分 类 号 密 级 华 中 农 业 大 学 硕 士 学 位 论 文 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 Research on Optimization Technology and Regulatory Mechanism by Vit

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1 HUAZHONG AGRICULTURAL UNIVERSITY 硕士学位论文 MASTER S DEGREE DISSERTATION 牛 GV 期卵母细胞玻璃化冷冻技术优化及 其作用机制研究 RESEARCH ON OPTIMIZATION TECHNOLOGY AND REGULATORY MECHANISM BY VITRIFICATION OF BOVINE GV STAGE OOCYTES 研 究 生: CANDIDATE 史 蕾 SHI LEI 导 师: SUPERVISOR 专 业: MAJOR 杨利国 教授 PROFESSOR YANG LIGUO 动物遗传育种与繁殖 ANIMAL GENETICS, BREEDINGAND REPRODUCTION 研究方向: FIELD 动物生殖生理与生物技术 ANIMAL REPRODUCTIVE PHYSIOLOGY & BIOTECHNOLOGY 中国 武汉 WUHAN, CHINA 二 一三年六月 JUNE, 2013

2 分 类 号 密 级 华 中 农 业 大 学 硕 士 学 位 论 文 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 Research on Optimization Technology and Regulatory Mechanism by Vitrification of Bovine GV Stage Oocytes 研 究 生 : 史 蕾 学 号 : 指 导 教 师 : 杨 利 国 教 授 指 导 小 组 : 杨 利 国 教 授 张 淑 君 教 授 霍 立 军 教 授 熊 家 军 副 教 授 李 翔 副 教 授 专 业 : 动 物 遗 传 育 种 与 繁 殖 研 究 方 向 : 动 物 生 殖 生 理 与 生 物 技 术 获 得 学 位 名 称 : 农 学 硕 士 获 得 学 位 时 间 :2013 年 6 月 26 日 华 中 农 业 大 学 动 物 科 学 技 术 学 院 二 一 三 年 六 月

3 本 课 题 由 现 代 农 业 技 术 体 系 (CARS-37-04B) 国 家 合 作 重 点 (OS2012ZR0216) 948 重 点 (2011-G26) 资 助

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5 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 目 录 摘 要... i Abstract...iv 缩 略 词 表... vii 第 一 部 分 文 献 综 述 牛 卵 母 细 胞 冷 冻 保 存 研 究 进 展 牛 卵 母 细 胞 冷 冻 保 存 研 究 现 状 卵 母 细 胞 冷 冻 保 存 的 技 术 方 法 玻 璃 化 冷 冻 保 存 研 究 进 展 冷 冻 保 护 剂 海 藻 糖 在 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 中 的 应 用 海 藻 糖 的 结 构 和 性 质 海 藻 糖 在 哺 乳 动 物 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 中 的 应 用 氯 化 胆 碱 在 胚 胎 或 卵 母 细 胞 冷 冻 中 的 应 用 及 优 势 氯 化 胆 碱 在 胚 胎 和 配 子 冷 冻 中 的 应 用 卵 母 细 胞 冷 冻 液 母 液 中 氯 化 胆 碱 替 代 氯 化 钠 的 优 势 原 因 玻 璃 化 冷 冻 对 卵 母 细 胞 结 构 细 胞 器 和 发 育 潜 力 的 影 响 玻 璃 化 冷 冻 对 卵 母 细 胞 细 胞 骨 架 及 染 色 体 的 影 响 玻 璃 化 冷 冻 对 卵 母 细 胞 细 胞 膜 的 影 响 玻 璃 化 冷 冻 对 卵 母 细 胞 透 明 带 的 影 响 玻 璃 化 冷 冻 对 卵 母 细 胞 线 粒 体 的 影 响 玻 璃 化 冷 冻 对 卵 母 细 胞 的 分 子 损 伤 的 影 响 本 实 验 的 研 究 目 的 及 意 义...17 第 一 章 不 同 浓 度 海 藻 糖 对 牛 GV 期 卵 母 细 胞 冷 冻 的 效 果 前 言 材 料 与 方 法 材 料 方 法...24 I

6 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 2.3 统 计 分 析 结 果 与 分 析 冷 冻 对 卵 母 细 胞 存 活 能 力 的 影 响 冷 冻 对 卵 母 细 胞 透 明 带 的 影 响 冷 冻 对 卵 母 细 胞 细 胞 器 的 影 响 冷 冻 对 卵 丘 细 胞 扩 展 的 影 响 冷 冻 对 卵 母 细 胞 发 育 潜 力 的 影 响 讨 论 卵 母 细 胞 存 活 能 力 的 评 价 卵 母 细 胞 冻 存 后 透 明 带 硬 度 的 评 价 卵 母 细 胞 冻 存 后 细 胞 器 的 评 价 卵 母 细 胞 冻 融 后 卵 丘 扩 展 和 发 育 能 力 的 评 价 小 结 第 二 章 牛 GV 期 卵 母 细 胞 冷 冻 损 伤 的 分 子 机 制 前 言 实 验 材 料 与 方 法 实 验 材 料 实 验 方 法 结 果 与 分 析 冷 冻 对 卵 母 细 胞 凋 亡 的 影 响 冷 冻 对 卵 母 细 胞 凋 亡 和 周 期 基 因 mrna 表 达 量 的 影 响 讨 论 小 结 第 三 章 改 良 磷 酸 盐 缓 冲 液 (mpbs) 配 制 玻 璃 化 冷 冻 液 冷 冻 卵 母 细 胞 效 果 评 价 引 言 材 料 与 方 法 材 料 方 法 结 果 与 分 析 II

7 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 3.1 以 mpbs 配 制 玻 璃 化 冷 冻 保 护 剂, 冷 冻 对 卵 母 细 胞 存 活 能 力 的 影 响 以 mpbs 配 制 玻 璃 化 冷 冻 保 护 剂, 冷 冻 对 卵 母 细 胞 透 明 带 硬 度 的 影 响 以 mpbs 配 制 玻 璃 化 冷 冻 保 护 剂, 冷 冻 对 卵 母 细 胞 发 育 潜 力 的 影 响 以 mpbs 配 制 玻 璃 化 冷 冻 保 护 剂, 冷 冻 对 卵 母 细 胞 凋 亡 和 周 期 基 因 mrna 表 达 量 的 影 响 讨 论 卵 母 细 胞 冻 融 后 活 力 评 价 卵 母 细 胞 冻 融 后 透 明 带 硬 度 评 价 卵 母 细 胞 冻 融 后 发 育 能 力 的 评 价 卵 母 细 胞 冻 融 后 细 胞 凋 亡 和 细 胞 周 期 基 因 mrna 表 达 量 评 价 小 结...56 参 考 文 献...57 致 谢...65 III

8 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 摘 要 牛 GV 期 卵 母 细 胞 相 对 于 成 熟 卵 母 细 胞 的 冷 冻 保 存 要 困 难 很 多, 但 在 远 距 离 运 输 卵 母 细 胞 时, 必 须 进 行 冷 冻 保 存 因 此, 开 发 GV 期 卵 母 细 胞 冷 冻 保 存 技 术 对 于 充 分 利 用 未 成 熟 卵 母 细 胞 特 别 是 远 距 离 屠 宰 场 卵 巢 卵 母 细 胞 保 存 具 有 重 要 的 现 实 意 义 海 藻 糖 (trehalose) 是 一 种 类 似 于 蔗 糖 的 非 还 原 性 双 糖, 能 形 成 玻 璃 状 保 护 层 保 护 处 于 极 端 条 件 下 的 生 命 体, 因 此 探 索 海 藻 糖 作 为 非 渗 透 性 冷 冻 保 护 剂 替 代 常 规 玻 璃 化 冷 冻 保 护 剂 (CPA) 中 蔗 糖 用 于 冷 冻 保 存 GV 期 卵 母 细 胞 的 可 能 性, 并 找 到 最 适 替 代 浓 度 是 本 研 究 的 目 的 之 一 有 研 究 证 明, 常 规 溶 解 冷 冻 保 护 剂 的 缓 冲 介 质 DPBS( 杜 氏 磷 酸 盐 缓 冲 液 ) 中 的 主 要 成 分 NaCl, 对 胚 胎 的 超 低 温 冷 冻 具 有 一 定 的 危 害, 但 其 对 卵 母 细 胞 尤 其 是 GV 期 卵 母 细 胞 的 保 护 作 用 未 见 报 道 因 此, 本 研 究 的 目 的 之 二, 是 以 氯 化 胆 碱 代 替 NaCl, 以 及 联 合 海 藻 糖 和 氯 化 胆 碱 用 于 GV 期 卵 母 细 胞 的 冷 冻 保 存, 探 索 其 保 护 效 果 此 外, 本 研 究 的 目 的 之 三, 是 研 究 冷 冻 损 伤 的 机 制, 凋 亡 基 因 和 周 期 基 因 相 对 表 达 量 的 差 异 性 研 究 内 容 和 结 果 如 下 : 1. 不 同 浓 度 海 藻 糖 对 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 的 效 果 (1) 在 对 不 同 浓 度 海 藻 糖 作 为 非 渗 透 性 保 护 剂 对 卵 母 细 胞 存 活 能 力 评 价 的 实 验 中, 发 现 冷 冻 组 中 0.5M 海 藻 糖 组 活 力 强 的 比 率 不 如 0.5M 蔗 糖 组 (39.8% vs 52.5%, p<0.05), 但 是 0.5M 海 藻 糖 组 的 总 的 存 活 的 卵 母 细 胞 比 率 比 0.5M 蔗 糖 组 高 (70.1% vs 63.6%, p<0.05), 其 他 冷 冻 组 之 间 无 显 著 差 异 (2) 在 CPA 中 添 加 不 同 浓 度 海 藻 糖 后 透 明 带 硬 度 测 定 实 验 中,0.5M 蔗 糖 组 中 透 明 带 溶 解 时 间 ( 93±2.5min ) 显 著 少 于 其 他 冷 冻 组, 0.5M 海 藻 糖 组 (95.5±2.6min) 0.3M 海 藻 糖 组 (93.3±3.8min) 除 外 (p<0.05) (3) 卵 母 细 胞 发 育 能 力 与 对 照 组 相 比, 冷 冻 显 著 降 低 了 胚 胎 的 卵 裂 率 和 囊 胚 率 (p<0.05),1m 海 藻 糖 组 0.8M 海 藻 糖 组 0.1M 海 藻 糖 组 冷 冻 保 存 的 卵 母 细 胞 不 能 发 育 到 囊 胚 期,0.5M 蔗 糖 组 与 0.5M 海 藻 糖 组 0.3M 海 藻 糖 组 胚 胎 的 卵 裂 率 和 囊 胚 率 差 异 不 显 著 (p>0.05), 且 0.5M 蔗 糖 组 (13.9±2.3%) 和 0.5M 海 藻 糖 组 (12.2±0.9%) 0.3M 海 藻 糖 组 (10.4±2.8%) 的 胚 胎 卵 裂 率 显 著 高 于 其 它 组 (0.8M 海 藻 i

9 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 糖 组 (7.7±4.3%) 除 外 )(p<0.05);0.5m 蔗 糖 组 (2.5±2.2%) 和 T3(1.5±1.3%) 0.3M 海 藻 糖 组 (1.3±2.2%) 的 囊 胚 率 要 高 于 其 它 组, 但 差 异 不 显 著 (4) 检 测 体 外 培 养 成 熟 的 卵 母 细 胞 的 纺 锤 体 形 态, 实 验 结 果 发 现, 冷 冻 保 护 剂 中 浓 度 相 同 (0.5mol/L) 两 种 糖 具 有 类 似 保 护 效 果, 冷 冻 液 中 添 加 不 同 浓 度 的 海 藻 糖 会 起 到 不 同 程 度 的 保 护 作 用 实 验 结 论 : 海 藻 糖 可 以 作 为 蔗 糖 的 替 代 物 用 于 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻, 0.3mol/L-0.8mol/L 均 能 达 到 一 定 的 保 护 作 用, 但 0.5mol/L 为 最 适 宜 替 代 浓 度 2. 牛 GV 期 卵 母 细 胞 冷 冻 损 伤 的 分 子 机 制 (1) 通 过 细 胞 凋 亡 检 测 试 剂 盒 免 疫 荧 光 染 色 法 检 测 卵 母 细 胞 凋 亡, 实 验 结 果 表 明 : 0.5M 蔗 糖 组 (4.1±0.9%) 0.5M 海 藻 糖 组 (5.5±2.6%) 卵 母 细 胞 未 凋 亡 的 比 率 显 著 低 于 (p<0.05) 新 鲜 卵 组 (13.0±0.9%); (2) 通 过 检 测 细 胞 凋 亡 相 关 基 因 BAX inhibitor 和 BAX, 以 及 细 胞 周 期 相 关 基 因 CDC2 和 CyclinB1 的 mrna 相 对 表 达 量, 发 现 经 过 冻 融 的 卵 母 细 胞, 其 mrna 表 达 水 平 明 显 受 到 影 响, 凋 亡 基 因 BAX 和 周 期 相 关 基 因 CDC2 表 达 水 平 上 调, 另 两 个 表 达 水 平 总 体 下 调 实 验 结 论 : 冷 冻 引 起 GV 期 卵 母 细 胞 凋 亡 加 剧, 冷 冻 损 伤 主 要 是 通 过 引 起 凋 亡 的 途 径 进 行 的 3. 改 良 磷 酸 盐 缓 冲 液 (mpbs) 配 制 玻 璃 化 冷 冻 液 卵 母 细 胞 冷 冻 效 果 评 价 1)CPA 中 氯 化 钠 以 氯 化 胆 碱 替 代 后, 卵 母 细 胞 成 活 率 0.5M 蔗 糖 组 (24.2%) 显 著 低 于 对 照 组 (90.4%) mpbs+0.5m 蔗 糖 组 (42.2%) 和 mpbs+0.5m 海 藻 糖 组 (47.0%)(p<0.05) mpbs+0.5m 蔗 糖 组 和 mpbs+0.5m 海 藻 糖 组 在 统 计 学 上 差 异 不 显 著, 但 后 者 高 于 前 者 (p>0.05) 2)CPA 中 氯 化 钠 以 氯 化 胆 碱 替 代 后, 透 明 带 溶 解 时 间 冷 冻 组 0.5M 蔗 糖 组 ( 103 ± 4.16 min ) 显 著 长 于 mpbs+0.5m 海 藻 糖 组 ( ± 5.69min ) 和 mpbs+0.5m 蔗 糖 组 (89.00±9.54min)(p<0.05) 3)CPA 中 氯 化 钠 以 氯 化 胆 碱 替 代 后, 卵 母 细 胞 成 熟 培 养 后 体 外 受 精, 受 精 胚 胎 的 卵 裂 率, 冷 冻 组 显 著 低 于 对 照 组 (45.4±0.9%,p<0.05),mPBS+0.5M 蔗 糖 组 (28.4±0.5%) 和 mpbs+0.5m 海 藻 糖 组 (26.8±2.1%) 显 著 高 于 0.5M 蔗 糖 组 (14.2±2.6%)(p<0.05); 囊 胚 率 0.5M 蔗 糖 组 (2.3±2.0%) mpbs+0.5m 蔗 糖 ii

