 明 显 属 于 两 个 不 同 的 簇 群, 表 明 后 海 牡 蛎 与 僧 帽 牡 蛎 的 亲 缘 关 系 较 远, 遗 传 距 离 值 达 到 和 , 而 与 葡 萄 牙 牡 蛎 的 相 关 序 列 EU ( isolate Cangtaiwh - 9, Taiwan ) FJ 能 够 很 好 地 聚 成 ー 支, 遗 传 距 离 值 为 , 亲 缘 关 系 最 近 ( 图 2); CO I 系 统 树 中,KC 首 先 与 葡 萄 牙 牡 蛎 的 同 源 序 列 HQ ( isolate 13 ) 聚 为 ー 支, 二 者 再 与 EU (isolate Cangtaiwh - 9, Taiwan) 聚 在 ー 个 亚 簇, 支 持 率 99%, 遗 传 距 离 值 分 别 是 , 在 所 选 的 不 同 牡 蛎 属 中, 后 海 牡 蛎 与 葡 萄 牙 牡 蛎 的 亲 缘 关 系 最 近 ( 图 3 ) 2. 3 同 エ 酶 电 泳 后 海 牡 蛎 不 同 个 体 消 化 腺 组 织 中 I D H 的 表 达 存 在 酶 活 性 差 別, 但 没 有 发 现 多 态 位 点, 均 为 3 条 酶 带, 其 泳 动 最 快 的 1 条 酶 带 活 性 较 弱 ( 图 4 - A ) ;S O D 电 泳 结 果 显 示 单 态, 为 1 条 活 性 酶 带, 个 体 间 表 达 量 略 有 差 异, 酶 带 泳 动 迁 移 相 対 较 一 致 ( 图 4 - B ) C.gigas AF C.gigas AF C.gigas EU C. angulata FJ C. angulata EU KC IC. sikamea FJ C. sikamea EU \C. nippona HM C. nippona FJ C. Hongkongensis FJ C. Hongkongensis FJ C. Hongkongensis EU f C. angulata FJ LC. gulata EU S. cucullata AF cucullata AF r 1~ し S. S- s- cucullata AF F ig.2 h 0.02 图 2 基 于 16S r R N A 基 因 序 列 的 系 统 发 育 树 P h y lo g e n e tic tre e b a s e d on 16S rd N A s e q u e n c e s u sin g N e ig h b o r-j o in in g m e th o d

4 第 2 期 王 朋 云 : 莆 田 后 海 养 殖 牡 蛎 的 形 态 学 观 察 和 分 子 鉴 定 o8H -C.gigas AF C.gigas A F C.gigas EU C.angulata EU KC *L C.angulata HQ C. sikamea EU じ.s^ amea AY ^ C. sikamea EU C. ariakensis HQ C. ariakensis EU C. ariakensis EU C. nippona FJ M C. nippona AF C. nippona HM C. hongkongensis FJ C. hongkongensis EU C. hongkongensis FJ F ig.3 ト H 0.02 图 3 用 邻 接 法 重 建 的 基 于 C 〇 I 基 因 序 列 的 系 统 发 育 树 R e s u lt o f N e ig h b o r-j o in in g a n a ly s is tre e b a s e d on C O I re gio n s e q u e n c e s 图 4 后 海 常 见 牡 蛎 的 消 化 腺 2 种 同 エ 酶 电 泳 图 谱 F ig.4 E le c tro p h o re to g ra m s o f tw o is o z y m e s fro m d ig e s tiv e g la n d tis s u e o f th e c u ltu re d o y s te r fro m th e H ouhai B ay A: 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶 (IDH) ;B: 过 氧 化 物 歧 化 酶 (SOD) A:Isocitrate dehydrogenase (IDH); B:Superoxide dismutase (SOD) 3 讨 论 牡 蛎 的 贝 壳 颜 色 鱗 片 放 射 肋 等 形 态 学 特 征 是 传 统 分 类 方 法 的 依 据, 后 海 牡 蛎 的 形 态 观 察 与 杜 玄 等 对 C. angwzatot 的 描 述 部 分 相 似, 形 态 差 异 可 能 与 样 本 采 集 点 的 不 同 相 关 [11] 李 孝 绪 等 利 用 解 剖 学 结 构 特 征 差 异 将 中 国 沿 海 的 牡 蛎 分 为 15 个 种 [12], 并 根 据 牡 蛎 外 套 腔 的 形 态 将 广 东 养 殖 的 白 肉 红 肉 牡 蛎 分 属 于 2 个 种 [13] 由 于 牡 蛎 贝 壳 的 可 塑 性 強, 外 部 形 态 变 化 差 异 很 太, 増 加 了 传 统 分 类 方 法 的 难 度 利 用 分 子 遗 传 学 方 法 鉴 定 牡 蛎 的 基 因 型, 可 快 速 解 决 形 态 分 类 上 的 分 岐, 提 高 研 究 效 率 16S r R N A 和 CO I 基 因 序 列 測 定 系 统 发 育 树 构 建 结 果 一 致, 表 明 后 海 牡 蛎 的 品 种 为 葡 萄 牙 牡 蛎, 为 周 边 地 区 牡 蛎 原 种 场 的 正 名 和 建 设 提 供 了 实 验 依 据 Lam K 等 通 过 测 定 比 对 分 析 赤 蚝 白 蚝 的 1 6 S Æ N A 和 C 0 I 基 因 序 列, 发 现 二 者 存 在 差 异, 分 属 不 同 的 种 [Mî 后 又 通 过 基 因 序 列 分 析 发 现, 香 港 流 浮 山 养 殖 的 ー 种 牡 烦 为 新 种 C. hongkongensis[15] 0 巫 旗 生 等 对 福 清 湾 平 海 湾 深 沪 湾 同 安 湾 和 诏 安 湾 牡 贩 养 殖 区 的 牡 贩 进 行 CO I 序 列 分 析, 结 果 显 示 福 建 5 个 牡 蛎 主 要 养 殖 区 海 区 采 苗 和 人 工 育 苗 养 殖 牡 蛎

