78 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 材料与方法 1.1 材料菌种和质粒酿酒酵母菌株 BJX12 由南京工业大学国家生化中心柏建新老师惠赠, 大肠杆菌 EscherichiacoliDH5α 为本室保藏, 质粒 pyx212

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2008,28(12):77~81 酿酒酵母中过表达 URA5 及 URA3 基因催化合成 UMP 的初步研究雷高新陈勇许琳应汉杰 ( 南京工业大学制药与生命科学学院南京 ) 摘要为提高乳清酸到尿嘧啶核苷酸 (UMP) 的转化效率, 利用 PCR 方法扩增酿酒酵母乳清酸磷酸核糖转移酶基因 URA5, 并将其连接到携带乳清苷酸脱羧酶基因 URA3 的表达载体 pyx212 中, 构建了重组质粒 pyx212?ura5, 然后转化到酿酒酵母 BJX12 中进行表达, 并进行转化乳清酸到 UMP 的初步研究试验结果表明 :pyx212?ura5/bjx12 发酵培养 40h 后以 32mmol/L 乳清酸为底物催化产生 UMP 的量约为 7mmol/L 明显高于同等条件下 pyx212/bjx12 的 UMP 产量 2.7mmol/L 和对照组野生型 BJX12 的 UMP 产量 2.4mmol/L 关键词乳清酸磷酸核糖转移酶乳清苷酸脱羧酶酿酒酵母生物催化尿嘧啶核苷酸中图分类号 Q786 核苷酸是一类在代谢上极为重要的生化物质 [1~3], 除了作为 DNA RNA 的前体外, 还参与细胞的生长代谢能量的储存和转化免疫反应及信号传导近年来随着核酸工业的发展, 嘧啶核苷酸作为药物中间体保健品和食品添加剂的重要性越来越突出 [4~6] 尿嘧啶核苷酸 (UMP) 是嘧啶核苷酸生物合成中处于结点位置的重要核苷酸, 在寡聚糖合成和抗癌药物生产中都是重要的前体物质 [7] 其市场需求很大, 蕴含有良好的商业潜力但与此同时, 由于生产困难, 嘧啶核苷酸价格昂贵已成为该领域进一步发展的主要限制因素目前, 生产核苷酸的方法归纳起来主要有以下三种 : 化学合成法 [8] [9] RNA 酶解法以及生物催化法 [10,11] 生物催化法合成核苷酸反应体系简单, 后提取工艺相对于酶解法生产简便, 不仅可以缩短生产周期, 也使核苷酸的产量大大增加, 是工业化生产核苷酸的理想途径 [11~13] 工业化生物催化法合成 UMP 通常以乳清酸为底物, 通过从头合成途径, 利用菌体自身产生的 5? 磷酸核糖焦磷酸 (PRPP), 经过两步酶反应合成 UMP( 图 1) [14] 参与反应的两个酶分别是乳清酸磷酸收稿日期 : 修回日期 : 国家 863 计划 (2006AA02Z236) 江苏省自然科学基金 (BK ) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :xulin@njut.edu.cn 核糖转移酶 (OPRTase,orotatephosphoribosyltransfe? rase,ec ) 和乳清苷酸脱羧酶 (ODCase, orotidinemonophosphatedecarboxylase,ec ) 即微生物细胞对生物催化法合成 UMP 的主要影响因素包括 PRPP 的供给, 以及两个反应酶 OPRTase 和 ODCase 的表达量和活性 [11] 本实验选用产生 PRPP 较为丰富的酿酒酵母为出发菌株, 利用基因工程的方法提高其两个反应酶的表达量来提高细胞催化产生 UMP 的能力图 1 乳清酸到 UMP 的催化途径 Fig.1 SynthesisofUMPfrom orotieacid