10 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 组 (3.2±0.1%) 低 于 mpbs+0.5m 海 藻 糖 组 (3.9±0.9%), 三 组 在 统 计 学 上 差 异 不 显 著 (p>0.05) 实 验 结 论 :DPBS 中 的 钠 离 子 对 牛 GV 期 卵 母 细 胞 冷 冻 有 一 定 的 危 害, 以 氯 化 胆 碱 替 代, 能 起 到 一 定 的 保 护 作 用, 并 且 非 渗 透 性 保 护 剂 0.5mol/L 海 藻 糖 替 代 蔗 糖, 与 氯 化 胆 碱 配 合 使 用, 能 达 到 更 优 效 果 关 键 词 : 牛 ;GV 期 卵 母 细 胞 ; 玻 璃 化 冷 冻 ; 海 藻 糖 ; 氯 化 胆 碱 iii

11 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 Abstract Compared with the mature oocyte cryopreservation, cattle GV oocyte cryopreservation is very difficult. But in the long-distance transportation of oocyte, cryopreservation is needed.so, the development of GV oocyte cryopreservation have significant role on making full use of immature oocytes, expecially long-distance cryopreservation of oocyte. Trehalose,a non-reducing disaccharide, can form a glassy protecting layer for the alive cell under extreme conditions. Trehalose can be applied in embryo and oocyte cryopreservation as a non-permeable cryoprotectants instead of the sucrose in CPA in this study; some previous studies had showed that the NaCl, as the main ingredient in the conventional cryoprotectants buffer DPBS might cause some certain damage in the embryo cryopreservation. Therefore, choline chloride could be a proper substitute of NaCl in alleviating the potential damage of the sodium ions. In this study, the optimal substitution proportion for the trehalose and choline chloride to the sucrose and NaCl respectively were found through comparing with the development potential, survive rate of the oocytes, cell damage and expressions of apoptosis and cycle genes among different cryopreservation groups. The experimental results were listed as follows: 1. To explore frozen effect of different trehalose concentrations on GV-stage oocytes vitrification (1) Added different concentrations of trehalose in the CPA to detect the survival rates. The FDA fluorescence intensity of the frozen group 0.5M Trehalose was less than the 0.5M sucrose group (39.8% vs 52.5%, p <0.05), but the Fluorescence value of the 0.5M sucrose group was less than the 0.5M Trehalose group (63.6% vs 70.1%, p <0.05), There was no significant difference between the other frozen groups. (2) The zona pellucida dissolution time of all frozen groups compared with the fresh group were significantly increased (p<0.05); The zona pellucida dissolution time of 0.5 M sucrose group (93 ± 2.5min) was significantly less than the other frozen group, Excepting for 0.5M Trehalose (95.5 ± 2.6 min), 0.3M Trehalose group (93.3 ± 3.8 min) (p <0.05). (3) In the thawed oocytes viability experiments, compared with the C group, oocyte IVF embryo cleavage and blastocyst rates were significantly reduced in the frozen groups (p<0.05). 1M Trehalose, 0.8M Trehalose, 0.1M Trehalose group cryopreserved oocytes iv

12 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 could not develop to the blastocyst stage, 0.5M sucrose group and 0.5M Trehalose, 0.3M Trehalose group IVF embryo cleavage and blastocyst rates difference were not significant (p>0.05), and 0.5M sucrose (13.9±2.3%)and 0.5M Trehalose (12.2±0.9%), 0.3M Trehalose group (10.4±2.8%) embryo cleavage rates were significantly higher than the other groups (except the 0.8M Trehalose group (7.7±4.3%)) (p <0.05); the blastocyst rates of 0.5M sucrose group (2.5±2.2%) and 0.5M Trehalose (1.5±1.3%), 0.3M Trehalose group (1.3±2.2%) were higher than the other groups, but the difference was not significant. (4) The spindle morphologies of maturated oocytes cultured in vitro was discovered. It was found that the concentration of 0.5mol/L was the trehalose s optimal concentration and the protective effection was varied with the concentration. Conlusion: The trehalose had the potiential in protecting the viability of the freezing oocytes and could substitute the sucrose in CPA buffer. Based on the results of the surviving rates, embryo development the 0.5mol/L trehalose was the optimal concentration. 2 To explore the mechanism of bovine GV-stage oocytes injury by frozen (1) The oocyte apoptosis was detected by immunofluorescence staining method of Apoptosis detection kit, The results showed that: the oocyte nonapoptosis ratios of the 0.5M sucrose group was (4.1±0.9%) and the 0.5M trehalose group was (5.5±2.6%), the oocyte nonapoptosis ratios (p <0.05) were significantly lower than the fresh control group as (13.0 ± 0.9%). (2) In the RT-PCR experiments, the mrna relative expression levels of apoptosis related genes BAX inhibitor and BAX, as well as the cell cycle-related genes CDC2 and CyclinB1 was detected according to the RNA extracted from the oocytes. Then it was found that the mrna expression level of the areapoptotic gene BAX and cycle related gene CDC2 were increased, the other were overall down. Conlusion: Frozen can exacerbate the apoptosis of GV-stage oocytes,which is the main cause of freezing injury. 2. Modified phosphate buffered saline (mpbs) in the bovine GV stage oocytes vitrification freezing effect evaluation (1) The choline chloride Alternate sodium chloride, the survival rate of 0.5M sucrose group (24.2%), mpbs+0.5m sucrose group (42.2%) and mpbs+0.5m trehalose group (47.0%) was significantly (p <0.05) lower than the fresh group (90.4 %). The difference v

13 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 between mpbs+0.5m sucrose group and mpbs+0.5m trehalose group was not significant statistically. (2) The zona pellucida dissolution time of the frozen groups were significantly longer than the fresh group (p <0.05); The 0.5M sucrose group (103 ± 4.16 min) was significantly longer than the mpbs+0.5 M trehalose (86.67 ± 5.69min) and mpbs+0.5m sucrose group (89.00± 9.54min) (p<0.05). (3) Oocytes matured were in vitro and in vitro fertilization,.it was discovered that the cleavage rates of fertilized embryosof the frozen groups were significantly lower than the fresh group (45.4 ± 0.9%, p <0.05); the mpbs+0.5m sucrose group (28.4 ± 0.5%) and mpbs+0.5m trehalose group (26.8 ± 2.1%) were significantly higher than the 0.5M sucrose group (14.2 ± 2.6%) (p <0.05). The blastocysts rates of the 0.5M sucrose group (2.3 ± 2.0%), mpbs+0.5m sucrose group (3.2% ± 0.1%) were lower than the mpbs+0.5m trehalose group (3.9% ± 0.9%), but there was no significant difference (p>0.05) among the three groups statistically. (4)Compared with the 0.5M sucrose group, mpbs+0.5m sucrose and mpbs+0.5 M trehalose group could ease the downward trend of BAX inhibitor1 mrna expression levels. But it was found that although apoptosis and regulation cycle gene expression has been suppressed, compared with the fresh, the frozen groups leaded the normal expression of apoptosis and cell cycle genes. Conlusion: The sodium ions might hurt the GV stage oocytes during the process of cryopreservation. The choline chloride could act as a protector for the oocytes by fully substituting the NaCl which was used in DPBS. Moreover, together with the choline chloride, the 0.5mol/L trehalose could reach its optimal effect in protecting the freezing oocytes. Key words: bovine, GV oocytes, vitrification, trehalose, choline chloride vi

14 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 缩 略 词 表 Abbreviation words 缩 略 词 英 文 名 称 中 文 名 称 EG Ethylene Glycol 乙 二 醇 PROH Propylene Glycol 丙 二 醇 BSA Bvine Serum Ambumin 牛 血 清 蛋 白 DMSO Dimethyl Sμlfoxide 二 甲 基 亚 砜 CPA Cryoprotective agent 冷 冻 保 护 剂 COCs Cumμlus-Oocyte Complexes 卵 丘 细 胞 - 卵 母 细 胞 复 合 体 EGF Epidermal Growth Factor 表 皮 生 长 因 子 FSH Follicle Stimμlating Hormine 促 卵 泡 激 素 LH Luteinizing Hormone 促 黄 体 素 SOF Synthetic OviductalFluid 合 成 输 卵 管 液 TCM-199 Tissue Cμlture Medium-199 组 织 培 养 液 199 COCs Cumulus-oocyte complexes 卵 丘 卵 母 细 胞 复 合 体 NEAA Nonessential Amino Acid 非 必 需 氨 基 酸 PI Propidium Iodide 碘 化 丙 啶 R-123 Rhodamine 罗 丹 明 123 荧 光 染 料 α-chy α-chymotrypsin α- 胰 凝 乳 蛋 白 酶 OPS Open Pulled Straw 开 放 式 拉 长 塑 料 细 管 法 CPS Closed Pulled Straw 封 闭 式 拉 长 塑 料 细 管 法 DIC Differential Interference 微 分 干 涉 对 比 成 像 Contrast vii

15 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 第 一 部 分 文 献 综 述 1 牛 卵 母 细 胞 冷 冻 保 存 研 究 进 展 雌 性 哺 乳 动 物 的 卵 巢 中 有 数 十 万 个 卵 原 细 胞, 但 终 身 繁 殖 的 后 代 数 只 有 数 个 或 数 十 个, 即 卵 母 细 胞 的 利 用 率 不 到 万 分 之 一, 以 致 影 响 家 畜 育 种 效 率 和 珍 稀 动 物 保 护 效 果 因 此, 如 何 提 高 卵 母 细 胞 利 用 率, 愈 来 愈 受 到 世 界 各 国 的 重 视 提 高 卵 母 细 胞 利 用 率 的 技 术 和 方 法 很 多, 除 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 培 养 体 外 受 精 等 胚 胎 工 程 技 术 外, 卵 母 细 胞 冷 冻 保 存 也 是 提 高 卵 母 细 胞 利 用 率 的 一 种 重 要 手 段, 而 且 有 着 良 好 的 实 际 生 产 应 用 前 景 然 而, 由 于 卵 母 细 胞 是 单 细 胞, 体 积 较 其 他 体 细 胞 或 者 精 子 要 大 很 多, 而 且 含 水 量 高, 胞 质 丰 富, 细 胞 器 相 对 复 杂, 目 前 卵 母 细 胞 的 冷 冻 比 较 困 难, 技 术 也 还 不 成 熟 因 此 提 高 卵 母 细 胞, 特 别 是 GV 期 卵 母 细 胞 的 冷 冻 保 存 技 术, 对 提 高 长 距 离 卵 巢 运 输 效 率 和 卵 母 细 胞 利 用 率 具 有 重 要 价 值 1.1 牛 卵 母 细 胞 冷 冻 保 存 研 究 现 状 对 卵 母 细 胞 冷 冻 技 术 早 在 上 世 纪 70 年 代 便 提 上 了 议 程 1977 年, 美 国 科 学 家 Whittingham 最 先 冷 冻 保 存 了 小 鼠 的 成 熟 卵 母 细 胞, 解 冻 受 精 后 成 功 获 得 后 代 (Whittingham et al 1977); 1985 年,Rall 等 发 明 了 玻 璃 化 冷 冻 法, 并 用 于 小 鼠 8- 细 胞 胚 胎 的 冷 冻 保 存 (Rall et al 1985), 这 种 方 法 取 得 成 功 的 同 时 为 卵 母 细 胞 的 冷 冻 保 存 开 辟 了 新 的 研 究 途 径 对 卵 母 细 胞 进 行 冷 冻 的 成 功 与 否 主 要 取 决 于 复 苏 后 的 形 态 和 生 理 功 能 的 恢 复 程 度 与 体 细 胞 和 胚 胎 相 比, 卵 母 细 胞 是 单 细 胞, 体 积 相 较 其 他 要 大 很 多, 而 且 具 有 含 水 量 高, 胞 质 丰 富 等 特 性, 且 因 含 水 量 丰 富, 冷 冻 时 不 易 充 分 脱 水, 易 形 成 冰 晶, 导 致 细 胞 膜 和 细 胞 器 因 此 而 受 到 损 伤 和 破 裂 因 此, 卵 母 细 胞 的 冷 冻 比 精 子 和 胚 胎 甚 至 体 细 胞 要 更 为 复 杂 近 年 来, 随 着 低 温 冷 冻 学 的 研 究 深 入, 卵 母 细 胞 的 超 低 温 冷 冻 也 慢 慢 发 展 起 来, 并 且 冷 冻 保 存 后 卵 母 细 胞 通 过 受 精 也 获 得 了 后 代, 现 将 近 年 来 的 研 究 进 展 初 步 总 结 列 于 如 下 表 中 1

