Microsoft Word doc

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft Word doc"

樊乐
5 years ago
Views:

1 川楝素下调 ATF2 蛋白的表达增强顺铂对肺癌细胞的凋亡诱导活性研究张伟星 1, 张浩 2, 翁伟芳 1* (1. 建德市第一人民医院呼吸科, 杭州 ;2. 浙江大学医学院附属第二医院呼吸科, 杭州 ) 摘要 : 目的探讨川楝素辅助治疗是否能增强顺铂对肺癌细胞的凋亡诱导活性并研究其机制方法 MTT 法检测肺癌细胞系 A549 在顺铂和川楝素处理下的细胞活力 Western blot 试验检测顺铂和川楝素对 A549 细胞 ATF2 磷酸化水平,Bcl-xl 蛋白表达水平细胞色素 C 释放水平 caspase-9 和 caspase-3 活化水平的影响流式细胞术检测 A549 细胞在顺铂和川楝素联合处理下的细胞凋亡率结果 MTT 试验结果显示, 川楝素辅助治疗能明显提降低顺铂对 A549 的 IC 50 Western blot 试验结果显示川楝素处理能显著抑制 A549 细胞 ATF2 的表达和磷酸化 MTT 试验结果显示, 转染 ATF2 表达质粒显著抑制川楝素对顺铂的协同抗肺癌活性 Western blot 和流式细胞试验结果显示, 川楝素能显著抑制 A549 细胞中顺铂诱导的 Bcl-xl 表达水平的上调, 进而促进 A549 细胞中顺铂诱导的细胞色素 C 的释放 caspase-9 和 caspase-3 活化及 A549 细胞的凋亡水平结论川楝素通过抑制 ATF2 蛋白的磷酸化增强顺铂对肺癌细胞的凋亡诱导活性关键词 : 肺癌 ; 川楝素 ;ATF2; 顺铂 ;Bcl-xl 中图分类号 :R285.4 文献标志码 :A 文章编号 : (2018) DOI: /j.cnki.issn 引用本文 : 张伟星, 张浩, 翁伟芳. 川楝素下调 ATF2 蛋白的表达增强顺铂对肺癌细胞的凋亡诱导活性研究 [J]. 中国现代应用药学, 2018, 35(4): Toosendaninl Enhances Cisplatin-induced Apoptosis in Lung Cancer Through Downregulating the Expression of ATF2 ZHANG Weixing 1, ZHANG Hao 2, WENG Weifang 1* (1.Department of Respiration, The First People s Hospital of Jiande, Hangzhou , China; 2.Department of Respiration, The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University, Hangzhou , China) ABSTRACT: OBJECTIVE To investigate the effect and mechanisms of toosendaninl treatment on enhancing cisplatin-induced apoptosis in lung cancer cells. METHODS MTT assay was performed to measure the cell viability of A549 cells treated with toosendaninl and cisplatin. Western blot analysis was performed to detect the phosphorylation of ATF2, expression of Bcl-xl, release of cytochrome C and activation of caspase-9 and caspase-3 in A549 cells treated with toosendaninl and cisplatin. Flow cytometry analysis was performed to measure the cell apoptosis of A549 cells treated with toosendaninl and cisplatin. RESULTS Results of MTT assays showed that toosendaninl treatment decreased the IC 50 of cisplatin to A549. Results of Western blot analysis showed that toosendaninl treatment inhibited the expression and phosphorylation