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1 [ 应用纪要 ] 使用 ACQUITY UPLC H-Class 系统和 Auto Blend Plus 开发高效稳定的离子交换 (IEX) 方法用于生物治疗性药物电荷变异体分析 Robert Birdsall,Thomas Wheat,and Weibin Chen 沃特世公司 ( 美国马萨诸塞州米尔福德市 ) 应用优势 通过自动化分析技术提高工作效率 稳健的方法开发为生物治疗性药物电荷变异体的确证和定量带来一致且重现性良好的结果 无需制备额外缓冲液, 简化方法开发过程并提高方法重现性 简介在表征和监测治疗性蛋白质的质量属性时, 电荷变异体分析非常关键 脱酰胺化 N 端焦谷氨酸基团修饰 异构化 唾液酸化聚糖和 C 端赖氨酸裁剪等蛋白质修饰作用都会导致电荷变异体的形成 1 在某些情况下, 这些变化会影响治疗性蛋白质的键合 生物活性 患者安全性和保质期 生物制药行业通过离子交换色谱 (IEX) 和等电聚焦 (IEF) 凝胶电泳等方法来对电荷变异体进行表征 离子交换色谱法使用方便 适用性广并且分离度高, 因此对于生物治疗性药物开发特别有用 沃特世解决方案 UNIFI 生物制药平台解决方案 ACQUITY UPLC H-Class 系统 ACQUITY UPLC 可变波长紫外 (TUV) 检测器 Protein-Pak TM Hi Res SP SCX 色谱柱 UNIFI 科学信息系统关键词 Auto Blend Plus TM 技术, 阳离子交换, 抗体, I E X,S C X, 色谱, 生物分离, 蛋白质, 方法开发, 稳定性 如果要对生物制药开发过程中治疗性蛋白质的电荷异质性进行深入表征, 就需要稳定高效的 IEX 方法 在开发方法时, 通常会对所有可能涉及到的实验参数进行全面评估, 例如缓冲液 / 离子强度 缓冲液 ph 值 盐梯度 流速和柱温等 然而, 想要系统性地评估各个实验参数对分离性能的影响, 往往需要进行冗长的迭代过程, 这涉及到各种不同成分缓冲液的制备和测试 缓冲液制备的差异可能会导致结果不一致, 进而延长方法开发时间 Waters Auto Blend Plus 技术利用 ACQUITY UPLC H-Class 系统的四元溶剂管理技术, 使用纯溶剂和高浓度修饰剂储备液来解决这些问题 利用 Auto Blend Plus 技术计算每种储备液的混合百分比获得所需 ph 值, 从而减少错误 降低耗材用量并缩短开发时间 UNIFI 生物制药平台解决方案因集成了上述特性, 非常适用于稳定的方法开发, 并轻松实现自动化, 从而提高工作效率 本应用纪要旨在展示 Auto Blend Plus 技术在使用离子交换 (IEX) 方法进行电荷变异体分离方法优化过程中的高效率和稳定性 本应用纪要使用嵌合单克隆抗体英夫利昔单抗作为治疗性蛋白质应用示例 1