16 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 表 1-1 首 次 由 冷 冻 保 存 后 卵 母 细 胞 获 得 后 代 的 哺 乳 动 物 种 类 与 冷 冻 方 法 Table 1-1 First births resμlting from the Successfμl cryopreservation of mammailan oocytes 哺 乳 动 物 的 种 类 冷 冻 过 程 使 用 的 方 法 主 要 参 考 文 献 小 鼠 (Mouse) 慢 速 冷 冻 (Slow-cooling) Parkening et al 1976 玻 璃 化 冷 冻 (Vitrification) Kono et al 1991 人 (Human) 慢 速 冷 冻 (Slow-cooling), 成 熟 (matured) Chen et al 1986 慢 速 冷 冻 (Slow-cooling), 未 成 熟 (immatured) Tucker et al 1998 玻 璃 化 冷 冻 (vitrification), 成 熟 (matured) Kuleshova et al 1999 兔 (Rabbit) 慢 速 冷 冻 (Slow-cooling) Hasani et al 1989 Vincent et al 1989 牛 (Cattle) 慢 速 冷 冻 (slow.cooling) Fuku et al 1992 玻 璃 化 冷 冻 (Vitrification),(OPS) Vajta et al 1995 马 (Horse) 玻 璃 化 冷 冻 (Vitrification), 细 管 法 (Straw) Hochi et al 1994 玻 璃 化 冷 冻 (Vitrification),Cryoloop Maclellan et al 2002 猪 慢 速 冷 冻 (slow.cooling) Nagashima et al 1996 玻 璃 化 冷 冻 (vitrification) Volodimi et al 1998 山 羊 玻 璃 化 冷 冻 (Vitrification) 刘 海 军 2000 对 哺 乳 动 物 卵 母 细 胞 尤 其 是 家 畜 卵 母 细 胞 的 超 低 温 冷 冻 研 究 主 要 集 中 在 牛 卵 母 细 胞 的 冷 冻 保 存 上, 从 上 世 纪 90 年 代 开 始,Lim 首 次 冷 冻 保 存 成 熟 卵 母 细 胞 得 到 了 成 功, 并 且 1992 年 Fuku 等 人 通 过 对 冻 融 卵 母 细 胞 进 行 受 精, 得 到 了 牛 犊, 并 且 近 20 年 来, 冷 冻 方 法 也 由 慢 速 冷 冻 向 玻 璃 化 冷 冻 方 面 探 索, 并 取 得 可 喜 结 果 ( 表 1-2) 但 是 对 比 成 熟 卵 母 细 胞, 未 成 熟 卵 母 细 胞 或 GV 期 卵 母 细 胞 的 冷 冻 保 存 要 困 难 很 多, 进 展 缓 慢 目 前 对 于 牛 GV 期 卵 母 细 胞 的 冷 冻 多 集 中 在 玻 璃 化 冷 冻 保 护 剂 渗 透 性 保 护 剂 配 比 的 探 索 以 及 如 何 加 快 降 温 速 率 的 方 法 上 面, 在 非 渗 透 性 冷 冻 保 护 剂 和 低 温 冷 冻 损 伤 机 理 方 面 研 究 不 多, 对 于 冷 冻 保 护 液 成 分 和 冷 冻 损 伤 机 理 方 面 等 方 面 还 有 待 进 一 步 研 究 2

17 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 表 1-2 牛 卵 母 细 胞 冷 冻 保 存 研 究 进 展 Table 1-2 Bovine oocyte cryopreservation research progress 卵 母 细 胞 冷 冻 时 期 冷 冻 方 法 目 的 及 结 果 参 考 文 献 未 成 熟 和 成 熟 卵 母 慢 速 冷 冻 法 冷 冻 方 法 及 卵 母 细 胞 时 期 对 其 冷 冻 Lim et al 1991 细 胞 有 影 响 成 熟 卵 母 细 胞 慢 速 冷 冻 法 第 一 次 得 到 牛 犊 Fuku et al 1992 IVM 成 熟 卵 母 细 胞 OPS 法 IVF 后 囊 胚 率 达 到 11-25% Vajita et al 1998 成 熟 卵 母 细 胞 固 体 表 面 玻 璃 有 卵 丘 细 胞 冷 冻 后 获 得 较 高 的 复 苏 Dinnyes et al 法 (SSV) 率, 卵 裂 率 和 囊 胚 率 2000 IVM 成 熟 卵 母 细 胞 微 滴 法 囊 胚 率 达 到 20%, 并 得 到 健 康 一 头 Amir et al 2002 小 牛 IVM 成 熟 卵 母 细 胞 低 温 冷 冻 环 无 卵 丘 细 胞 冷 冻 后 获 得 较 高 的 复 苏 Chian et al 2004 (cryotop) 率, 卵 裂 率 和 囊 胚 率 GV 期 慢 速 冷 冻 卵 裂 率 35.3%-42.2% ; 囊 胚 率 1.3%-3.1% 不 同 成 熟 阶 段 GMP 卵 裂 率 36.67%-52.3%, 成 熟 培 养 Suzuki et al 1996 包 华 琼 等 h 牛 卵 母 细 胞 受 精 率 最 高 COCs OPSvs 细 管 法 成 熟 率 66%vs48.2%,OPS 囊 胚 率 达 到 7% GV/GVBD/MI/MII OPS 乙 二 醇 和 发 育 阶 段 对 卵 母 细 胞 冷 冻 发 育 能 力 的 影 响 GV/MII 低 温 冷 冻 环 颗 粒 细 胞 和 冷 冻 程 序 对 卵 母 细 胞 冻 禹 学 礼 等 2005 Vanessa et al 2008 Zhou et al 2010 (cryotop) 融 后 发 育 能 力 的 影 响,GV 期, 成 活 率, 卵 裂 率 和 囊 胚 率 COCs 高 于 裸 卵,MII 期 不 明 显 不 同 时 期 微 滴 法 冻 后 携 带 GFP 基 因 的 牛 卵 母 细 胞 Yang et al 2008 进 行 体 细 胞 移 植, 移 植 后 胚 胎 有 GFP 表 达 1.2 卵 母 细 胞 冷 冻 保 存 的 技 术 方 法 近 些 年 新 建 立 了 一 种 新 型 快 速 冷 冻 方 法 即 玻 璃 化 冷 冻 技 术, 与 常 规 冷 冻 方 法 相 比, 它 更 简 单, 快 速 有 效, 不 需 要 冷 冻 仪 器 以 及 操 作 者 特 殊 的 技 能, 但 要 求 高 浓 度 (6mol/L) 的 冷 冻 保 护 剂, 基 本 原 理 是 冷 冻 前, 在 不 破 坏 渗 透 压 平 衡 的 段 时 间 内, 3

18 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 利 用 高 浓 度 的 抗 冻 保 护 剂 使 其 置 换 出 细 胞 中 的 大 部 分 水 分, 随 后 将 其 迅 速 投 入 液 氮 进 行 急 速 冷 却, 如 此 使 得 抗 冻 保 护 剂 液 体 粘 滞 性 增 加, 很 容 易 达 到 临 界 值 随 即 发 生 固 化, 而 细 胞 内 很 少 甚 至 无 冰 晶 生 成, 液 体 呈 现 透 明 的 玻 璃 样, 因 此 该 过 程 被 称 作 玻 璃 化 (vitrification)( 朱 士 恩 1997; 桑 润 滋 等 2002) 根 据 物 理 学 原 理, 高 浓 度 的 低 温 保 护 剂 在 超 低 温 环 境 下 ( 如 液 氮 或 者 液 氦 ) 凝 固 成 没 有 规 则 的 玻 璃 化 固 体, 在 凝 固 过 程 中 由 于 溶 液 浓 度 高, 使 得 由 液 态 向 固 体 转 变 过 程 中 仍 能 保 持 正 常 的 分 子 和 离 子 分 布, 因 而 这 种 玻 璃 化 的 形 成 对 卵 母 细 胞 的 冷 冻 具 有 一 定 的 保 护 作 用 国 外 科 学 于 1985 年 首 次 报 道 了 用 玻 璃 化 方 法 成 功 冷 冻 保 存 了 小 鼠 胚 胎 (Rall et al 1985) 这 种 方 法 与 慢 速 冷 冻 法 相 比 优 点 是 降 温 迅 速 ( 见 图 1-1), 减 少 了 由 于 细 胞 冰 晶 形 成, 以 及 由 此 而 引 起 的 一 系 列 机 械 性 损 伤, 减 轻 了 一 些 动 物 卵 母 细 胞 或 者 胚 胎 在 冷 冻 过 程 中 因 为 常 见 的 过 冷 而 造 成 的 冻 伤 现 象 但 是 有 利 有 弊, 该 方 法 最 大 的 缺 点 就 是 因 为 冷 冻 保 护 剂 的 浓 度 高 而 引 起 的 化 学 中 毒, 而 且 如 果 冷 冻 操 作 过 慢 的 话 还 可 能 会 引 起 渗 透 压 急 剧 变 化 而 对 细 胞 造 成 损 伤, 因 此, 尽 量 选 择 化 学 毒 性 小 的 冷 冻 保 护 剂 及 组 合 比 例 以 及 缩 短 冷 冻 液 处 理 时 间 是 玻 璃 化 冷 冻 效 果 好 坏 的 关 键 之 一 ( 唐 业 刚 2006) 4

19 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 图 1 卵 母 细 胞 超 低 温 冷 冻 保 存 示 意 图 Fig. 1 Diagram of cryopreservation on oocyte 1.3 玻 璃 化 冷 冻 保 存 研 究 进 展 玻 璃 化 冷 冻 法 因 为 不 可 避 免 的 要 使 用 到 高 浓 度 的 抗 冻 保 护 剂, 肯 定 有 化 学 毒 性, 所 以 降 低 毒 性 作 用 需 另 辟 蹊 径, 可 通 过 提 高 降 温 速 率 实 现 因 此 近 年 来 进 行 玻 璃 化 冷 冻 实 验 选 择 冷 冻 承 载 物 时, 具 有 较 高 降 温 速 率 的 承 载 物 便 成 为 了 首 选 目 前 冷 冻 中 常 见 的 承 载 物 各 式 各 样, 各 个 方 法 的 优 缺 点 总 结 见 表 1-3 5

20 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 表 1-3 卵 母 细 胞 或 者 胚 胎 进 行 玻 璃 化 冷 冻 保 存 采 用 的 方 法 分 类 和 主 要 特 征 (Table 1-3 The main methods and characteristics of oocytes or embryos vitrification) 玻 璃 化 冷 冻 方 法 Methods of Vitrification 细 管 法 staw 开 放 式 拉 长 塑 料 细 管 法 Open Pulled Straw(OPS) 封 闭 式 拉 长 塑 料 细 管 法 Closed Pulled Straw(CPS) 微 细 玻 璃 管 法 (GMP) 固 体 表 面 法 solid-surface vitrification (SSV 法 ) 电 镜 铜 网 法 electron microscope grids(emg) 冷 冻 环 法 cryotop 首 次 应 用 First application 小 鼠 胚 胎 玻 璃 化 冷 冻 程 序 化 冷 冻 牛 体 外 受 精 胚 胎 小 鼠 的 卵 母 细 胞 小 鼠 桑 椹 胚 牛 卵 母 细 胞 果 蝇 胚 胎 小 鼠 和 人 的 囊 胚 发 明 者 Inventer Rall et al 1985 Vajta et al 1997 Chen et al 2001 Kong et al 2000 Dinnves et al 2000 Steponkus et al 1990 Mazur et al 1992 Martino et al 1996 优 点 Advantage 1) 直 径 小, 管 壁 薄, 装 载 胚 胎 或 细 胞 后 降 温 比 较 快, 有 利 于 玻 璃 化 状 态 的 形 成 ; 2) 细 管 可 以 封 口 后 形 成 封 闭 区 间, 避 免 了 与 外 界 的 直 接 接 触, 减 少 了 污 染 的 几 率 ; 3) 可 以 再 细 管 上 进 行 标 记, 有 助 于 记 录 重 要 信 息, 以 免 时 间 长 及 使 用 时 的 混 淆 1) 减 少 与 抗 冻 保 护 剂 作 用 时 间, 降 低 化 学 毒 性 ; 2) 降 低 冷 冻 损 伤 1) 相 较 OPS, 提 高 了 卵 母 细 胞 存 活 率 ; 2) 对 细 胞 器 有 保 护 作 用 1) 冷 冻 时 不 再 漂 浮 于 液 氮 表 面, 而 是 沉 入 底 部, 冷 冻 充 分 ; 2) 提 高 了 降 温 的 速 度 1) 增 加 热 交 换 速 度, 极 大 地 提 高 了 冷 冻 速 度 ; 2) 微 滴 无 菌 操 作 提 高 冷 冻 速 率, 使 其 尽 快 通 过 危 险 温 度 区 域 降 温 速 度 快 且 均 衡 缺 点 disadvanta ge 导 热 性 能 差 未 封 口, 容 易 污 染 ; 在 超 低 温 条 件 下, 其 易 断 裂, 造 成 卵 母 细 胞 或 者 胚 胎 的 丢 失 操 作 过 程 复 杂 1) 操 作 繁 琐 ; 成 本 高 容 积 Volume 降 温 速 度 Cooling rate 0.25ml 2000 /min 1-2μl ( 内 径 0.8-1mm; 壁 厚 0.08mm ) mm 一 滴 冷 冻 液, 约 6μl 小 体 积 冷 冻 液, 小 于 1μl 尼 龙 环 直 径 mm /min; ( 细 管 法 的 10 倍 ) 大 于 /min LN 2 中 3000 /min; 液 氦 中 /min 牛 的 卵 母 细 胞 和 囊 胚 Lane et al ) 容 易 引 起 污 染 ; 3) 相 对 保 存 较 少 卵 母 细 胞 或 胚 胎, 应 用 不 广 泛 6