2 78 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 材料与方法 1.1 材料菌种和质粒酿酒酵母菌株 BJX12 由南京工业大学国家生化中心柏建新老师惠赠, 大肠杆菌 EscherichiacoliDH5α 为本室保藏, 质粒 pyx212 为江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心友情赠送酶与试剂酵母基因组提取试剂盒 ( 上海华舜生物工程有限公司 ), 质粒提取试剂盒 ( 上海申能博彩公司 ), 限制性内切酶 [ 英国纽英伦公司 (NEB)]; T4DNA 连接酶及低熔点琼脂糖 ( 美国 Promega 公司 ); PCR 反应试剂 TaqDNA 聚合酶及 DNAMarker( 大连宝生物工程公司 ); 酵母提取物, 胰蛋白胨 (OXOID 公司产品 ) 其余试剂均为国产分析纯培养基 YPAD 培养基用于酵母菌的培养和保存 LB 培养基用于大肠杆菌的培养和保存 SD?URA 培养基为含葡萄糖的酵母基本选择培养基 1.2 方法引物设计与合成搜索 SGD(Saccharomyces GenomeDatabase) 数据库, 根据 URA5 基因序列信息, 用 primer5.0 软件设计 PCR 扩增引物 P1:5? GCATGCCTATTATG TTGGAAGACTAC, P2: 5? GAATTAAGCGGAGGCACCGTAGG?3 构建表达载体所用的引物加设酶切位点,P3( 含 Hind I):5? CCCAAGCTTATGTTGGAAGACTAC?3,P4:( 含 NheI) 为 :5?CTAGCTAGCTTAAGCGGAGGCAC?3 所有引物均由上海申能博彩公司合成 URA5 基因的克隆采用上海华舜生物工程有限公司的试剂盒, 提取 S.cerevisiaeBY4742 基因组 DNA 以其为模板, 进行 PCR 扩增, 反应条件为 :94 变性 5min, 按如下参数循环 30 次 :94 变性 1min, 55 退火 50s,72 延伸 1min 最后 72 延伸 10min PCR 反应产物用 0.8% 的琼脂糖凝胶电泳分析结果 PCR 大量扩增目的基因后, 凝胶电泳分离纯化 PCR 产物, 胶回收目的基因将目的基因连接到 T?vector 上, 连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 用质粒电泳和酶切筛选鉴定阳性克隆在确认的阳性重组子中挑选两个对其进行序列测定将测序结果和所报道的序列用 Clustalx1 软件进行序列比对分析表达载体 pyx212?ura5 的构建以测序鉴定后的阳性克隆 (T?vector?URA5) 为模板, 用含酶切位点引物对进行 PCR 扩增然后, 将纯化后的 PCR 产物以及表达载体 pyx212 分别用 Hind I 和 NheI 进行双酶切胶回收酶切产物后进行连接反应连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 用质粒电泳和酶切筛选鉴定阳性克隆表达载体 pyx212?ura5 的构建过程详见图 2 图 2 重组质粒 pyx212?ura5 构建示意图 Fig.2 Constructionofrecombinant plasmidpyx212?ura 酵母菌的转化与鉴定大量提取重组质粒 pyx212?ura5, 用 pyx212?ura5 电转化酿酒酵母将得到的转化子用酵母溶壁酶 Lyticase 酶解 30min, 用冻溶法破碎细胞, 高速离心后以上清为模板,P3 P4 为引物进行 PCR 扩增, 电泳鉴定 PCR 结果乳清酸转化酿酒酵母培养条件 : 接种一环酵母菌于 150mlYPD 培养基中,30 200r/min 培养 16h 后转接入含 3L 新鲜 YPD 培养基的发酵罐中, 发酵条件 : 温度 30 通气量 3L/h 搅拌转速 300r/min 发酵培养 40h 下罐离心收集菌体, 用 ph7.0 缓冲液洗涤 2 次后, 于 -20 冻存备用转化条件 :100ml 去离子水中加入乳清酸 0.5g, MgSO g,NaH 2 PO 4 2g, 葡萄糖 8g, 氯化锰 0.01g, 甘油 1ml, 酵母 20g, 甲苯 2ml,NaOH 调节 ph 至 8.0, 30,200r/min 反应 26h 后取样检测 UMP 生成量