5 104 福 建 水 第35卷 产 宋 忠 魁 等 应 用 C O I 基因 主 要 为 C. angulata12 yme electrophoresis : a handbook for Animal Systemat- 条 形 码 技 术 鉴 定 广 西 茅 尾 海 的 红眼蚝 白 ics and Population Studies [ M ]. Sydney : Academic 眼 蚝 和 蚝 砺 表 明 3 种 牡 蛎 依 次 为 Press, 1986: 410. し. ariakensis し. hongkongensis ffl し..] 基因序列的測定 分析结合形态分类 可有效地 进行牡蛎物种分类 同エ酶电泳可用于分析种群间和种群内不同 个体间的生化遗传特征 掲示生物居群个体间的 [7 ] 朱 蓝 菲.鱼 类 同 エ 酶 和 蛋 白 质 的 聚 丙 烯 酰 胺 梯 度 凝 胶 电 泳 法 [ J ]. 水 生 生 物 学 报 (2) [ 8 ] Allendoif F W, Utter F M. Population genetics [A]. Fish Physiology [ M ]. New York Academic Press, 遗传学结构 鉴别出不同的基因型 黄勤等通过 [9 ] 王 中 仁.植 物 遗 传 多 祥 性 和 系 统 学 研 究 中 的 等 位 福 建 C. ariakensis和 罗 源 湾 C. g ig a s 的同エ酶分 酶 分 析 [ J L 生 物 多 祥 性 (1) 38 - 祈 发现二者有遗传隔离 确认检测样品中不含 (2) 杂交个体[n] 黄 荣 莲 等 对 广 东 C. ariakensis的三 个野生种群进行同エ酶电泳分析 证明官渡 阳 江和汕尾三个种群存在较高的遗传变异[18] 样 本的预处理 取材及实验条件等因素会影响同エ 酶电泳的结果 不同组织中同一酶类的表达也会 出现很大差异 后 海 牡 蛎 消 化 腺 组 织 中 的 IDH 和 S O D 电泳结果显示单态 该两种酶在其余组 织中的多态性 其它种类同エ酶的组织特异性和 多态性还需进一歩研究分析 [ 1 0 ] 黄 原. 分 子 系 统 学 - 原 理 方 法 及 应 用 [M]. 北 京 农 业出版社 1998: [ 1 1 ] 杜 玄 郭 希 明 钱 鲁 闽. 福 建 沿 海 巨 蛎 属 牡 蛎 的 主 要 种 类 及 其 分 布 [ J ]. 台 湾 海 峡 (3) [ 1 2 ] 李 孝 緒 齐 钟 彦. 中 国 牡 蛎 的 比 较解剖学及系统 分 类 和 演 化 的 研 究 [C] / / 中 国科学院海洋研究 所. 海 洋 科 学 集 刊 3 5 ). 北 京 科 学 出 版 社 [ 1 3 ] 李 孝 緒. 中 国 常 见 牡 蛎 外 套 腔 的 形 态 比 较 [J]. 海洋与湖沼 (6) 参考文献 L14 Lam K, Morton B. Mitochondrial D N A and morpholog [ 1 ] 曾志南 宁 岳. 福 建 牡 蛎 养 殖 业 的 现 状 问题 ical identification of a new species of Crassostrea ( Bi- 与 对 策 [ J ]. 海 洋 科 学 ( 9 ) valvia Ostreidae ) cultured for centuries in the Pearl 118. River Delta Hong Kong China [ J ]. Aquaclture [2 ] 巫 旗 生 王 晓 清 曾 志 南 等.中 国 牡 蛎 分 类 方 法 研 究 进 展 [ ]. 福 建 水 产 (1) [3 ] 莽 克 强 徐 乃 正 方 荣 祥.聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 电 泳 [ M ], 北 京 科学出版社 [ 4 ] 北 京 大 学 生 物 系 遗 传 教 研 室.遗 传 学 实 验 方 法 和 技 术 [ M ]. 北 京 高 等 教 育 出 版 社 1983: [ d ] H a m s H. Hopkinson D A. Handbook of JLnzyme Llectrophoresis in Human Genetics [ M ]. Amsterdam : North - Holland Publishing Company, 1975: [6 ] Richardson B J, Baverstock P R Adams M. Alloz [151 Lam K, Morton B. The oysters of Hong Kong ( Bivalvia: Ostreidae and Lriyphaeidae) [J]. The Raffles Bulletin of Zoology, ( 1 ) [ 1 6 ] 宋 忠 魁 蔡 小 辉 童 潼 等.广 西 茅 尾 海 常 见 牡 蛎 的 分 子 鉴 定 [ J ]. 海 洋 科 学 (8) [ 1 7 ] 黄 勤 马 平 赵 蓉 等. 近 江 牡 蛎 与 太 平 洋 牡 蛎 的 同 エ 酶 鉴 别 [ J ]. 台 湾 海 峡 2004, 23 ( 3 ) [ 1 8 ] 黄 荣 莲 杜 晓 东 张运 银. 近 江 牡 蛎 3 个种群生 化遗传变异的研究[J].湛江海洋大学学报 (3) 3 一 7.