21 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 1.4 冷 冻 保 护 剂 抗 冻 保 护 剂 是 指 在 冷 冻 过 程 中 作 用 于 细 胞, 帮 助 其 有 效 抵 抗 低 温 或 超 低 温 伤 害 的 溶 液 因 此 合 理 选 择 抗 冻 保 护 剂 和 配 比 至 关 重 要 (Rall et al 1985) 冷 冻 保 护 剂 的 选 择 一 般 要 遵 循 一 定 的 原 则 : 主 要 为 (1) 保 护 效 果 好, 能 降 低 卵 母 细 胞 在 降 温 和 复 温 过 程 中 的 损 伤, 提 高 卵 母 细 胞 的 复 活 率 (2) 具 有 毒 性 的 保 护 剂 便 于 洗 脱, 对 卵 母 细 胞 无 毒 或 低 毒 (3) 挥 发 性 小, 易 溶 于 水 ( 王 珂 2008) 常 用 保 护 剂 有 :1 细 胞 内 液 抗 冻 保 护 剂 ( 渗 透 性 物 质 )( 表 1-3);2 细 胞 外 液 抗 冻 保 护 剂 ( 非 渗 透 性 和 大 分 子 物 质 ), 有 二 糖 单 糖 和 多 糖 等 ( 表 1-4) 关 于 渗 透 性 冷 冻 保 护 剂 的 毒 性,2011 年 Edyta A.Szurek 和 Ali Eroglu(Edyta et al 2011), 研 究 表 明, 将 小 鼠 成 熟 卵 母 细 胞 分 别 置 于 含 有 1.5 mol/l DMSO EG 或 PROH 的 PBS 中, 室 温 处 理 15min 后,PROH 组 与 前 两 组 相 比 卵 母 细 胞 退 化 严 重, 易 诱 发 孤 雌 生 殖, 而 提 高 处 理 温 度 到 37, 差 异 更 明 显, 只 有 15% 的 成 活 率, 而 前 两 组 之 间 差 异 不 显 著 ; 但 是 降 低 PROH 浓 度 到 0.75mol/L 并 与 DMSO 等 量 联 合 使 用, 其 效 果 优 于 单 独 使 用 DMSO 组, 实 验 表 明 低 剂 量 使 用 PROH, 并 与 其 他 冷 冻 保 护 剂 联 合 使 用 可 降 低 毒 性 提 高 冷 冻 效 果 7

22 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 表 1-4 渗 透 性 抗 冻 保 护 剂 种 类 和 特 征 (Table 1-4 The types and characteristics of permeability cryoprotectants) 保 护 剂 种 类 (Types of protective agent) 甘 油 (Glycerol) 二 甲 基 亚 砜 (DMSO) 丙 二 醇 (PROH) 乙 二 醇 (EG) 主 要 优 点 (The main advantages) 最 早 发 现 应 用 广 泛 粘 性 大 容 易 形 成 玻 璃 态 ; 与 EG 配 比 使 用, 防 止 解 冻 时 出 现 脱 玻 璃 化 现 象 细 胞 质 被 变 为 无 定 型 状 态 ; 提 高 细 胞 膜 的 渗 透 性 毒 性 在 这 几 种 渗 透 性 保 护 剂 中 是 最 小 的, 而 且 渗 透 性 强, 解 冻 后 也 容 易 脱 除 出 来 主 要 缺 点 (The main disadvantage) 分 子 量 较 大, 通 过 细 胞 膜 时 易 造 成 膜 损 伤, 对 胚 胎 毒 性 大, 形 成 玻 璃 化 的 能 力 较 差 常 温 下 稍 有 毒 性 一 般 应 用 (General application) 精 子 和 胚 胎 的 程 序 化 冷 冻 卵 母 细 胞, 精 子 或 胚 胎 的 冷 冻 相 对 分 子 量 (Relat ive molec ular weigh t) 参 考 文 献 (References) 92.1 Polge et al 1949; 刘 海 军 等 周 崇 等 2003 冷 冻 效 果 差 胚 胎 超 低 温 冷 冻 76.1 Van et al 1995 形 成 玻 璃 化 能 力 较 差 1) 管 内 解 冻 的 方 法 首 选 抗 冻 保 护 剂 ; 2) 小 鼠 大 鼠 兔 牛 羊 胚 胎 冷 冻 ; Kasai et al 1992; Pedro et al 1996; Pugh et al 2000 乙 酰 胺 (Acetamide) 对 细 胞 的 化 学 毒 性 较 大, 多 与 DMSO 联 合 使 用 于 程 序 化 冷 冻 Nakagata et al

23 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 表 1-5 非 渗 透 性 抗 冻 保 护 剂 的 主 要 种 类 和 特 征 (Table 1-5 The types and characteristics of impermeable cryoprotectants) 保 护 剂 种 类 (Types of protective 主 要 作 用 (Main role) 主 要 优 点 (The main advantages) 主 要 缺 点 (The main disadvantage 相 对 分 子 量 (Relative molecular 参 考 文 献 (References) agent) ) weight) 蔗 糖 (sucrose) 葡 萄 糖 (glucose) 海 藻 糖 (trehalose) 分 子 量 大, 不 能 透 过 细 胞 膜, 冷 冻 时 使 细 胞 脱 水, 避 免 胞 内 冰 晶 生 成 应 用 最 多, 具 有 脱 毒 作 用, 调 解 渗 透 压 有 较 好 脱 毒 作 用 调 解 渗 透 压, 有 一 定 的 营 养 作 用, 具 有 较 好 的 玻 璃 化 特 性 较 高 温 度 时 对 胚 胎 有 害 Pedro et al 1996 ; Kasai et al 1990; Kasai et al. 1992; Yoshino et al 1993 聚 蔗 糖 (ficoll) 牛 血 清 白 蛋 白 (BSA) 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 (PVP) 降 低 渗 透 性 抗 冻 保 护 剂 的 浓 度, 减 少 毒 害 损 伤, 解 冻 时 改 变 冰 晶 大 小, 降 低 对 膜 的 伤 害 对 细 胞 毒 性 小 有 助 于 形 成 玻 璃 态 源 于 动 物 制 品, 可 能 会 造 成 样 品 污 染 kD Kasai et al 1990; Rall and Fahy et al 海 藻 糖 在 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 中 的 应 用 如 前 面 所 述, 玻 璃 化 冷 冻 成 功 的 关 键 与 溶 液 有 很 大 关 系 细 胞 内 液 和 外 液 通 过 一 定 的 比 例 组 合 在 一 起 使 用 可 避 免 劣 势, 加 大 发 挥 各 个 溶 液 的 优 势 作 用, 达 到 更 好 的 保 护 目 的 目 前 常 将 EG 和 DMSO 联 合 使 用,Gautam 等 (Gautam et al 2008) 用 玻 璃 化 冷 冻 保 护 剂 进 行 慢 速 冷 冻 牛 卵 细 胞 时, 发 现 EG 和 DMSO 混 合 物 是 一 种 有 效 冷 冻 保 护 剂, 可 以 提 高 卵 细 胞 存 活 率 卵 裂 率 及 囊 胚 形 成 率 而 对 于 渗 透 性 保 护 9

24 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 剂, 糖 类 类 似 蔗 糖, 葡 萄 糖 也 一 直 为 大 家 广 泛 应 用 但 是 海 藻 糖 作 为 新 近 发 现 的 糖 类, 这 种 被 科 学 界 称 作 生 命 之 糖 的 21 世 纪 新 型 糖 类, 也 逐 渐 成 为 研 究 重 点 2.1 海 藻 糖 的 结 构 和 性 质 海 藻 糖 (trehalose, α-d-glucopyranosyl-a-glucopyranoside, 图 1-2) 最 初 由 Wiggers 于 1832 年 从 黑 麦 的 麦 角 菌 中 分 离 到 (Timasheff et al 1993), 是 一 种 非 还 原 性 双 糖, 由 两 个 葡 萄 糖 基 分 子 通 过 半 缩 醛 基 缩 合 而 成 ; 在 自 然 界 中 存 在 于 大 多 数 生 物 或 者 微 生 物 体 内, 尤 其 是 处 于 极 端 条 件 下 的 生 命 体 内, 虽 然 它 作 为 双 糖 分 子 结 构 等 类 似 于 其 他 糖 类, 但 是 却 与 之 不 同 的 是 海 藻 糖 能 对 一 些 生 物 活 性 物 质 起 到 保 护 作 用, 尤 其 是 极 端 条 件 下 可 以 在 生 物 体 的 细 胞 膜 表 面 形 成 玻 璃 状 保 护 层, 保 护 蛋 白 质 等 分 子 不 变 性 失 活, 以 提 高 生 命 体 的 耐 受 性, 创 造 生 命 奇 迹 图 1-2. 海 藻 糖 的 分 子 结 构 (Figure 1-2 The molecμlar structure of the trehalose) 2.2 海 藻 糖 在 哺 乳 动 物 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 中 的 应 用 Trehalose 作 为 糖 类 的 一 种, 与 其 他 糖 类 一 样, 首 先 多 应 用 于 食 品 工 业, 其 次, 因 为 它 有 对 生 命 体 其 保 护 作 用 的 特 殊 性 质, 也 被 研 究 应 用 于 医 药 和 化 妆 品 行 业 同 时 在 哺 乳 动 物 卵 母 细 胞 的 超 低 温 冷 冻 方 面 也 有 重 要 发 展, 下 面 将 做 简 要 介 绍 : 人 卵 母 细 胞 的 冷 冻 保 存 相 对 其 他 哺 乳 动 物,Trehalose 用 于 人 卵 母 细 胞 的 冷 冻 要 广 泛 的 多, 研 究 表 明, 其 可 显 著 提 高 冷 冻 过 程 中 卵 母 细 胞 的 冷 冻 耐 受 性 2000 年, 美 国 哈 佛 大 学 Eroglu 等 将 人 卵 母 细 胞 分 为 三 组 : 第 一 组 空 白 对 照, 第 二 组 放 入 0.5mol/L Trehalose 溶 液 中, 第 三 组 通 过 胞 内 注 射 的 方 式 注 入 0.15mol/L Trehalose, 随 后 再 将 其 放 入 10