2 实验样品描述按照制造商说明对 Waters Protein-Pak Hi Res 强阳离子交换色谱柱 ( mm,7 µm, 部件号 ) 进行平衡 MES 一水合物 ( 部件号 AC ) MES 钠盐 ( 部件号 AC ) 和氯化钠 ( 部件号 S ) 均购自 Fisher Scientific 公司 本研究中评估的嵌合单克隆抗体在所有实验中均按收到的原样使用, 浓度为 20 µg/µl 液相色谱条件 LC 系统 : 配备 Auto Blend Plus 的 ACQUITY UPLC H-Class 系统检测器 : ACQUITY UPLC TUV 吸收波长 : 280 nm 样品瓶 : 总回收样品瓶 : mm 玻璃, 螺口, 带盖, 无切口色谱柱 : Protein-Pak Hi Res SP, mm,7 µm 柱温 : 25 样品温度 : 4 进样体积 : 3 µl 流速 : 0.5 ml/min 流动相 A: 100 mm MES 一水合物流动相 B: 100 mm MES 钠盐流动相 C: 1000 mm NaCl 流动相 D: 18 MΩ H 2 O 缓冲条件 : 20 mm MES,pH 6.8 梯度 : NaCl 在 25 分钟内从 25 mm 升至 65 mm ( 见图 2) 结果与讨论 Auto Blend Plus 技术离子交换色谱 (IEX) 技术的方法开发常会包含耗时的试验和错误的方法 在迭代过程中, 通常需要制备多种具有特定 ph 值和离子强度的缓冲液, 然后对每种缓冲液系统进行测试, 直至达到足够的分离效果 Auto Blend Plus 技术是 ACQUITY UPLC H-Class 系统标配的集成软件 它的设计目的是避免方法开发中的反复猜测, 并提高电荷变异体分析的工作效率 Auto Blend Plus 有助于分析人员对四元溶剂管理系统进行配置, 可将纯溶液和浓缩储备液进行混合以获得所需梯度 ( 图 1) 最终用户可以得到一个易于使用的梯度表界面, 通过这个界面直接用 ph 值和离子强度来表示梯度 软件会利用所选缓冲液系统的已知 pk a 值或经验校准表 ( 图 2), 来自动计算特定 ph 值需要的酸碱对百分比 数据采集和处理信息学软件 UNIFI 科学信息系统,1.6 版 2

3 Auto Blend Plus 技术可以运用一组纯组分进行多个缓冲液组成的测试, 并轻松实现自动化, 从而 提高工作效率 储液瓶 : 梯度表 : 图 1. Auto Blend Plus 技术利用 ACQUITY UPLC H-Class 系统的四元溶剂管理器混合储液瓶中的各种纯缓冲液, 稳定分离治疗性蛋白质中的电荷变异体 在本研究中, 该技术用于分离嵌合单克隆抗体中的 C 端赖氨酸截断变异体 图 2. 典型的 Auto Blend Plus 技术储液瓶配置图示, 附有用于分离嵌合单克隆抗体的梯度表 稳定的方法开发稳定性是用以衡量分离方法在系统发生微小变化时保持结果可重复性的能力 对于离子交换色谱而言, 这些参数包括 ph 值 蛋白质载荷量和重现性 而对于制药公司而言, 稳定的方法可以缩短在方法验证上花费的时间, 从而提高工作效率 本文对这些参数进行了研究, 以评估使用 Auto Blend Plus 技术进行方法开发的稳定性 3

4 Auto Blend Plus 验证和鉴定方案 在不同仪器 分析人员和实验室之间进行方法转换时,Auto Blend Plus 技术可以实现简便的系统 验证和鉴定 三个不同的 MES 缓冲液体系按照如下策略进行了制备和检测 从表 1 可以很容易地看出, 每个缓冲液体系的实验 ph 值均与所需的检测 ph 值具有良好的一致性 这三个缓冲液体系因具有良好的精度而得出图 3 所示的可重现色谱图 Auto Blend Plus 技术可以根据鉴定方案轻松地进行调整, 最大限度地缩短耗费在系统验证上的时间 溶液装入 A:100 ml 1.0 M MES 一水合物与 900 ml HPLC 级水混合 B:100 ml 1.0 M MES 钠盐与 900 ml HPLC 级水混合 C 和 D:HPLC 级水 缓冲液混合物 1 交叉校准 ph 计 低 ph 参比 : 混合 1.8 ml A 0.2 ml B 8 ml C 中 ph 参比 : 混合 1 ml A 1 ml B 8 ml C 高 ph 参比 : 混合 0.2 ml A 1.8 ml B 8 ml C 记录 ph 值 缓冲液混合物 2 溶液测试 低 : 低 ph 参比下 0.5 ml/min(ph 5.13); 盐浓度 :0 中 : 中 ph 参比下 0.5 ml/min(ph 6.12); 盐浓度 :0 高 : 高 ph 参比下 0.5 ml/min(ph 7.10); 盐浓度 :0 缓冲液混合物 3 样品收集 运行至废液 10 分钟 用样品瓶收集洗脱液 20 分钟 3 种测试方案重复上述步骤 ph 测量 确证 ph 计校准情况 图 3. 利用 Auto Blend Plus 技术对两周时间内制备的 3 种不同 MES 缓冲液进行 C 端赖氨酸截断变异体分离 测量并记录每种测试溶液的 ph 值 测得 ph 值 缓冲液混合物 1 缓冲液混合物 2 缓冲液混合物 3 平均值标准差 RSD% 表 1. 3 种 MES 缓冲制备液的 ph 值实验结果 4