2008,28(12) 雷高新等 : 酿酒酵母中过表达 URA5 及 URA3 基因催化合成 UMP 的初步研究 79 1.2.6 产物检测细胞干重测定 : 取 5ml 转化液, 3000r/min 离心, 收集沉淀于 100 下烘烤 24h 至恒重, 称重 UMP 测定 :HPLC 法 ( 高效液相色谱仪型号 Agilent1100, 色谱柱 SepaxHP?C18,4.

ura5 转化子细胞破碎液以 P3 P4 为引物作 PCR 扩增, 同时以野生型为阴性对照, 电泳结果如图 5 所示, 获得一条 681bp 的扩增片段, 证明所获转化子为含有 pyx212?ura5 的重组酵母菌未经电转的原始菌株不能获得 681bp 的扩增片段 2 结果 2.1 克隆重组子 (T?vector) 的鉴定与测序分析 PCR 产物在 0.

3 2008,28(12) 雷高新等 : 酿酒酵母中过表达 URA5 及 URA3 基因催化合成 UMP 的初步研究产物检测细胞干重测定 : 取 5ml 转化液, 3000r/min 离心, 收集沉淀于 100 下烘烤 24h 至恒重, 称重 UMP 测定 :HPLC 法 ( 高效液相色谱仪型号 Agilent1100, 色谱柱 SepaxHP?C18, mm) 色谱条件为 : 流动相 : 磷酸水 =3 500( 三乙胺调 ph 值到 6.6), 流速 :1ml/min,261nm 条件下检测至少三次重复实验得出的较为稳定数值作为统计数据化酿酒酵母, 在不含尿嘧啶的 SD 平板上各获得了转化子其中 pyx212?ura5 转化子细胞破碎液以 P3 P4 为引物作 PCR 扩增, 同时以野生型为阴性对照, 电泳结果如图 5 所示, 获得一条 681bp 的扩增片段, 证明所获转化子为含有 pyx212?ura5 的重组酵母菌未经电转的原始菌株不能获得 681bp 的扩增片段 2 结果 2.1 克隆重组子 (T?vector) 的鉴定与测序分析 PCR 产物在 0.8% 琼脂糖凝胶上电泳检测扩增片段 ( 图 3) 结果显示扩增片段大小约为 681bp, 与预期一致将 PCR 产物回收与 T?vector 连接, 连接产物转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞对得到的阳性重组子提质粒, 经 PCR 鉴定后测序验证将测序结果和 SGD 数据库的基因序列经 Clustalx1 软件进行序列比对分析结果显示两条序列一致性为 100%, 证明已成功克隆了 URA5 基因图 4 重组质粒 PYX212?URA5 的酶切鉴定 Fig.4 Hind IandNheIdigestofrecombinant plasmidpyx212?ura5 1:PYX212?URA5/Hind IandNheI; Marker:DL2000 图 3 乳清酸磷酸核糖转移酶基因 URA5PCR 扩增产物 Fig.3 PCRproductofURA5 1:PCRproduct;Marker:DL 表达重组子的构建筛选与鉴定以经测序鉴定的阳性克隆 (T vector?ura5) 为模板, 用引物对 PCR 进行扩增胶回收 PCR 产物将得到的 PCR 产物及表达载体 pyx212 同时用 NheI 和 Hind I 双酶切分别胶回收两种酶切产物后连接筛选阳性克隆, 经 NheI 和 Hind I 酶切鉴定, 电泳结果见图 4, 表明外源片段已经正确连接到表达载体上 2.3 重组酵母菌的构建用重组质粒 pyx212?ura5 及空质粒 pyx212 电转图 5 重组酵母菌 pyx212?ura5/bjx12 的 PCR 鉴定 Fig.5 Identificationofrecombination S.cerevisiaebyPCR 1:PYX212?URA5/BJX12;2:BJX12;Marker:DL 乳清酸转化将所获得的 pyx212?ura5/bjx12 pyx212/ BJX12 野生型 BJX12 菌株分别发酵培养 40h 后离心获得菌体, 再以 32mmol/L 乳清酸为底物催化反应 26h 后,UMP 产量乳清酸转化率及菌体干重浓度如表 1 所示 pyx212?ura5/bjx12 催化乳清酸转化 UMP 的能力明显高于 pyx212/bjx12 和对照组野生型 BJX12