25 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 0.5mol/L 的 Trehalose 溶 液 中 上 述 三 组 的 卵 母 细 胞 均 放 入 -15 环 境 中 进 行 冷 冻 保 存 实 验, 结 果 显 示, 卵 母 细 胞 经 过 统 一 低 温 冷 冻 刺 激 后, 对 照 组 卵 母 细 胞 存 活 率 仅 仅 为 13%, 而 第 二 组 和 第 三 组 成 活 率 分 别 显 著 提 高 到 22% 和 63%, 充 分 显 示 了 海 藻 糖 有 帮 助 细 胞 抵 抗 低 温 的 优 越 性, 但 是 进 一 步 降 低 保 存 温 度 时, 所 有 细 胞 均 发 生 死 亡, 说 明 单 靠 海 藻 糖 抵 抗 超 低 温 环 境 还 是 不 能 实 现 的 (Eroglu et al 2000) 2009 年,Eroglu 又 做 了 人 卵 母 细 胞 的 玻 璃 化 冷 冻 实 验, 研 究 发 现 联 合 使 用 均 为 0.5mol/L 的 海 藻 糖 和 DMSO, 卵 母 细 胞 复 苏 后 获 得 较 高 的 成 活 率, 而 与 新 鲜 卵 母 细 胞 比 在 受 精 率 和 胚 胎 发 育 率 上 无 统 计 学 差 异 (Eroglu et al 2009) 羊 卵 母 细 胞 的 冷 冻 保 存 2002 年,Al-aghbari 等 研 究 绵 羊 卵 巢 组 织 玻 璃 化 冷 冻 后 的 存 活 状 况 时 对 卵 丘 卵 母 细 胞 复 合 体 (COCs) 进 行 了 冷 冻, 冷 冻 液 含 0.4 mol/l 海 藻 糖, 解 冻 液 含 0.3 mol/l 的 海 藻 糖, 成 熟 培 养 后 测 成 熟 率 和 HE 染 色 观 察 核 与 染 色 质 结 构 变 化, 冷 冻 的 COCs 与 新 鲜 COCs 相 比, 成 熟 率 (88% vs 90%) 和 结 构 变 化 均 差 异 不 显 著 (Al-aghbari et al 2002) 2007 年 Berlinguer 等 将 海 藻 糖 加 入 成 熟 培 养 液 中 后 冷 冻 绵 羔 羊 卵 母 细 胞, 发 现 用 海 藻 糖 添 加 的 与 未 使 用 海 藻 糖 对 照 组 比, 受 精 率 (92.5% vs 91.1%) 卵 裂 率 (95.4% vs 96.1%) 囊 胚 形 成 率 (13% vs 14.3%) 无 明 显 差 异, 但 利 用 碘 化 丙 啶 ( propidium iodid, PI) 对 细 胞 染 色 发 现, 海 藻 糖 组 细 胞 完 整 性 明 显 高 于 对 照 组 (Berlinguer et al 2007), 说 明 在 稳 定 细 胞 膜 的 结 构 冷 冻 和 复 苏 过 程 中 的 发 育 潜 能 方 面, 海 藻 糖 具 有 积 极 的 作 用 猪 卵 母 细 胞 的 冷 冻 保 存 Somfai 分 别 在 和 2010 年 报 道, 运 用 Trehalose 对 猪 MII 期 卵 母 细 胞 受 精 卵 GV 期 对 进 行 SSV 玻 璃 化 冷 冻, 均 得 到 了 囊 胚 (Tamas and Somfai et al 2006;Somfai et al 2009; Somfai T et al 2010) 而 Linlin (Linlin et al 2009) 用 Trehalose 处 理 猪 的 MII 期 卵 母 细 胞, 冷 冻 复 苏 后 得 到 了 9%±3% 的 囊 胚 率 2010 年 陆 文 昊 等 比 较 Trehalose 对 猪 MII 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 的 影 响, 发 现 实 验 组 与 对 照 组 在 卵 母 细 胞 发 育 潜 力 方 面 无 显 著 差 异,Trehalose 可 以 代 替 蔗 糖 发 挥 保 护 作 用 ( 陆 文 昊 2010) 11

26 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 小 鼠 卵 母 细 胞 的 冷 冻 Trehalose 应 用 于 小 鼠 卵 母 细 胞 的 研 究 比 胚 胎 少 2005 年 Eroglu 等 将 Trehalose 注 射 进 入 小 鼠 卵 母 细 胞 内, 证 实 Trehalose 冷 冻 卵 母 细 胞 的 可 行 性, 解 冻 后 胞 内 Trehalose 可 以 在 发 生 卵 裂 时 转 化 成 单 糖 如 葡 萄 糖 等 供 其 利 用, 对 卵 母 细 胞 没 有 任 何 毒 害 作 用 (Eroglu et al 2005) 随 后 其 又 胞 内 胞 外 同 时 使 用 低 浓 度 Trehalose 并 联 合 DMSO 处 理 小 鼠 卵 母 细 胞 进 行 冷 冻, 取 得 很 大 成 功, 获 得 高 成 活 率, 发 育 能 力, 并 获 得 健 康 后 代 (Eroglu et al 2009) 2009 年, 王 念 念 在 其 基 础 上 利 用 渗 透 压 方 法 使 Trehalose 进 入 细 胞 内 部 即 将 小 鼠 卵 母 细 胞 置 于 高 浓 度 的 Trehalose 溶 液 中 孵 育, 孵 育 3h 后 卵 母 细 胞 冻 融 后 与 对 照 组 相 比, 虽 然 2- 细 胞 形 成 率 有 显 著 差 异, 但 是 其 成 活 率 和 囊 胚 率 没 有 显 著 差 异 说 明 Trehalose 不 仅 限 于 作 为 细 胞 外 液 抗 冻 保 护 剂, 通 过 一 定 方 法 使 Trehalose 进 入 胞 内 作 为 细 胞 内 液 抗 冻 保 护 剂 发 挥 作 用 也 能 起 到 冷 冻 保 护 效 果 ( 王 念 念 2009) 2011 年 Gabriel L 等 人 在 常 规 含 有 蔗 糖 的 冷 冻 保 护 剂 中 加 入 辅 助 性 的 Trehalose 对 小 鼠 卵 母 细 胞 进 行 冷 冻, 冻 融 后 卵 母 细 胞 经 IVM 和 IVF 后, 将 仅 仅 发 育 到 2- 细 胞 的 胚 胎 移 植 入 小 鼠 体 内, 成 功 获 得 了 小 鼠 后 代, 并 且 后 代 具 有 正 常 的 生 殖 能 力 进 一 步 证 明 海 藻 糖 作 为 冷 冻 保 护 剂 的 优 越 性, 并 且 首 次 验 证 冷 冻 卵 母 细 胞 受 精 获 得 的 早 期 胚 胎 便 可 移 植 入 体 内 产 生 健 康 后 代 (Gabriel et al 2011) 水 牛 卵 母 细 胞 的 冷 冻 保 存 1996 年,Suzuki 等 在 常 用 的 保 护 剂 中 加 入 海 藻 糖, 当 浓 度 为 5mmol/L- 100mmol/L 时 能 大 大 提 高 冷 冻 解 冻 后 的 牛 卵 母 细 胞 受 精 率 (Suzuki et al 1996) 2007 年, 意 大 利 Bianca 等 于 冷 冻 液 和 解 冻 液 中 添 加 了 Trehalose 后 对 水 牛 MII 期 卵 母 细 胞 进 行 冻 融 实 验, 随 后 经 体 外 受 精 后 获 得 了 26% 的 分 裂 率 (Bianca et al 2007) 冷 冻 水 牛 卵 丘 卵 母 细 胞 复 合 体 (COCs), 冷 冻 液 添 加 0.4 mol/l Trehalose, 解 冻 液 中 包 含 0.3 mol/l Trehalose, 经 IVM 和 IVF 后 检 测 发 育 指 标, 并 第 一 次 得 到 了 囊 胚, 说 明 了 Trehalose 不 仅 有 助 于 对 卵 母 细 胞 冷 冻 的 保 护 作 用, 而 且 其 对 其 后 期 发 育 同 样 有 积 极 作 用 ; 同 时 发 现 Trehalose 对 维 持 细 胞 膜 的 稳 定 性 同 样 具 有 非 常 积 极 的 作 用 2008 年 广 西 大 学 陈 玉 博 士 也 研 究 了 Trehalose 对 水 牛 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 保 存 的 效 果, 实 验 表 明 Trehalose 相 较 蔗 糖, 虽 然 统 计 学 上 二 者 之 间 差 异 不 显 12

27 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 著, 但 证 明 了 Trehalose 能 提 高 水 牛 卵 母 细 胞 的 存 活 率 及 后 续 发 育 能 力, 并 且 Trehalose 作 为 解 冻 液 去 除 防 冻 剂 的 作 用 明 显 优 于 蔗 糖 ( 陈 玉 2007) 3 氯 化 胆 碱 在 胚 胎 或 卵 母 细 胞 冷 冻 中 的 应 用 及 优 势 3.1 氯 化 胆 碱 在 胚 胎 和 配 子 冷 冻 中 的 应 用 溶 解 渗 透 性 冷 冻 保 护 剂 和 非 渗 透 性 冷 冻 保 护 剂 的 母 液, 又 称 作 缓 冲 介 质, 一 般 应 用 磷 酸 盐 缓 冲 溶 液 (DPBS), 主 要 成 分 为 NaCl,KCl,Na 2 HPO 4, KH 2 PO 4, 钠 离 子 为 主 要 离 子 1998 年,Stackecki 等 对 小 鼠 卵 母 细 胞 进 行 冻 存 时 发 现 母 液 中 的 钠 盐, 对 卵 母 细 胞 有 一 定 的 危 害, 他 选 用 胆 碱 取 代 钠 盐, 明 显 降 低 了 细 胞 损 伤 (Stachecki et al 1998) 而 在 人 类 的 卵 母 细 胞 程 序 化 冷 冻 过 程 中, 应 用 以 氯 化 胆 碱 代 替 氯 化 钠 的 改 良 性 的 mpbs 为 缓 冲 介 质, 获 得 了 更 高 的 存 活 率 (25% vs 63%) 和 继 续 发 育 能 力 (0 vs 59%), 以 氯 化 胆 碱 为 母 液 的 冷 冻 液 冷 冻 后 的 卵 母 细 胞 受 精 后 胚 胎 移 植 到 11 名 妇 女 体 内, 其 中 4 人 顺 利 妊 娠 并 且 有 5 个 婴 儿 健 康 出 生 (Jeffrey et al 2003;Quintans et al 2002) 国 内 的 王 雁 林 等 研 究 人 胚 胎 的 冷 冻, 比 较 了 mpbs 和 DPBS 对 胚 胎 玻 璃 化 冷 冻 效 果 的 影 响, 胚 胎 存 活 率 (91.5% vs 88.1%) 方 面 统 计 学 上 没 有 发 现 二 者 之 间 有 显 著 性, 但 有 提 高 存 活 率 的 趋 势, 并 且 显 著 减 轻 了 冷 冻 对 胚 胎 活 性 的 影 响, 说 明 mpbs 比 DPBS 更 适 用 于 玻 璃 化 冻 融 胚 胎 ( 王 雁 林 2006) 3.2 卵 母 细 胞 冷 冻 液 母 液 中 氯 化 胆 碱 替 代 氯 化 钠 的 优 势 原 因 从 生 理 学 和 低 温 医 学 的 角 度 分 析 mpbs 比 DPBS 更 适 宜 卵 母 细 胞 和 胚 胎 冷 冻 的 原 因, 主 要 表 现 为 以 下 两 个 方 面 :1 应 用 传 统 PBS 液 对 细 胞 或 者 胚 胎 进 行 冻 存, 胞 外 是 高 钠 环 境, 并 且 细 胞 膜 随 着 温 度 的 降 低 通 透 性 逐 步 增 强, 使 得 钠 离 子 通 过 胞 膜 上 的 钠 通 道 进 入 细 胞 内, 而 钠 - 钾 泵 在 低 温 环 境 下 受 到 损 伤, 复 苏 时 便 不 能 有 效 地 将 钠 离 子 从 细 胞 内 泵 出, 导 致 胞 质 内 钠 离 子 堆 积, 进 而 使 得 细 胞 内 蛋 白 质 发 生 变 性 反 应, 同 时 高 渗 透 压 又 使 得 过 多 水 分 子 进 入 细 胞 内, 破 坏 了 细 胞 原 有 的 水 盐 平 衡 而 氯 化 胆 碱 属 于 非 渗 透 性 分 子, 从 而 避 免 了 细 胞 内 阳 离 子 堆 积 引 起 的 溶 液 损 伤 ; 2 氯 化 胆 碱 具 有 稳 定 细 胞 膜 的 作 用, 从 而 提 高 冻 融 细 胞 的 存 活 率 ( 王 雁 林 2006; Stachecki et al 1998) 13

28 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 4 玻 璃 化 冷 冻 对 卵 母 细 胞 结 构 细 胞 器 和 发 育 潜 力 的 影 响 在 人 们 对 玻 璃 化 冷 冻 研 究 逐 步 加 深 的 过 程 中, 人 们 已 经 从 传 统 的 通 过 改 变 冷 冻 液 配 方 和 提 高 冷 冻 中 降 温 速 率 等 手 段 方 面 向 研 究 卵 母 细 胞 超 低 温 冷 冻 过 程 中 的 机 理 和 造 成 损 伤 的 因 素 等 方 面 转 变, 进 一 步 研 究 卵 母 细 胞 超 低 温 冷 冻 过 程 中 的 机 理 和 造 成 损 伤 的 因 素, 从 而 采 取 针 对 性 的 措 施 显 得 尤 其 重 要 玻 璃 化 冷 冻 主 要 导 致 卵 母 细 胞 的 损 伤 主 要 集 中 在 以 下 几 个 方 面 ( 表 1-6)( 史 文 清 2006) 4.1 玻 璃 化 冷 冻 对 卵 母 细 胞 细 胞 骨 架 及 染 色 体 的 影 响 微 管 主 要 参 与 纺 锤 体 的 形 成, 其 引 导 着 细 胞 器 和 染 色 体 的 分 布, 但 是 微 管 对 外 界 环 境 条 件 的 波 动 特 别 敏 感, 尤 其 是 温 度 的 变 化, 如 低 温 条 件 下 能 引 起 微 管 的 解 聚 1996 年,Aman 等 研 究 了 牛 IVM 的 卵 母 细 胞 纺 锤 体 冻 融 后 的 变 化, 结 果 表 明 : 处 理 组 ( 置 于 4 ) 与 对 照 组 ( 置 于 39 ) 相 比, 纺 锤 体 形 态 明 显 发 生 变 化 并 且 伴 有 退 化 或 缺 乏 的 现 象 (Aman et al 1996) 微 管 的 解 聚 不 仅 对 纺 锤 体 的 形 成 有 重 要 影 响, 而 且 纺 锤 体 移 位 后 使 细 胞 内 染 色 体 组 成 发 生 变 化, 形 成 非 整 倍 体 或 多 倍 体 2005 年 Diezc 等 研 究 表 明, 牛 卵 母 细 胞 经 过 冷 冻 解 冻 后, 因 为 中 心 粒 周 围 微 管 组 织 中 心 缺 乏, 纺 锤 体 组 装 受 阻, 从 而 使 得 染 色 体 发 生 移 位 缺 失, 形 成 非 整 倍 体 而 卵 母 细 胞 正 常 的 受 精 和 发 育 很 大 程 度 依 赖 于 细 胞 骨 架, 微 丝 的 影 响 也 是 其 中 之 一, 冷 却 还 可 以 引 起 纺 锤 体 邻 近 微 丝 骨 架 的 变 化 (Diezc et al 2005) 1999 年,Saunders 等 再 对 牛 体 外 成 熟 卵 母 细 胞 解 冻 后 报 道 : 卵 母 细 胞 微 丝 正 常 分 布 率 (31%) 显 著 低 于 新 鲜 对 照 组 (62%-89%), 而 且 微 丝 的 异 常 分 布 不 能 够 通 过 复 温 得 到 恢 复 (Saunders et al 1999) 14