5 随着样品浓度提高, 分离性能保持不变 对于 IEX 色谱柱而言, 进样蛋白质的量会影响保留时间和柱效 进样体积范围 1-10 µl, 以 1 µl 为间隔, 逐次进样嵌合单克隆抗体储液, 来测试蛋白质载荷量对柱效的影响 总的峰面积按每次进样采集到 5-30 min 的积分峰面积计算 当蛋白质载荷量在 µg 之间增加 9 倍后, 保留时间依然表现出良好的重现性, 如图 4 所示 ACQUITY UPLC H-Class 系统配合 Auto Blend Plus 技术可以实现高度可靠并且准确的生物治疗药物电荷变异体定量和表征 图 4. 蛋白质浓度增加时的嵌合单克隆抗体分离色谱图叠加图 将积分总峰面积作为精度测量标准, 如图中积分面积与载荷量所示 在重复分析中获得高度可重现的分离结果 自动化分析技术可以最大限度地减少方法开发中的错误, 同时提高产能 通过 40 次进样模拟为期三天的无人值守分析操作, 对 Auto Blend Plus 技术进行评估 第 1 20 和 40 次进样的色谱图如图所示 60 分钟的分离过程如图 2 所示, 包含 30 分钟的分离梯度和 30 分钟的清洗和重新平衡时间 5 个峰面积 ( 包括 3 个主要 C 端赖氨酸截断变异体 ) 的积分间隔以每个色谱图中的垂直线表示 表 2 中列出了每个峰面积的计算面积和总面积 2 由此可见,Auto Blend Plus 技术提供了符合美国 FDA 指导原则的可重现结果, 单个峰的协方差低 于 12%, 总峰面积协方差低于 9% Auto Blend Plus 技术可以实现自动化, 并且具有良好重现性, 因而为开发稳定的生物治疗药物电荷变异体表征方法提供了可靠的途径 5

6 第 1 天 ( 第 1 次进样 ) 第 2 天 ( 第 20 次进样 ) 第 3 天 ( 第 40 次进样 ) 图 5. 3 天内 3 组不同时间间隔的嵌合单克隆抗体电荷变异体分离色谱图 积分间隔表示表 2 中计算的 5 个峰面积 进样编号 峰 1 面积 峰 2 面积 峰 3 面积 峰 4 面积 峰 5 面积 合计 平均值 SD RSD% 表 2. 积分峰面积结果 6

7 结论 参考文献 分析生物制药开发过程中的电荷异质性需要稳定的方法, 这种方法不仅要能实现自动化, 易于操作, 还要能快速吻合生物制药行业的快节奏需求 1. Du et al. Chromatographic analysis of the acidic and basic species of recombinant monoclonal antibodies. mabs Sep-Oct; 4(5): Guidance For Industry, Bioanalytical Method Validation, US Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Rockville, MD, May Auto Blend Plus 技术与 ACQUITY UPLC H-Class 系统的结合体现了一种以 UV 为基础的 UNIFI 生物制药平台解决方案, 通过使用一组纯组分实现多种缓冲配比检测, 从而简化了方法开发的过程 具备上述特性的 Auto Blend Plus 再结合流程自动化功能, 成为开发稳定方法和提高工作效率的强大工具 沃特斯中国有限公司沃特世科技 ( 上海 ) 有限公司 Waters,The Science of What s Possible,ACQUITY UPLC 和 UNIFI 是沃特世公司的注册商标 Auto Blend Plus 和 Protein-Pak 是沃特世公司的商标 其他所有商标均归各自的拥有者所有 2013 年沃特世公司 印制于中国 2013 年 11 月 ZH AG-PDF 北京 : 上海 : 广州 : 成都 : 香港 : 免费售后服务热线 :800 (400)

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