of ATF2 in A549 cells treated with cisplatin. In addition, transfection with ATF2 plasmid abolished the synergistic effect of toosendaninl on cisplatin-induced cell death. Results of Western blot and flow cytometry analysis toosendaninl treatment inhibited the cisplatin-induced upregulation of Bcl-xl, and thus promoting release of cytochrome C, activation of caspase-9 and caspase-3 and cell apoptosis. CONCLUSION Toosendaninl enhances cisplatin-induced apoptosis in lung cancer through promoting the phosphorylation of ATF2. KEY WORDS: lung cancer; toosendaninl; ATF2; cisplatin; Bcl-xl 肺癌是全球发病率最高的恶性肿瘤, 预后不良由于肺癌的早期症状不明显, 而且恶性程度较高, 很多患者在确诊时已发生肿瘤的转移和扩散, 因此患者的 5 年生存率很低 [1] 对于已经发生肿瘤转移不能进行手术切除的肺癌患者, 化疗是不可替代的重要方法然而大剂量的化疗药物对患者有很大的不良反应, 患者顺应性较差, 而且大剂量化疗药物的使用容易造成肿瘤细胞对化疗的抵抗 [2-3] 因此联合应用一些辅助治疗药物降低化疗药物的剂量并提高化疗药物的抗肿瘤活性具有十分重要的意义顺铂是一种广谱抗肿瘤药物, 是治疗肺癌的一线化疗药物顺铂能与肿瘤细胞中的 DNA 结合, 引起 DNA 的交叉联结, 从而破坏肿瘤细胞 DNA 的功能, 使细胞进入凋亡程序 [4-5] 然而大剂量顺铂的不良反应较大, 具有神经毒性和肾毒性, 还能引起严重的胃肠道反应和骨髓移植, 患者对顺铂治疗的顺应性比较低 [6-7] 因此降低顺铂的使用作者简介 : 张伟星, 男, 硕士, 副主任医师 Tel: (0571) mynice_cn@163.com 师 Tel: (0571) mynice_cn@163.com * 通信作者 : 翁伟芳, 女, 主任医中国现代应用药学 2018 年 4 月第 35 卷第 4 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 April, Vol.35 No.4 547

2 剂量, 提高肺癌细胞对顺铂的敏感性是提高化疗效果并改善患者顺应性的有效方法川楝素是中药川楝子中的主要活性成分, 具有很强的药理学活性研究发现中药川楝素具有一定的抗肿瘤作用, 对结直肠癌细胞淋巴瘤细胞等多种恶性细胞均有良好的辅助治疗作用 [8-9] 然而, 川楝素是否对顺铂的抗肺癌活性有协同作用至今仍很少报道本研究的目的在于探讨川楝素辅助治疗是否能增强顺铂抗肺癌活性并研究其机制 1 材料 1.1 细胞培养人肺癌细胞系 A549 购于美国模式培养物保存中心 (ATCC), 培养在含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基中, 在 37 恒温培养箱中培养, 并通入 5%CO 试剂顺铂 ( 批号 :P4394) 白藜芦醇( 批号 :R5010) 噻唑蓝 (MTT, 批号 :M2128) SP600125( 批号 : S5567) 凋亡检测试剂盒( 批号 :APOAF) 购于美国 Sigma-Aldrich; 川楝素 ( 南京春秋生物工程有限公司, 批号 : );RPMI-1640 培养基 ( 美国 Gibco); 蛋白提取液 ATF2 磷酸化 ATF2 Bcl-xl 细胞色素 C 活化 caspase-9 活化 caspase-3 和 GAPDH 抗体均购于美国 Santa Cruze;pcDNA3.1 Lipofectamine 2000 购于美国 Invitrogen;ATF2 小干扰 RNA(ATF2 sirna) 及对照 RNA(control sirna) 购于美国 Santa Cruze;ECL 试剂盒 ( 批号 : NCI4106) 购于美国 Pierce; 线粒体分离试剂盒 ( 批号 :C3601) 购于江苏碧云天 2 方法 2.1 顺铂对 A549 细胞的 IC 50 测定将 A549 细胞按每孔接种在 96 孔板上孵育过夜, 用 (0~10 mol L 1 ) 顺铂及 20 mol L 1 川楝素处理肿瘤细胞 48 h, 之后加入 20 L