29 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 表 1-6 冷 冻 保 存 可 能 引 起 卵 母 细 胞 损 伤 或 者 死 亡 的 相 关 因 素 (Table 1-6 Factors associated with cryopreservation that contribute to cellμlar injury and death) 影 响 部 位 损 伤 类 型 整 个 细 胞 细 胞 内 外 冰 晶 形 成, 线 粒 体 分 布 变 化,ATP 水 平 变 化 细 胞 膜 细 胞 膜 变 化, 钙 波 动, 提 前 孤 雌 激 活 卵 周 隙 消 失, 膜 破 裂, 融 和 微 绒 毛 消 失, 膜 相 改 变 染 色 体 DNA 细 胞 骨 架 蛋 白 和 酶 超 微 结 构 缺 失, 移 位, 非 整 倍 体 多 精 受 精, 多 倍 体 凋 亡, 融 和,DNA 重 组 微 管 解 聚, 纺 锤 体 退 化 或 消 失, 微 丝 解 聚 脱 水, 功 能 散 失 质 膜 内 陷, 破 裂, 线 粒 体 嵴 消 失, 囊 泡 变 形, 融 合, 皮 质 颗 粒 减 少, 提 前 释 放 脂 肪 颗 粒 透 明 带 形 态 变 化, 分 布 不 均 变 硬, 破 裂, 卵 周 隙 变 化 4.2 玻 璃 化 冷 冻 对 卵 母 细 胞 细 胞 膜 的 影 响 细 胞 膜 的 完 整 性 是 细 胞 存 活 的 前 提, 而 且 受 精 时 还 参 与 了 精 卵 质 膜 的 融 合, 影 响 受 精 和 胚 胎 正 常 发 育, 因 此 细 胞 膜 的 完 整 与 否 关 系 重 大, 而 冷 冻 会 造 成 细 胞 膜 的 损 伤, 其 原 因 主 要 有 以 下 三 个 方 面, 一 是 卵 母 细 胞 在 冷 冻 和 解 冻 时, 会 有 渗 透 压 的 急 剧 变 化, 由 此 引 起 的 细 胞 过 度 皱 缩 或 膨 胀 会 对 细 胞 膜 不 可 逆 的 致 命 伤 害 ; 二 是 冷 冻 过 程 中 大 量 水 和 抗 冻 保 护 剂 快 速 通 过 细 胞 膜, 破 坏 膜 上 的 钠 泵 和 蛋 白 结 构, 还 有 就 是 细 胞 内 外 冰 晶 的 形 成 等 对 其 造 成 的 机 械 性 损 伤, 此 外 细 胞 处 于 抗 冻 保 护 剂 中, 化 学 保 护 剂 对 细 胞 膜 也 会 造 成 的 化 学 伤 害 4.3 玻 璃 化 冷 冻 对 卵 母 细 胞 透 明 带 的 影 响 正 常 受 精 过 程 中 精 子 发 生 顶 体 反 应, 释 放 出 一 系 列 的 蛋 白 酶 用 于 穿 透 卵 丘 细 胞, 溶 解 透 明 带, 并 诱 发 透 明 带 反 应 和 皮 质 反 应, 防 止 多 精 受 精 (Wininger et al 2002), 透 明 带 是 精 卵 结 合 的 必 经 之 路, 而 在 冷 冻 过 程 中, 透 明 带 由 于 缩 水, 引 起 未 受 精 的 卵 母 细 胞 提 前 发 生 皮 质 反 应, 透 明 带 变 硬, 影 响 受 精 冷 冻 还 破 坏 透 明 带 15

30 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 上 的 糖 蛋 白 结 构, 结 果 是 蛋 白 酶 溶 解 透 明 带 时 间 增 长, 进 一 步 增 加 了 精 子 穿 透 透 明 带 的 难 度, 倒 置 卵 母 细 胞 的 受 精 率 下 降 ( 冯 怀 亮 等 1995); 因 此 Azambuja 等 认 为 冷 冻 对 透 明 带 的 影 响 是 造 成 冻 融 后 卵 母 细 胞 受 精 率 降 低 的 原 因 之 一 (Azambuja et al 2009) 4.4 玻 璃 化 冷 冻 对 卵 母 细 胞 线 粒 体 的 影 响 作 为 为 细 胞 提 供 能 量 的 重 要 细 胞 器, 线 粒 体 是 产 生 ATP 和 维 持 细 胞 活 力 的 重 要 的 功 能 单 位, 细 胞 内 环 境 的 稳 定 与 发 育 离 不 开 线 粒 体 正 常 功 能 的 维 持 研 究 发 现, 冷 冻 也 会 对 线 粒 体 的 形 态 发 生 变 化 2001 年, 刘 海 军 玻 璃 化 冷 冻 山 羊 卵 母 细 胞 发 现 线 粒 体 结 构 因 为 冷 冻 而 发 生 改 变, 在 电 镜 下 观 察 明 显 看 到 线 粒 体 嵴 变 得 模 糊 不 清 或 发 生 不 规 则 扩 张 尤 其 是 GV 期 表 现 突 出, 受 损 严 重 ( 刘 海 军 等 2001) Fuku 等 也 发 现, 经 玻 璃 化 冷 冻 的 牛 未 成 熟 卵 母 细 胞 线 粒 体 受 到 严 重 破 坏,GV 期 卵 母 细 胞 对 超 低 温 的 敏 感 性 比 IVM 期 更 高 另 外, 前 面 已 经 叙 述 冷 冻 对 微 管 结 构 有 所 损 失, 而 线 粒 体 的 运 动 和 分 布 离 不 开 微 管 的 作 用, 因 此, 冷 冻 会 使 线 粒 体 分 布 紊 乱, 结 构 改 变, 进 而 影 响 ATP 的 供 应 水 平, 影 响 卵 母 细 胞 的 发 育 潜 力 (Fuku et al 1995) 4.5 玻 璃 化 冷 冻 对 卵 母 细 胞 的 分 子 损 伤 的 影 响 冷 冻 对 卵 母 细 胞 的 分 子 水 平 上 的 损 伤, 主 要 表 现 为 DNA 损 伤, 以 及 相 关 基 因 mrna 表 达 的 异 常 等 Men 等 检 测 了 牛 MII 期 卵 母 细 胞 经 过 慢 速 冷 冻 0.25ml 细 管 法 冷 冻 和 OPS 冷 冻 后 DNA 的 损 伤 情 况 结 果 表 明, 与 新 鲜 对 照 组 相 比, 只 要 经 过 冷 冻 均 会 带 来 了 显 著 的 DNA 损 伤, 而 三 种 冷 冻 方 法 相 比, 慢 速 冷 冻 和 OPS 法 冷 冻 比 细 管 法 冷 冻 对 卵 母 细 胞 DNA 损 伤 更 严 重 (Men et al 2003),Succu 等 研 究 IVM 后 绵 羊 卵 母 细 胞 经 冻 融 后 体 外 受 精 得 到 的 早 期 胚 胎 的 发 育 能 力 及 mrna 量 变 化 通 过 RT-PCR 方 法 分 析 对 照 组 和 冷 冻 解 冻 组 中 的 B 蛋 白 H2A.Z 组 蛋 白 Poli APolimerase(PAP) Heat Shock Protein 90beta(HSP90beta) P34(CDC2) Cyclinb Na/K-ATPase 和 Type I cadherin(e.cad) 的 转 录 水 平, 发 现 冻 融 组 这 些 基 因 的 表 达 量 均 明 显 低 于 对 照 组, 与 卵 母 细 胞 体 外 受 精 后 的 卵 裂 率 和 囊 胚 率 联 系 后 推 测 mrna 低 水 平 的 表 达 量 可 能 是 导 致 胚 胎 早 期 发 育 水 平 低 的 一 个 重 要 原 因 (Succu et al 2008) 16

31 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 卵 母 细 胞 在 冻 融 过 程 中, 都 要 经 历 温 度 和 渗 透 压 的 急 剧 变 化, 如 前 面 所 述, 这 些 变 化 对 卵 母 细 胞 无 论 是 透 明 带 细 胞 膜 微 管 微 丝 还 是 细 胞 器 甚 至 是 DNA 或 者 mrna 的 表 达 量 等 方 面 都 会 造 成 一 定 程 度 的 损 伤, 进 而 影 响 卵 母 细 胞 受 精 率 和 受 精 后 胚 胎 的 发 育 能 力 ( 唐 业 刚 2006) 5 本 实 验 的 研 究 目 的 及 意 义 基 于 以 上 文 献 综 述, 本 研 究 提 出 以 下 研 究 设 想 : (1) 以 不 同 浓 度 梯 度 的 海 藻 糖 作 为 非 渗 透 性 冷 冻 保 护 剂 替 代 常 规 玻 璃 化 冷 冻 保 护 剂 中 蔗 糖, 研 究 新 的 冷 冻 液 对 黄 牛 GV 期 卵 母 细 胞 的 冷 冻 效 果, 探 索 替 代 的 可 能 性 及 最 适 浓 度 ; (2) 通 过 荧 光 染 色 检 测 卵 母 细 胞 各 个 时 期 的 凋 亡 情 况, 并 通 过 检 测 凋 亡 和 周 期 基 因 的 mrna 探 究 冷 冻 损 伤 的 机 制 ; (3) 以 氯 化 胆 碱 替 代 氯 化 钠, 探 究 改 良 后 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 (mpbs) 配 制 的 玻 璃 化 冷 冻 液 对 黄 牛 GV 期 卵 母 细 胞 的 冷 冻 效 果 ; (4) 联 合 使 用 海 藻 糖 和 氯 化 胆 碱, 研 究 二 者 在 牛 GV 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 中 的 效 果 基 于 以 上 研 究 内 容, 从 冷 冻 保 存 后 卵 母 细 胞 的 成 活 率 发 育 潜 力 细 胞 器 损 伤 程 度 凋 亡 和 周 期 基 因 相 对 表 达 量 等 方 面 对 该 方 案 的 冷 冻 效 果 进 行 了 评 价 及 机 制 研 究, 得 到 适 宜 的 冷 冻 效 果 好 玻 璃 化 冷 冻 保 存 方 案, 以 期 该 方 案 能 在 提 高 长 距 离 卵 巢 运 输 效 率 和 卵 母 细 胞 利 用 率 有 所 价 值 17

32 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 第 一 章 不 同 浓 度 海 藻 糖 对 牛 GV 期 卵 母 细 胞 冷 冻 的 效 果 1 前 言 从 屠 宰 场 获 得 卵 巢, 获 取 的 卵 母 细 胞 大 多 为 处 于 GV 期 的 未 成 熟 卵 母 细 胞, 这 些 卵 母 细 胞 在 体 外 一 定 条 件 下 经 过 一 段 时 间 ( 一 般 24 小 时 ) 培 养 可 以 用 来 做 体 外 胚 胎 生 产 等 研 究 和 应 用 卵 母 细 胞 所 处 的 阶 段 对 冷 冻 成 功 与 否 至 关 重 要 (Lim et al 1991), 选 取 未 成 熟 的 GV 期 卵 母 细 胞 冷 冻 一 方 面 其 数 量 较 多, 另 一 方 面 对 后 期 培 养 利 用 也 有 优 势 Suzuki 等 用 慢 速 冷 冻 的 方 法 对 GV 期 卵 母 细 胞 进 行 冷 冻 保 存, 体 外 受 精 后 得 到 35.3%-42.2% 的 卵 裂 率 和 1.3%-3.1% 的 囊 胚 率 (Suzuki et al 1996) 近 年 来, 国 内 学 着 围 绕 着 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 做 了 大 量 研 究, 在 分 别 使 用 细 管 法 和 OPS 法 冷 冻 牛 GV 期 卵 母 细 胞 的 研 究 中 结 果 中, 发 现 解 冻 后 IVF 胚 胎 的 卵 裂 率 分 别 达 到 48.2% 和 66.0%, 并 且 OPS 法 得 到 了 囊 胚 ( 包 华 琼 等 2004 年 ; 禹 学 礼 等 2005 年 ) 目 前 对 于 牛 GV 期 卵 母 细 胞 的 冷 冻 多 集 中 在 玻 璃 化 冷 冻 保 护 剂 渗 透 性 保 护 剂 配 比 的 探 索 以 及 如 何 加 快 降 温 速 率 的 方 法 上 面, 在 非 渗 透 性 冷 冻 保 护 剂 和 低 温 冷 冻 损 伤 机 理 方 面 研 究 不 多 海 藻 糖 做 为 新 近 发 现 的 生 命 之 糖, 最 早 因 其 对 生 命 体 的 独 特 保 护 作 用 被 广 泛 应 用 于 食 品 业 医 药 业 以 及 化 妆 品 等 行 业, 后 来 又 作 为 冷 冻 保 护 剂 应 用 于 哺 乳 动 物 卵 母 细 胞 和 胚 胎 的 冷 冻 保 存 中 早 在 1996 年,Suzuki 等 在 进 行 牛 卵 母 细 胞 慢 速 冷 冻 时 发 现, 常 规 保 护 剂 中 加 入 0.05mol/L-0.1 mol/l 的 海 藻 糖 能 显 著 提 高 冻 融 卵 母 细 胞 的 成 熟 率 和 卵 裂 率 (Suzuki et al 1996) 2007 年, 海 藻 糖 应 用 于 水 牛 MII 期 卵 母 细 胞 冷 冻 保 存, 体 外 受 精 后 得 到 了 26% 的 分 裂 率 (Bianca et al 2007) 广 西 大 学 也 研 究 了 Trehalose 对 水 牛 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 保 存 的 效 果, 发 现 Trehalose 能 提 高 水 牛 卵 母 细 胞 的 存 活 率 及 后 续 发 育 能 力 ( 陈 玉 2007) 海 藻 糖 多 用 于 直 接 替 代 常 用 的 蔗 糖 作 为 非 渗 透 性 冷 冻 保 护 剂, 对 其 最 适 浓 度 的 添 加 却 鲜 见 报 道, 因 此 本 实 验 以 常 用 的 塑 料 细 管 为 冷 冻 载 体, 以 蔗 糖 组 为 冷 冻 对 照 组, 分 设 五 种 不 同 梯 度 的 海 藻 糖 浓 度 配 制 玻 璃 化 冷 冻 保 护 剂 对 牛 GV 期 卵 母 细 胞 进 行 玻 璃 化 冷 冻 存 于 液 氮 1-2 周 解 冻 后 以 从 冷 冻 保 存 后 卵 母 细 胞 的 成 活 率 发 育 潜 力 细 胞 器 损 伤 程 度 等 方 面 对 该 方 案 的 冷 冻 效 果 进 行 了 评 价 18