6 第 2 期 王 朋 云 : 莆 田 后 海 养 殖 牡 蛎 的 形 态 学 观 察 和 分 子 鉴 定 105 Morphological cnaracterisucs and molecular phylogenetic analysis oi the cultured oyster from the Houhai Bay in Putian W A N G Peng-yun (Putian Aquaculture Technology Extension Station, Putian , China) Abstract : Oyster taxonomy has long been a matter of dispute owing to the high morphological and physiological similarities. Its an effective means to make a distinction between oysters by molecular techniques recently. W e observed the morphological characteristics and measured the key measurable character indicators of the common oyster cultured in the Houhai Bay, Fujian Province. The 16S rrna and CO I were sequenced and the phylogenetic trees involved in seven species of oysters were reconstructed based on the sequence similarities and genetic distances of 16S rrna and C O I gene sequences in order to identify the isolated samples. Also, the electrophoretograms oi isozymes ( I D H, S O D ) from the digestive gland tissue were analyzed. The results showed that the oyster s shell shape were different from each other because of the living environment. The oyster from the Houhai Bay should not be classified as Saccostrea cucullata but Crassostrea angulata. It was proved that sequences of 16S rrna and C O I gene could be considered as good tools for identification in oysters. IDH and SOD were found expressing in the digestive gland tissue but no polymorphic loci was detected. The combination of morphological characteristics and molecular phylogenetic analysis has provided a good method to identify the oyster. The study lays a solid foundation for the research of the recognition and protection of germplasm resources and cultivation in し.angulata. Key words :Houhai Bay;oyster; morphological characteristics ; molecular identification ;isozymes

48 5 ( Pinctada) ( P. fucata ), 3 [ 7 ] ( P. maxima ) ( P. albina), ( P. margaritifera) ( P. nigra) RAPD, ( P. chemnitzi), ( Pteria penguin) [ 1-2 ] [

48 5 ( Pinctada) ( P. fucata ), 3 [ 7 ] ( P. maxima ) ( P. albina), ( P. margaritifera) ( P. nigra) RAPD, ( P. chemnitzi), ( Pteria penguin) [ 1-2 ] [ 5 6 2 00 9 1 2 South China Fisheries Science Vol. 5, No. 6 Dec., 2009 doi: 10. 3969/ j. issn. 1673-2227. 2009. 06. 009 16S rrna,,, (, 510300) : PCR ( Pinctada fucata) ( P. chemnitzi) ( Pteria penguin)

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2 : 111 ( Pinctada maxima), 13, 11,,,,,, 15, 25 cm, cm, 4 5 kg 1-2],,, 3-7] 24] 25-26],,, ] min, 1, 5 m 4 m, 20 m , 9-22],,, ( 12 2 2 0 1 6 4 South China Fisheries Science Vol. 12, No. 2 Apr., 2016 doi: 10. 3969/ j. issn. 2095-0780. 2016. 02. 016,,,, (,,, 510300) : ( Pinctada maxima),,,, 54. 55%, 0 0. 25 m - 2, 0 70. 31 gm - 2,

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