MTT (5 mg ml 1 ),37 恒温培养箱中培养 4 h, 移除孔内培养基, 加入 100 L 二甲亚砜,570 nm 波长下测定 A 值细胞活力结果用顺铂处理组与对照组的 A 值比值表示绘制细胞活力 - 顺铂浓度曲线, 根据曲线计算顺铂对 A549 细胞的 IC ATF2 重组质粒构建和细胞转染人 ATF2 基因的开放阅读框架序列经 PCR 扩增后以分子克隆的方法与 pcdna3.1 连接后构建成 ATF2 重组过表达质粒 ATF2 过表达质粒或 ATF2 sirna 用脂质体 2000 按试剂操作说明书步骤进行转染, 简要步骤如下 : 将 2 g ml 1 空质粒或 ATF2 质粒 (50 pmol ml 1 control sirna 或 ATF2 sirna) 用脂质体 2000 包裹后, 将其加入到无血清培养基进行混合将贴壁的 A549 细胞置于该无血清培养基孵育 6 h 后弃去无血清培养基, 并加入新鲜的含 10% 胎牛血清的 RPMI-1640 培养基培养 24 h 2.3 川楝素或白藜芦醇联合顺铂对 A549 细胞的杀伤活性转染后的 A549 细胞按每孔接种在 96 孔板上孵育过夜, 之后加入 2 mol L 1 顺铂 20 mol L 1 川楝素 ( 或白藜芦醇 ) 20 mol L 1 SP 处理细胞 48 h, 之后加入 20 L MTT (5 mg ml 1 ),37 恒温培养箱中培养 4 h, 移除孔内培养基, 加入 100 L 二甲亚砜, 震荡混匀后在 570 nm 波长下测定 A 值细胞活力结果用药物处理组与对照组的 A 值比值表示 2.4 线粒体分离空质粒或 ATF2 质粒转染的 A549 细胞用 2 mol L 1 顺铂和 20 mol L 1 川楝素进行处理, 之后收集细胞, 用线粒体分离试剂盒按照说明书步骤分离出 A549 细胞中的线粒体, 留取无线粒体的细胞质作为样品进行 Western blot 试验 2.5 Western blot 试验空质粒或 ATF2 质粒转染的 A549 细胞用 2 mol L 1 顺铂 20 mol L 1 川楝素 20 mol L 1 SP 处理细胞 48 h, 之后用蛋白提取液提取 A549 细胞中的总蛋白质将等量的总蛋白质或经 2.4 项下方法处理后得到的细胞质样品, 用 12.5% SDS-PAGE 进行电泳分离分离完毕后通过电转方法将蛋白质从分离胶上转到 PVDF 膜上, 用 ATF2 磷酸化 ATF2 活化 caspase-9 活化 caspase-3 细胞色素 C 和 GAPDH 抗体孵育过夜, 之后再用带辣根过氧化物酶的二抗孵育 2 h, 蛋白条带用 ECL 试剂盒显色发光并用 Image J 软件处理计算灰度值目标蛋白相对表达水平 = 灰度值目标蛋白 / 灰度值 GAPDH 2.6 细胞凋亡试验空质粒或 ATF2 质粒转染的 A549 细胞用 2 mol L 1 顺铂和 20 mol L 1 川楝素进行处理, 之后收集细胞, 按照凋亡试剂盒说明书步骤将碘化丙啶 (PI) 和 Annexin-V 加入细胞中孵育 20 min, 采用流式细胞术检测肿瘤细胞的凋亡,Annexin-V 阳性细胞即为凋亡细胞 548 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 April, Vol.35 No.4 中国现代应用药学 2018 年 4 月第 35 卷第 4 期

3 2.7 统计学处理所有试验重复 3 次, 试验数据用 x s 表示并用 SPSS 14.0 统计分析软件进行处理, 统计学方法采用单因素方差分析 (one-way ANOVA) 进行处理, P<0.05 为差异具有统计学意义 3 结果 3.1 川楝素增强顺铂对肺癌细胞的杀伤活性 MTT 试验结果显示, 川楝素辅助治疗可明显提高顺铂对 A549 细胞的杀伤活性在 A549 细胞培养体系中加入川楝素能显著降低顺铂对其的 IC 50, 表明川楝素对顺铂的抗肺癌活性有协同作用另外, 在 A549 细胞中相同浓度的白藜芦醇对顺铂的增效作用明显弱于川楝素, 提示在肺癌中, 川楝素是一种较好的顺铂增敏剂结果见图 1 图 1 川楝素和白藜芦醇增强顺铂对肺癌细胞的杀伤活性 (n=3, x s ) 与对照组相比, 1) P<0.05 Fig. 1 Toosendaninl and resveratrol enhanced the cytotoxicity of cisplatin to lung cancer cells(n=3, x s ) Compared with control group, 1) P< 川楝素通过抑制 ATF2 的磷酸化增强顺铂对肺癌细胞的杀伤活性 Western blot 试验结果显示, 顺铂处理能明显诱导 A549 细胞中的 ATF2 蛋白发生磷酸化川楝素处理能明显降低 A549 