33 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 2 材 料 与 方 法 2.1 材 料 实 验 主 要 用 耗 材 (1) 冷 冻 用 塑 料 细 管 ( 日 本 富 士 平 ) (2) 捡 卵 / 胚 用 毛 细 玻 璃 管 ( 北 京 正 天 易 科 贸 有 限 责 任 公 司 ) (3) 90mm, 60mm, 35mm 规 格 培 养 皿 (Corning) (4) 显 微 镜 载 玻 片 ( 江 苏 世 泰 ) (5) 1.5ml 离 心 管 (Axygen) 主 要 仪 器 设 备 实 验 主 要 仪 器 设 备 如 表 2-1 所 示 表 2-1 实 验 主 要 仪 器 设 备 (Table 2-1 Main equipments) 设 备 名 称 (Equipment name) 倒 置 显 微 镜 荧 光 成 像 系 统 电 子 天 平 CO 2 培 养 箱 实 体 显 微 镜 低 速 离 心 机 电 热 恒 温 水 浴 锅 超 净 工 作 台 立 式 自 动 电 热 压 力 蒸 汽 灭 菌 器 电 热 恒 温 干 燥 箱 超 声 波 清 洗 机 超 纯 水 仪 自 动 双 重 蒸 水 蒸 馏 器 荧 光 定 量 PCR 仪 电 泳 仪 电 泳 槽 型 号 及 产 地 (Type and origin) NIKON TE2000-U ; 日 本 NIKON C-SHG1 ; 日 本 Sartorius; 德 国 HERA CELL ; 德 国 宁 波 舜 宇 仪 器 有 限 公 司 北 京 医 用 离 心 机 厂 DK-S24 型 ; 北 京 长 风 仪 器 仪 表 公 司 HDL APPARATUS ; 北 京 东 联 哈 尔 滨 仪 器 制 造 双 哈 LDZX 一 40B 型 ; 上 海 三 申 医 疗 器 械 重 庆 银 河 试 验 仪 器 有 限 公 司 昆 山 市 超 声 仪 器 有 限 公 司 Millipore ; 法 国 上 海 亚 荣 生 化 仪 器 厂 FDQ48A ; bioer DYY-6C; 北 京 六 一 仪 器 厂 DYC-34A; 北 京 六 一 仪 器 厂 主 要 试 剂 和 药 品 实 验 所 用 主 要 试 剂 和 药 品 如 表 2-2 所 示 19

34 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 表 2-2 主 要 试 剂 与 药 品 来 源 (Table 2-2 main reagents) 试 剂 来 源 货 号 试 剂 来 源 货 号 (Reagent) (Source) (Aritle No.) (Reagent) (Source) (Aritle No.) EGF Peprotech E9644 氯 化 胆 碱 Sigma C β-E2 FSH LH 丙 酮 酸 钠 FCS TCM-199 Hepes EG DMSO Penicillin Hochest33342 Ficoll DPBS Sigma 中 科 院 中 科 院 Sigma Gibco Gibco Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Hyclone E2758 P H3784 E9129 D2650 P3032 B2261 F2878 SH30028B Ionomycin BSA Hyaluronidase EAA NEAA 海 藻 糖 Rh-123 α-chy 蔗 糖 矿 物 油 培 养 液 水 其 它 盐 类 Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma Sigma I9657 A3311 H3506 B6766 M7145 T0167 R8004 C4129 S9378 M8410 W3500 试 验 用 奶 牛 冻 精 购 自 湖 北 省 畜 禽 育 种 中 心, 其 他 化 学 试 剂 除 特 殊 说 明 外 均 购 自 Sigma 公 司 实 验 操 作 液 的 配 制 卵 巢 运 输 液 磷 酸 盐 缓 冲 液 (PBS) 8g NaCl + 1.5g Na2HPO4 7 H2O + 0.2g KCl + 0.2g K H2PO4 + 1L 双 蒸 水, 高 温 高 压 灭 菌, 使 用 之 前 加 入 1% 的 双 抗 (P/S, 购 自 Gibco 公 司 ) 捡 卵 液 捡 卵 液 按 照 表 2-3 进 行 配 制 溶 液 配 制 好 后 用 NaOH 溶 液 调 节 ph 值 为 7.4, 过 滤 灭 菌 4 保 存 备 用 20

35 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 试 剂 (Reagent) 表 2-3 捡 卵 液 配 方 (500ml) (Table 2-3 modified-tl-hepes-pva medium(500ml)) Nacl g Kcl g NaH 2 PO g Na lactate 0.7ml Hepes g Na pyruvate g Sorbitol 1.093g NaHCO g Gentamycin g PVA 0.05g Mgcl 2 6H 2 O g Cacl 2 2H 2 O g 体 外 成 熟 液 (IVM) 存 备 用 用 量 (Dosage) 体 外 成 熟 液 用 表 2-4 配 方 进 行 配 制 溶 液 配 好 后 不 需 调 节 ph, 过 滤 灭 菌 后 4 保 表 2-4 体 外 成 熟 液 配 方 (Table 2-4 Oocyte Mature Medium) 试 剂 (Reagent) 规 格 (Standard) 浓 度 (Concentration) 50ml TCM199 纯 定 容 43.5ml EGF 100ng/μl 50ng/ml 25μl E 2 1mg/ml 1ug/ml 50μl LH 0.05IU/μl 0.5IU/ml 50μl FSH 0.168IU/ μl 0.5IU/ml 50μl FCS 纯 10% 5ml P.S 纯 1% 500 μl Py-Na 11mg/ml 0.22mg/ μl 1 ml 卵 母 细 胞 操 作 液 (OM 液 ) 卵 母 细 胞 操 作 液 用 表 2-5 配 方 进 行 配 配 制 溶 液 配 制 好 后 用 NaOH 溶 液 调 节 ph 值 为 7.2, 过 滤 灭 菌 4 保 存 备 用 21

36 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 表 2-5 卵 母 细 胞 操 作 液 (50ml) (Table 2-5 Oocyte manipulation medium(50ml)) 试 剂 (Reagent) 体 积 (Volume) 备 注 (Remark) Water ml 封 口 无 菌 常 温 保 存 NaCl 2.5ml 1.333g NaCl 溶 于 10ml 水, 过 滤 4 保 存 KCl 1ml g KCl 溶 于 10ml 水, 过 滤 4 保 存 NaHCO3 400μl g NaHCO3 溶 于 10ml 水, 过 滤 4 保 存 NaH2PO4 500μl g NaH2PO4 溶 于 10ml 水, 过 滤 4 保 存 Hepes 500μl 2.38g Hepes 溶 于 10ml 水, 调 PH 为 7.0, 过 滤 4 避 光 保 存 一 个 月 BSA 150mg Pyruvate 80μl g Pyruvate 溶 于 10ml 水, 过 滤 4 避 光 保 存 一 个 月 Lac Na 75μl P/S 500μl CaCl2.2H2O g g CaCl2.2H2O 溶 于 10ml 水, 过 滤 4 保 存 MgCl2.6H2O g g MgCl2.6H2O 溶 于 10ml 水, 过 滤 4 保 存 SP-TL(10 倍 精 子 洗 涤 液 ) 称 取 4.675gNaCl, 0.23gKCl, 0.4g NaH 2 PO 4 H 2 O,2.38g HEPES 定 容 于 100ml 双 蒸 水,pH=7.3, 0.22μm 过 滤,4 保 存 1 个 月 %Percoll(90% 梯 度 离 心 液 ) 量 取 4ml 10 SP-TL 于 50ml 烧 杯, 称 取 0.084g NaHCO 3 于 烧 杯 中,90μl 乳 酸 钠, 搅 匀, 加 入 36ml percoll, 158μl MgCl 和 78μlCaCl 2, ph=7.3~7.45,0.45μm 过 滤,4 保 存 PHE( 精 子 获 能 液 ) 称 取 1.09mg 亚 牛 磺 酸 溶 于 10ml 生 理 盐 水 中, 称 取 3mg 青 霉 素 钠 溶 于 10ml 生 理 盐 水 中, 称 取 1.83mg 肾 上 腺 素 溶 于 40ml 乳 酸 偏 硫 酸 钠 盐 (77μl 的 98% 乳 酸 钠 +50mg 的 S9000 偏 亚 硫 酸 钠 溶 于 50ml 水 ) 中, 再 分 别 取 10ml 亚 牛 磺 酸,10ml 青 霉 素 钠 和 4ml 肾 上 腺 溶 液 于 50ml 烧 杯 中,0.22μm 过 滤, 分 装,-20 避 光 保 存 SP-TALP( 精 子 洗 涤 液 ) SP-TL 基 础 液 +6mg/mLBSA(Frac V)+0.11mg/mL 丙 酮 酸 钠 +0.1% 庆 大 霉 素, 0.22μm 过 滤,4 保 存 22

37 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 IVF-TALP( 受 精 液 ) IVF-TL 基 础 液 +6mg/mLBSA(EFAF)+100μg/mL 丙 酮 酸 钠 +0.1% 庆 大 霉 素, 0.22μm 过 滤,4 保 存 胚 胎 培 养 发 育 液 (SOF) 首 先 配 制 SOF, 最 后 用 NaOH 溶 液 调 节 ph 值 为 7.4, 过 滤 灭 菌 4 保 存 备 用 详 细 配 方 见 下 面 表 格 表 2-6 SOF 胚 胎 发 育 液 (Table 2-6 SOF solution) 试 剂 (Reagent) 货 号 (Aritle No.) 浓 度 (Concentration) 100ml CaCl2.2H2O C mM g MgCl2.6H2O M mM g KH 2 PO 4 P mM g KCl P mM g NaCl S mM g Tri-Na-citrate C mM g Myo-Inositol mM g NaHCO 3 S mM g Na lactate L mM μl EFAF BSA A6003 4mg/ml g ALA-glutamine A8185 1mM 500μl Na pyruvate P mM 1000μl NON-Essential aa M μl/ml 500μl Essential aa B μl/ml 1000μl 冷 冻 液 及 解 冻 液 的 配 制 冷 冻 液 参 照 朱 士 恩 教 授 EDFS40 配 比 并 加 以 改 进 : 1) 冷 冻 基 础 液 VS1:DPBS( 无 钙 镁 离 子, 含 3mg/mlBSA) 中 添 加 10%EG, 10%DMSO,1 0% 的 FBS 和 0.5%P.S 2) 蔗 糖 对 照 组 (0.5M 蔗 糖 组 ): FSF 液 : DPBS( 无 钙 镁 离 子, 含 3mg/mlBSA) 中 添 加 300g/L 的 ficoll70,000, 0.5mol/L 的 蔗 糖,20% 的 FBS 和 1%P.S; 23

38 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 VS2( 蔗 糖 ):60%FSF 液 +20%EG+20%DMSO 3) 海 藻 糖 实 验 组 : FTF 液 :DPBS( 无 钙 镁 离 子, 含 3mg/mlBSA) 中 添 加 300g/L 的 ficoll70.000, 20% 的 FBS,1%P.S 和 五 种 不 同 浓 度 的 海 藻 糖 ; VS2( 海 藻 糖 ):60%FTF 液 +20%EG+20%DMSO ( 海 藻 糖 的 浓 度 分 别 为 1mol/L,0.8mol/L,0.5mol/L,0.3mol/L 和 0.1mol/L, 分 别 记 做 1M 海 藻 糖 组,0.8M 海 藻 糖 组,0.5M 海 藻 糖 组,0.3M 海 藻 糖 组 和 0.1M 海 藻 糖 组 ) 4) 解 冻 液 DPBS( 无 钙 镁 离 子, 含 3mg/mlBSA) 中 添 加 10%FBS, 添 加 三 个 不 同 浓 度 的 海 藻 糖 或 者 蔗 糖, 浓 度 分 别 为 0.5mol/L,0.25mol/L 和 0.1mol/L, 分 别 标 记 A,B,C( 蔗 糖 ) 和 a,b,c( 海 藻 糖 ) 2.2 方 法 卵 巢 的 采 集 卵 巢 采 集 于 武 汉 市 华 强 家 禽 批 发 中 心 的 牛 屠 宰 场 用 37 并 添 加 1% 双 抗 的 PBS 清 洗 采 集 的 卵 巢 后 放 至 含 上 述 PBS 的 保 温 杯 中, 尽 快 送 回 实 验 室, 再 用 PBS 清 洗 数 次 待 用 卵 母 细 胞 的 收 集 将 提 前 准 备 的 捡 卵 液 在 CO 2 培 养 箱 预 热 且 酸 碱 平 衡 2h 以 上, 用 带 有 12# 针 头 的 10ml 注 射 器 吸 取 微 量 捡 卵 液, 选 取 卵 巢 表 面 直 径 为 2~8mm 的 卵 泡, 采 取 负 压 法 抽 出 卵 泡 液, 随 后 将 采 得 的 卵 泡 液 收 集 于 10ml 离 心 管 中, 于 水 浴 锅 中 37 沉 淀 15min, 弃 掉 上 清 卵 泡 液, 吸 取 底 部 沉 淀 至 事 先 画 好 方 格 的 90mm 培 养 皿 盖 中, 并 加 入 适 量 捡 卵 液 稀 释, 挑 选 出 包 裹 有 2 层 及 以 上 卵 丘 细 胞 且 胞 质 均 匀 的 COCs, 将 其 置 于 含 捡 卵 液 的 35mm 培 养 皿 中 待 用 卵 母 细 胞 的 冷 冻 预 处 理 将 挑 选 出 的 COCs 用 含 IVM 液 洗 涤 三 到 四 次, 然 后 将 洗 COCs 移 入 冷 冻 基 础 液 在 加 热 板 (38 ) 上 平 衡 3~5min, 随 后 进 行 装 管 24

39 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 卵 母 细 胞 的 冷 冻 和 解 冻 复 苏 塑 料 细 管 法 的 冷 冻 : 卵 母 细 胞 经 过 冷 冻 基 础 液 的 预 平 衡 以 后, 分 五 段 式 装 管, 依 次 吸 入 0.5 mol/l 蔗 糖 ( 或 海 藻 糖 ) 空 气 蔗 糖 ( 或 海 藻 糖 ) 冷 冻 液 空 气 含 20~25 枚 COCs 的 冷 冻 液 空 气 蔗 糖 ( 或 海 藻 糖 ) 冷 冻 液 空 气 0.5 mol/l 蔗 糖 ( 或 海 藻 糖 )( 如 图 2-1 所 示 ) 然 后 用 烧 烫 的 小 镊 子 密 封 管 口, 贴 上 标 签 信 息, 装 管 封 口 时 间 不 超 过 30s 为 宜, 直 接 投 入 -196 液 氮 中 冷 冻 保 存 最 后 用 烧 烫 的 小 镊 子 封 口, 注 意 封 紧 密, 以 液 柱 保 持 不 动 为 标 准, 随 后 贴 上 标 签 纸, 投 入 -196 液 氮 中 保 持, 保 证 装 管 封 口 过 程 时 间 不 超 过 30s 图 2-1. 细 管 法 玻 璃 化 冷 冻 卵 母 细 胞 装 管 示 意 图 Figure 2-1 Digram of oocytes filling with straw method of vitrification frozen 注 :A: 栓,B:0.5 mol/l 蔗 糖 ( 或 海 藻 糖 ),C: 玻 璃 化 冷 冻 液,D: 含 20~25 枚 COCs 的 玻 璃 化 冷 冻 液 解 冻 : 采 用 非 连 续 性 三 步 法 解 冻 将 在 液 氮 中 保 存 一 周 以 上 含 COCs 的 细 管 从 液 氮 中 取 出, 首 先 在 液 氮 罐 上 层 蒸 汽 中 缓 冲 10s 左 右, 再 迅 速 38 水 浴 解 冻, 轻 轻 震 荡 后 拭 细 管 表 面 水 分, 剪 去 封 口, 将 内 容 物 吹 入 解 冻 液 A 后, 立 即 将 COCs 转 移 到 新 鲜 的 解 冻 液 A 中, 在 38.5 的 加 热 板 上 平 衡 3~5min 后 再 将 其 转 移 到 解 冻 液 B 中 同 样 平 衡 3-5min, 然 后 将 COCs 转 移 至 解 冻 液 C 中 在 38.5 的 加 热 板 上 平 衡 3~5min 最 后, 将 COCs 用 PBS 洗 2~3 遍 后 待 用 卵 母 细 胞 成 活 率 检 测 使 用 1% 透 明 质 酸 酶 溶 液 脱 掉 不 同 组 别 COCs 的 颗 粒 细 胞, 再 用 卵 母 细 胞 操 作 液 洗 涤 2~3 次, 将 去 除 颗 粒 细 胞 的 卵 母 细 胞 于 6μg/ml 二 乙 酰 荧 光 素 (FDA) 中 38.5 条 件 下 共 孵 育 5min, 然 后 用 PBS 清 洗 3~4 遍, 在 倒 置 荧 光 显 微 镜 下 观 察 染 色 情 况 其 中 染 色 后 荧 光 强, 且 外 形 呈 规 则 的 圆 形 胞 质 无 破 碎 涨 缩 的 卵 母 细 胞 是 活 力 好 的 卵 母 细 胞, 反 之 荧 光 强 度 弱 的 是 活 力 较 低 的 卵 母 细 胞, 无 荧 光 信 号 的 是 已 经 死 掉 的 卵 母 细 胞 25

40 华 中 农 业 大 学 2013 届 硕 士 研 究 生 学 位 ( 毕 业 ) 论 文 卵 母 细 胞 透 明 带 硬 度 检 测 卵 母 细 胞 透 明 带 硬 度 检 测 参 考 Xu 等 (Xu et al 1997) 和 刘 娜 ( 刘 娜 2008) 报 道 的 方 法 加 以 改 进 将 脱 去 颗 粒 细 胞 的 卵 母 细 胞 置 于 含 10mg/mLα-chymotrypsin(α- 胰 凝 乳 蛋 白 ) 的 PBS 溶 液 培 养 皿 中, 于 培 养 箱 中 孵 育, 在 倒 置 显 微 镜 下 观 察 透 明 带 溶 解 情 况 处 理 的 前 30min, 每 隔 5min 观 察 一 次, 以 后 每 隔 3min 观 察 一 次 直 到 测 试 时 间 结 束 测 试 时 间 结 束 的 标 准 : 透 明 带 完 全 消 失, 轻 轻 敲 打 平 皿, 裸 卵 粘 附 在 平 皿 表 面 对 于 75% 的 卵 母 细 胞 经 历 了 完 全 透 明 带 溶 解 的 时 间 记 做 t 75, 并 以 此 时 间 的 长 短 评 价 透 明 带 的 硬 度, 透 明 带 越 硬, 时 间 经 历 越 长 卵 母 细 胞 细 胞 器 的 形 态 检 测 卵 母 细 胞 纺 锤 体 形 态 检 测 卵 母 细 胞 纺 锤 体 观 察 采 用 α-tubulin 免 疫 荧 光 染 色 方 法 实 验 主 要 步 骤 主 要 参 照 (Lee et al 2011) 和 王 晓 民 ( 王 晓 民 2011), 主 要 步 骤 如 下 : (1) 将 不 同 条 件 才 冷 冻 复 苏 后 的 卵 丘 卵 母 细 胞 复 合 体 成 熟 培 养 后 脱 去 颗 粒 细 胞 ; (2) 将 去 除 颗 粒 细 胞 的 卵 母 细 胞 在 清 洗 液 ( 含 0.1%PVP 的 PBS) 中 清 洗 三 遍, 每 次 不 少 于 2min; (3) 将 卵 母 细 胞 转 入 4% 多 聚 甲 醛 中 4 固 定, 不 少 于 1h; (4) 固 定 后 对 卵 母 细 胞 进 行 清 洗, 移 入 TPBS( 含 0.1%Tween2.0 的 PBS) 中 清 洗, 不 少 于 1h; (5) 然 后 对 卵 母 细 胞 进 行 透 化, 透 化 液 为 含 有 0.5%TritonX-100 的 PBS, 一 般 条 件 下 为 4, 透 化 处 理 2h 左 右 ; (6) 透 化 完 后 清 洗, 重 复 步 骤 4; (7) 紧 接 着 对 卵 母 细 胞 进 行 封 闭 过 夜 处 理, 作 用 条 件 同 样 为 4, 封 闭 液 为 添 加 1%BSA 和 0.1% Tween2.0 的 PBS 溶 液 ; (8) 重 复 步 骤 4; (9) 第 二 天 在 含 有 抗 体 的 孵 育 液 中 孵 育 卵 母 细 胞, 抗 体 为 小 鼠 抗 α-tubulin- FITC-IgG(sigma), 孵 育 过 夜 后 再 于 培 养 箱 中 培 养 1h; (10) 重 复 步 骤 4; (11) 清 洗 后 用 核 染 色 剂 (PI 或 者 DAPI) 避 光 染 色 30min; 26

41 牛 GV 期 卵 母 细 胞 玻 璃 化 冷 冻 技 术 优 化 及 其 作 用 机 制 研 究 (12) 重 复 步 骤 4, 清 洗 三 遍 ; (13) 将 卵 母 细 胞 固 定 到 含 有 防 荧 光 淬 减 剂 的 载 玻 片 上, 压 片 后 周 围 涂 上 无 色 的 指 甲 油, 最 后 在 倒 置 荧 光 显 微 镜 下 观 察 染 色 情 况 将 观 察 到 的 纺 锤 体 进 行 分 类 统 计, 分 类 标 准 为 :1 级, 纺 锤 体 清 晰 可 见, 并 且 染 色 体 正 常 ;2 级, 与 1 级 比 较 纺 锤 体 结 构 不 明 显, 但 仍 然 可 以 见 到 类 似 纺 锤 形 状, 极 性 消 失 ;3 级, 纺 锤 体 变 性, 分 散, 微 管 有 断 裂 现 象 ;4 级, 纺 锤 体 缺 失, 纺 锤 体 或 者 微 管 结 构 消 失 卵 母 细 胞 线 粒 体 荧 光 强 度 检 测 卵 母 细 胞 线 粒 体 检 测 采 用 罗 丹 明 -123 荧 光 染 色 的 方 法, 将 去 除 颗 粒 细 胞 的 卵 母 细 胞 用 罗 丹 明 -123 染 色 液 在 37 条 件 下 染 色 30min, 随 后 用 PBS 清 洗 液 清 洗 3 遍 后, 再 用 含 10μg/mL 的 Hoechst 处 理 10min, 清 洗 液 洗 3 遍, 将 洗 涤 过 的 卵 母 细 胞 移 到 含 有 防 荧 光 淬 减 剂 的 载 玻 片 上, 压 片 后 周 围 涂 上 无 色 的 指 甲 油, 在 倒 置 荧 光 显 微 镜 下 观 察 线 粒 体 荧 光 强 度 情 况 10μg/mL 罗 丹 明 -123 溶 液 的 配 制 :5mg 荧 光 染 料 溶 于 2mL DMSO, 浓 储 为 2.5mg/mL, 分 装 为 10ul 每 管, 使 用 时 一 管 染 料 溶 于 2.5mL PBS 中 得 到 终 浓 度 卵 丘 细 胞 扩 展 检 测 用 卵 丘 卵 母 细 胞 体 外 成 熟 培 养 液 IVM 将 解 冻 后 的 COCs 洗 涤 三 到 四 次, 移 入 到 含 有 激 素 的 成 熟 培 养 微 滴 (CO 2 培 养 箱 酸 碱 平 衡 3h 以 上 或 过 夜 ) 中 进 行 成 熟 培 养, 每 个 微 滴 放 20~25 枚 COCs, 在 CO 2 培 养 箱 (38.5 5%CO 2 100% 湿 度 条 件 下 ) 中 培 养 22~24h 在 倒 置 显 微 镜 下 观 察 成 熟 培 养 后 卵 丘 细 胞 的 扩 展 情 况, 并 用 照 相 系 统 进 行 拍 照 卵 母 细 胞 体 外 受 精 发 育 能 力 检 测 将 解 冻 后 的 COCs 体 外 培 养 成 熟 后 进 行 体 外 受 精 实 验, 统 计 胚 胎 卵 裂 率 和 囊 胚 率 体 外 受 精 (IVF-Percoll 梯 度 离 心 法 ) 实 验 步 骤 如 下 : A 卵 母 细 胞 准 备 (1) 成 熟 培 养 24h 的 COCs 脱 掉 部 分 颗 粒 细 胞, 外 留 1-2 层 颗 粒 细 胞 ; (2) 卵 母 细 胞 用 IVF-TALP 清 洗 后, 移 入 在 培 养 箱 中 平 衡 2h 以 上 的 的 IVF 滴 中 27