4 80 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 表 1 3 个菌株的 UMP 产量与乳清酸转化率 Table1 TheUMPyieldandtransformationeficiencyof oroticacidinthreediferentstrains 菌株名细胞干重 (g/l) UMP 产量 (mmol/l) 转化率 (%) pyx212?ura5/bjx12 62±0.8 7± ±0.9 pyx212/bjx ± ± ±0.3 3 讨论 BJX ± ± ±0.3 实验中设计选用的表达载体 pyx212 是一种酵母菌游离型载体, 在大肠杆菌和酵母菌中都能稳定存在, 其携带的 TPI 启动子是一组成型表达的酿酒酵母强启动子由于载体 pyx212 本身含有编码 ODCase 的基因 URA3, 因此当 URA5 基因插入 pyx212 后可以实现 OPRTase 和 ODCase 在酿酒酵母中的过量表达利用高效表达 OPRTase 和 ODCase 的酿酒酵母菌株初步进行了乳清酸转化到 UMP 的研究, 从转化结果发现 pyx212?ura5/s.cerevisiae 发酵培养 40h 后以 32mmol/L 乳清酸为底物催化反应 26 小时后,UMP 产生量为 7mmol/L 约是同等条件下 pyx212/bjx12 和野生型 BJX12 的 UMP 产量的 3 倍 pyx212/bjx12 对照组为仅带有 ODCase 单酶基因过表达组, 其催化乳清酸转化到 UMP 的产物量的增加不明显, 结果表明, OPRTase 作为从乳清酸合成 UMP 的第一步反应酶是合成 UMP 的关键酶, 也是催化乳清酸和 PRPP 合成乳清苷酸, 进一步合成 UMP 的限速步骤, 在酿酒酵母中过量表达 OPRTase 可以较大幅度提高其催化乳清酸合成 UMP 能力酵母体系操作简便, 是基因工程领域最常用的宿主系统之一由于酵母系统本身不含内毒素, 因而与原核系统相比在临床应用方面具有明显的优越性运用酿酒酵母进行生物催化法生产 UMP 在国内外均未见报道本工作为利用酿酒酵母通过生物催化法生产 UMP 奠定了一定基础, 下一步将进行该重组菌株发酵及催化工艺的条件优化, 希望可以达到进一步提高 UMP 产量的目的参考文献 [1]AdjeiAA,YamauehiK.Dietarynucleosidesanduncleotides improvecel?mediatedimnunityinmice.jnutrimmunol, 1996,4:23~35 [2] 汪余勤, 程五风, 李宣海. 核苷酸与营养. 国外医学. 卫生学分册,1999,26(5):257~260 WangY Q,ChengW F,LiX H.ForeignMedicalSciences (SectionHygiene),1999,26(5):257~260 [3]SandersonIR,HeY.Nucleotideuptakeandmetabolism by intestinalepithelialcels.jnutr,1994,124:131~137 [4]TabataK,KoizumiS,EndoT,etal.ProductionofUDP?N? acetylglucosamine by coupling metabolicaly engineered bacteria.biotechnollet,2000,22:479~483 [5]LeeHC,LeeS,SohngJK,etal.One?potenzymaticsynthesis ofudp?d?glucosefromumpandglucose?1?phosphateusingan ATPregenerationsystem.JBiochemMolBiol,2004,37:503 ~506 [6] 邬小兵, 乐国伟, 施用晖. 外源核苷酸对婴幼儿的营养作用及其在代乳品中的应用. 食品科技,2000,5:17~19 WuXB,YueGW,ShiYH.FoodScienceandTechnology, 2000,5:17~19 [7]VarkiA.Biologicalrolesofoligosaccharides:alofthetheories arecorect.glycobiology,1993,3:97~130 [8] 武田药品工业株式会社.5? 核苷酸的生产方法.CN A,1994?05?04 TaketaPharmaceuticalCompaxyLimited.Methodofproducing 5?nucleotide.CN A,1994?05?04 [9]FujimotoM,KunlmakaA,YoshinoH.Specificityofnuclease frompenicilium.agrbiolchem,1969,33:1517~1518 [10] Fujian Furuya. Production of ATP from adenine by Brevibacterium ammoniagenes.jfermenttechnol,1983,61: 261~267 [11]FujioT,MaruyamaA.Enzymaticproductionofpyrimidine nucleotidesusing Corynebacterium ammoniagenescels and recombinantescherichiacolicels:enzymaticproductionofcdp? cholinefromoroticacidandcholinechloride(partⅠ).biosci BiotechBiochem,1997,61(6):956~959 [12] Nahálka J,Liu Z Y,Gemeiner P, etal. Nucleoside triphosphatesproduction usingrecombinantescherichia coli. entrappedincalciumpectategel.biotechnollet,2002,24:925 ~930 [13]MaruyamaA,FujioT.ATP?productionfromadeninebyaself? couplingenzymaticproces: high?levelaccumulation under ammonium?limited conditions. BiosciBiotechnolBiochem, 2001,65:644~650 [14]WangX,YinM.Productionofuridine5?monophosphateby CorynebacteriumammoniagenesATCC6872usingastatisticaly improved biocatalytic proces. ApplMicrobio Biotechnol, 2007,76:321~328

5 2008,28(12) 雷高新等 : 酿酒酵母中过表达 URA5 及 URA3 基因催化合成 UMP 的初步研究 81 PrimaryStudyofProducingUMPbyOverexpresingURA5andURA3 GenesinSaccharomycescerevisiae LEIGao?xin CHENYong XULin YINGHan?jie (ColegeofLifeScienceandPharmaceutical,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing ,China) Abstract Toincreasethebiotransfomationeficiencyfromtheoroticacidtotheuridine5?monophosphate (UMP),URA5 geneencodingorotatephosphoribosytransferasewasamplifiedfrom Sacharomycescerevisiae BY4742byPCR,thenitwasinsertedintotheexpresionvectorpYX212(containedorotidinemonophosphate decarboxylasegeneura3)andthepyx212?ura5wastransformedintosacharomycescerevisiaebjx12by electroporation.therecombinantstrainwaselementarilyusedtoconvertoroticacidtoump.theresultsshowed thatpyx212?ura5/bjx12couldaccumulate7mmol/lumpfrom32mmol/loroticacidin26h,significantly higherthanbothcontrolgroupspyx212/bjx12(2.7mmol/l)andbjx12(2.4mmol/l). Keywords Orotatephosphoribosytransferase(OPRTase) Biocatalysis Sacharomycescerevisiae Uridine5?monophosphate(UMP) Orotidinemonophosphatedecarboxylase(ODCase)

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

78 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 材料与方法 1.1 材料 菌种和质粒酿酒酵母菌株 BJX12 由南京工业大学国家生化中心柏建新老师惠赠, 大肠杆菌 EscherichiacoliDH5α 为本室保藏, 质粒 pyx212

78 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.28No 材料与方法 1.1 材料菌种和质粒酿酒酵母菌株 BJX12 由南京工业大学国家生化中心柏建新老师惠赠, 大肠杆菌 EscherichiacoliDH5α 为本室保藏, 质粒 pyx212