细胞中 ATF2 的表达水平, 从而减少顺铂依赖的磷酸化 ATF2 蛋白在 A549 细胞中的表达水平 ( 图 2A) 另外, 在顺铂诱导的 ATF2 蛋白磷酸化通路中,JNK 蛋白是 ATF2 的上游信号分子, 因此 JNK 特异性抑制剂 SP 能通过抑制 JNK 从而抑制 ATF2 蛋白的磷酸化 [10] 如图 2A 所示,SP 处理不影响 A549 细胞中 ATF2 的蛋白表达水平, 但能直接抑制 ATF2 蛋白的磷酸化 MTT 试验结果显示, 转染 ATF2 表达质粒能明显降低川楝素对顺铂的协同抗肺癌活性 ( 图 2B) 同时, 类似于川楝素,SP 同样能增强顺铂对 A549 细胞的杀伤活性 ( 图 2B) 然而, 转染 ATF2 表达质粒不能抑制 SP 联合顺铂对 A549 的杀伤活性 ( 图 2B), 这可能是因为 SP 对 ATF2 磷酸化的抑制作用不受 ATF2 表达质粒的影响 ( 图 2A) 另外, 直接转染 ATF2 sirna 同样能提高顺铂对 A549 细胞的杀伤活性, 而此时再用川楝素进行联合治疗, 其效果不显著 ( 图 2C) 这些结果表明, 川楝素增强顺铂对肺癌细胞杀伤活性的机制可能为川楝素能通过抑制肺癌细胞中 ATF2 蛋白的表达水平从而抑制其发生磷酸化 3.3 川楝素在肺癌细胞中促进顺铂诱导的线粒体途径凋亡 Western blot 结果显示, 顺铂处理明显诱导 Bcl-xl 抗凋亡蛋白的过表达, 联合川楝素后, 顺铂诱导的 Bcl-xl 蛋白的过表达受到明显抑制同时, 转染 ATF2 表达质粒能废除川楝素对 Bcl-xl 的抑制作用 ( 图 3A) 川楝素能显著促进顺铂对线粒体的损伤, 导致细胞色素 C 从线粒体中释放到细胞质中 ( 图 3B), 从而诱导 A549 细胞 caspase-9 和 caspase-3 的活化 ( 图 3C), 使细胞进入凋亡程序 ( 图 3D) 而转染 ATF2 表达质粒能显著抑制川楝素联合顺铂诱导的细胞色素 C 的释放, 抑制 caspases 的活化和凋亡的发生 4 讨论川楝素是中药川楝子的活性成分, 具有一定的抗肿瘤活性 [8-9], 然而其是否对肺癌的化疗有辅助治疗作用至今仍很少报道在预试验中, 川楝素单独治疗对肺癌细胞 A549 的杀伤活性较弱, IC 50 达到 322 µmol L 1, 这个治疗剂量在体内很难达到, 因此考虑较低浓度的川楝素 (20 µmol L 1 ) 是否能作为一种化疗增效剂增强化疗药物的抗肺癌活性在本研究中, 将 A549 肺癌细胞用川楝素进行辅助治疗能明显提高其对顺铂的敏感性, 降低顺铂的 IC 50, 表明川楝素对肺癌细胞的顺铂化疗有显著的协同作用另外, 尽管白藜芦醇同样对顺铂有协同效应 [4], 然而在肺癌细胞中, 相同浓度的白藜芦醇 (20 µmol L 1 ) 对顺铂 IC 50 的降低明显中国现代应用药学 2018 年 4 月第 35 卷第 4 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 April, Vol.35 No.4 549

4 图 2 川楝素抑制 ATF2 的磷酸化增强顺铂对肺癌细胞的杀伤活性 (n=3, x s ) 与对照组相比, 1) P<0.05; 与顺铂组相比, 2) P<0.05; 与顺铂 + 川楝素组相比, 3) P<0.05 Fig. 2 Toosendaninl enhanced the cytotoxicity of cisplatin to A549 cells through suppressing the phosphorylation of ATF2(n=3, x s ) Compared with control group, 1) P<0.05; compared to cisplatin group, 2) P<0.05; compared to cisplatin+toosendaninl group, 3) P<0.05. 图 3 川楝素在肺癌细胞中促进顺铂诱导的线粒体途径凋亡 (n=3, x s ) 与对照组相比, 1) P<0.05; 与顺铂组相比, 2) P<0.05; 与顺铂 + 川楝素组相比, 3) P<0.05 Fig. 3 Toosendaninl promoted cisplatin-induced apoptosis in A549 cells (n=3, x s ) Compared with control group, 1) P<0.05; compared to cisplatin group, 2) P<0.05; compared to cisplatin + toosendaninl group, 3) P< Chin J Mod Appl Pharm, 2018 April, Vol.35 No.4 中国现代应用药学 2018 年 4 月第 35 卷第 4 期

5 弱于川楝素, 表明在肺癌治疗中, 川楝素是一种较好的顺铂增效剂 ATF2 是一种转录因子蛋白, 受 JNK 的调节当肿瘤细胞的 DNA 受顺铂等 DNA 损害药物破坏时,JNK 蛋白会发生活化从而激活 ATF2, 使之磷酸化磷酸化的 ATF2 能促进 DNA 的修复并抑制肿瘤细胞发生凋亡,ATF2 的过度磷酸化是导致肿瘤细胞对顺铂等铂类药物发生抵抗性的重要机制 [11-13] 本研究用顺铂进行治疗时, 肺癌细胞中的 ATF2 蛋白会发生高度磷酸化以抵御顺铂对肿瘤细胞的杀伤活性然而当合用川楝素时, 肺癌细胞中的 ATF2 蛋白表达水平受到明显抑制, 并由此抑制了顺铂依赖的 ATF2 磷酸化, 推测这可能是川楝素对顺铂发挥协同抗肺癌作用的机制为了证明这一结论, 笔者在肺癌细胞中转染 ATF2 重组表达质粒使 ATF2 在肺癌细胞中强制表达, 发现肺癌细胞中的 ATF2 发生强制表达后, 川楝素对 ATF2 磷酸化的抑制作用受到明显抑制, 同时对顺铂的协同作用明显减弱, 证明了 ATF2 的下调是川楝素发挥协同作用的重要机制同时, 用 ATF2 sirna 直接沉默肺癌细胞中的 ATF2 后, 顺铂对其的杀伤活性同样明显提高, 而在转染 ATF2 sirna 的同时再用川楝素进行联合治疗, 其效果不显著, 表明 ATF2 sirna 具有和川楝素相似的生物活性另外, JNK 抑制剂 SP 由于能抑制 ATF2 的磷酸化, 也能增强顺铂的抗肺癌活性, 同时由于转染 ATF2 质粒不能限制 SP 对 ATF2 磷酸化的抑制作用, 因此 ATF2 质粒不能抑制 SP 对顺铂的协同作用这一结果也证明抑制 ATF2 的磷酸化能增强顺铂的抗肺癌活性 ATF2 在发生磷酸化后, 能与 c-jun 等转录因子形成二聚体, 该二聚体能诱导 Bcl-xl 抗凋亡蛋白的表达, 从而抑制肿瘤细胞发生线粒体途径的凋亡 [14-15] 在本研究中, 发现顺铂处理的肺癌细胞高表达 Bcl-xl 抗凋亡蛋白, 然而川楝素处理能通过 ATF2 途径抑制顺铂诱导的 Bcl-xl 抗凋亡蛋白的表达随后, 川楝素促进顺铂对线粒体的损伤作用, 使之释放细胞色素 C 等凋亡活性物质到细胞质中, 诱导 caspase-9 和 caspase-3 发生活化, 最终导致凋亡的发生综上所述, 本研究证明了川楝素能通过下调 ATF2 的表达水平抑制其发生磷酸化, 进而抑制 Bcl-xl 的表达, 提高顺铂对肺癌细胞的凋亡诱导活性研究结果为降低顺铂的使用剂量增加其对肺癌的化疗疗效提供了新的策略和思路 REFERENCES [1] SIEGEL R, NAISHADHAM D, JEMAL A. Cancer statistics, 2013 [J]. CA Cancer J Clin, 2013, 63(1): [2] HEIST R S. First-line systemic therapy for non-small cell lung cancer [J]. Hematol Oncol Clin North Am, 2017, 31(1): [3] QIN A, KALEMKERIAN G P. Cisplatin, etoposide, and irinotecan for relapsed small-cell lung cancer [J]. Transl Cancer Res, 2016, 5(Suppl 6): S1142-S1144. [4] LIU X M, ZHU Z W, WANG G, et al. Resveratrol promotes cisplatin-induced cell death by inhibiting the glucose metabolism in bladder cancer [J]. Chin J Mod Appl Pharm( 中国现代应用药学 ), 2016, 33(10): [5] YU M, QI B, LIU X, et al. Baicalein increases cisplatin sensitivity of A549 lung adenocarcinoma cells via PI3K/Akt/NF-κB pathway [J]. Biomed Pharmacother, 2017(90): [6] PAKEN J, GOVENDER C D, SEWRAM V, et al. Cisplatin-associated ototoxicity: A review for the health professional [J]. J Toxicol, 2016(2016): Doi: /2016/ Epub 2016 Dec 27. [7] REZAEE R, MOMTAZI A A, SAHEBKAR A, et al. Curcumin: A potentially powerful tool to reverse cisplatin-induced toxicity [J]. Pharmacol Res, 2017(117): [8] WANG G, FENG C C, ZHANG J, et al. Toosendanin inhibits growth and induces apoptosis in colorectal cancer cells through suppression of AKT/GSK-3β/β-catenin pathway [J]. Int J Oncol, 2015, 47(5): [9] JU J, QI Z, CHEN Y, et al. The apoptotic effects of toosendanin are partially mediated by activation of deoxycytidine kinase in HL-60 cells [J]. PLoS One, 2012, 7(12): e [10] HAYAKAWA J, DEPATIE C, OHMICHI M, et al. The activation of c-jun NH2-terminal kinase (JNK) by DNA-damaging agents serves to promote drug resistance via activating transcription factor 2 (ATF2)-dependent enhanced DNA repair [J]. J Biol Chem, 2003(278): [11] AN J J, SHI K J, XU C M, et al. The ROS/JNK/ATF2 pathway mediates selenite-induced leukemia NB4 cell cycle arrest and apoptosis in vitro and in vivo [J]. Cell Death Dis, 2013(4): e973. Doi: /cddis [12] CHEN J, SOLOMIDES C, SIMPKINS H, et al. The role of Nrf2 and ATF2 in resistance to platinum-based chemotherapy [J]. Cancer Chemother Pharmacol, 2017, 79(2): [13] LO IACONO M, MONICA V, SCAGLIOTTI G V, et al. ATF2 contributes to cisplatin resistance in non-small cell lung cancer and celastrol induces cisplatin resensitization through inhibition of JNK/ATF2 pathway [J]. Int J Cancer, 2015, 136(11): [14] SALAMEH A, GALVAGNI F, OLIVIERO S, et al. Growth factor stimulation induces cell survival by c-jun ATF2-dependent activation of Bcl-xl [J]. J Biol Chem, 2010, 285(30): [15] YU S, HUANG H, LI Q, et al. MiR-326 targets antiapoptotic Bcl-xl and mediates apoptosis in human platelets [J]. PLoS One, 2015, 10(4): e 收稿日期 : ( 本文责编 : 蔡珊珊 ) 中国现代应用药学 2018 年 4 月第 35 卷第 4 期 Chin J Mod Appl Pharm, 2018 April, Vol.35 No.4 551

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼,

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼, 1072 基础研究 Basic Research www.tumorsci.org 肿瘤 2011 年 12 月第 31 卷第 12 期 TUMOR Vol. 31, December, 2011 DOI: 10.3781/j.issn.1000-7431.2011.12. 004 Copyright 2011 by TUMOR 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat