期 江学斌等 猪源抗菌肽 在毕赤酵母中的表达及鉴定 剂来调节机体免疫系统 在抗感染中发挥重要作 用 抗菌肽成为新一代的抗菌 抗病毒 抗癌药物 但天然抗菌肽的来源少 成本高 无法满足临床试用和基础研究的需要 而人工合成成本高 所以 采用重组表达的方法可大量获得抗菌肽 以满足其抗菌作用机理研究及开发成一

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1 中国畜牧兽医! " 猪源抗菌肽 / 2 在毕赤酵母中的表达及鉴定 江学斌 陈嘉蔚 杨 军 刘顺枝 肖安吉 卢志鹏 楚品品 黄朝远 蔡海明 马苗鹏 张玲华 广州大学生物工程研究所 广州 华南农业大学生命科学学院 广东省农业生物蛋白质功能与调控重点实验室 广州 摘 要 本试验旨在实现猪 防御素 /&!!!1 在毕赤酵母中的表达 获得有抗菌活性的抗菌肽 1 根据 的氨基酸序列和酵母密码子偏好性 设计优化其核苷酸序列 利用, +) 技术获得 &%1 基因序列 克隆到毕赤酵母表达载体 /+- 中 构建重组质粒 /+-1 经 线性化后转入毕赤酵母 ; 1 中 +) 筛选得到阳性酵母表达菌株 经甲醇诱导后得到分子质量约 9 的抗菌肽 抗菌特性研究结果表明 表达产物抗菌肽 对大肠杆菌 金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌均有较好的抑制效果 关键词 &%1 基因 表达 毕赤酵母 +) 中图分类号 5 1 文献标识码 文章编号 &" 7! %!%/ " )! 0 " /!/ 2! " D 379! +,D! 3D /! + 0/ 03+%9 + ; ;/! (!!! & '-! ' 3!(!!&!!'-!!! -! ' )!"!&!&"/&9! " & /!/"!" " "%)! &"/9!!:9!! "!/&" "% %! ""! &%!! /! %, +)! "/+- " "&9 "&! "!'/&!! "&/+-!&! "! "&!&! % "! "& &! " ; 1 %!! "&/&" "!%! "!'/&!"& "! % +)! " & /!/"! //&'"! % 9!'/&!! %!" 9 "" "!& " "%%!"""! " & /!/"!!"!& " "!& " "% " 3 3 &3! +, " &%1!!!'/&!)!+) 猪 防御素 /&!!! 是广泛分布于呼吸道 消化道 肝脏等多种组织细胞内 的一类活性多肽 它们主要通过作用于病原体的细胞膜来发挥抗菌功能 不会诱发细菌的耐药性 具 有广谱抗菌活性 对大肠杆菌 鼠伤寒沙门杆菌 李斯特菌和白色念珠菌 金黄色葡萄球菌均有良好的杀菌活性 对博德特氏菌引起的猪呼吸系统疾病有 明显的免疫保护作用 同时 也可以作为免疫调节 收稿日期 1 基金项目 广州市属高校科技计划项目 作者简介 江学斌 -- 男 江西南昌人 讲师 博士 研究方向 发酵工程,' 通信作者 张玲华 - 女 浙江宁波人 博士 教授 研究方向 动物疫苗的研制及动物免疫提升剂抗衰老的机理, 9!9! 11 1-

2 期 江学斌等 猪源抗菌肽 在毕赤酵母中的表达及鉴定 剂来调节机体免疫系统 在抗感染中发挥重要作 用 抗菌肽成为新一代的抗菌 抗病毒 抗癌药物 但天然抗菌肽的来源少 成本高 无法满足临床试用和基础研究的需要 而人工合成成本高 所以 采用重组表达的方法可大量获得抗菌肽 以满足其抗菌作用机理研究及开发成一类新型抗菌药物 巴斯德毕赤酵母 )! 是目前最广泛的外源蛋白表达系统之一 具有生长速度快 表达量高 能对外源基因进行正确翻译和修饰等优点 克服了大肠杆菌表达的蛋白难以进行翻译后修饰和加 工的缺点 也克服了酿酒酵母菌 - 缺乏强有力的启动子 分泌效率差 表达 菌株不够稳定 表达质粒易于丢失等缺点 鉴于毕赤酵母表达系统的优势及应用前景 本试验在已知 氨基酸序列的基础上 根据毕赤酵母密码子的偏好性 设计优化了 &%1 基因 通过分泌表达载体 /+- 导入毕赤酵母 ; 1 中 最终获得的毕赤酵母表达菌株能高效表达具有较好生物活性的抗菌肽 材料与方法 - 材料 /+- 质粒 大肠杆菌 F 感受态细胞和毕赤酵母 ; 1 感受态细胞均由广东省农业生物蛋白质功能与调控重点实验室保存 连接酶 限制性内切酶 % 9!& & &! " +) 均购自 ) 公司 小量质粒抽提试剂盒 +) 产物纯化试剂盒 琼脂糖凝胶回收试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司 其他常用试剂均为国产分析纯 - 方法 引物设计与合成 根据 的氨基酸序列 选用毕赤酵母的偏嗜密码子 对其核苷酸序列进行改造 并在基因的两端分别引入 ) 和 +! 酶切位点 利用 &!& &!!& 软件设计 条, +) 扩增引物 和 各引物有 / 左右的重复序列 引物 2 和 ) 引入酶切位点 ) 和 +! 引物序列信息见表 &%1 基因片段扩增 +) 反应体系 条, +) 扩增引物 各 ;' 各 1 A +) 9!&27 聚合酶 双蒸水补至 混匀稍离心 置于 +) 仪上 +) 反应条件 - > 预变性 - > 变性 > 退火 1 > 延伸 个循环 > 延伸 反应完毕后 取 +) 产物于 琼脂糖凝胶电泳检测结果 并用 +) 产物纯化试剂盒回收 获得 &%1 基因 表 引物序列 /" 0 " 1 引物名称 &!&! 引物序列 ( ( &!&!:9!! ) "& 重组载体的构建与鉴定 以 &%1 基因为模板 2 和 ) 为引物扩增 获得带有 ) 和 +! 酶切位点的 &%1 基因 反应条件同上 反应产物纯化回收 将 &% 基因和 /+- 质粒进行 ) 和 +! 双酶切 利用胶回收试剂盒回收酶切产物 > 下 连接酶作用 将目的片段连入 /+- 质粒中 连接产物转化大肠杆菌 感受态细胞 取 转化菌液 涂布于含有 的 平板上 > 培养 1 挑取平板上的单菌落 运用特异性引物 2 和 ) 进行 +) 鉴定 将阳性菌株送至上海生工生物工程技术服务有限公司测序 将最终获得含有目的片段的重组质粒 命名为 /+- 酵母重组子的构建及鉴定 应用 酶对重组质粒 /+- 进行单酶切 获得线性化的重组质粒 将线性化的重组质粒 /+-

3 中 国 畜 牧 兽 医 卷 与制备好的毕赤酵母 ; 1 感受态细胞混合于电击杯中 放入电转化仪中 以? 2 > 的条件进行电击 取 1 转化菌液涂布于 ; 平板上 培养 1 随机挑取单菌落于 % 9!& & &! " +)1 > 取 裂解产物作为模板 利用通用引物 2 "& 和基因的下游引物 ) 进行 +) 扩增 取阳性克隆分别依次点种于含不同浓度 31 和 的 平板上进行高抗筛选 表达产物的鉴定及抑菌活性检测 重组菌株的诱导表达及检测 将筛选到的高拷贝菌株接种至 ;3 培养基中 > 培养 再转入 甲醇的 ;; 培养基中进行诱导表达 每 补加 次甲醇 后离心收集培养上清 取 表达上清 进行 &!3, 鉴定 琼脂孔穴扩散法检测抑菌活性 以大肠杆菌 金黄色葡萄球菌及枯草芽孢杆菌为指示菌株 进行抑菌活性测定 以空质粒转化酵母 ; 1/+- 为阴性对照 以 / 为阳性对照 在含有指示菌的平板打孔 每孔添加 诱导上清 > 培养 检测抑菌活性 结果与分析 -! 基因克隆 本试验合成的 &%1 基因序列全长为 / 序列依次为 保护碱基 ) 酶切位点 氨基酸编码序列 +! 酶切位点及最后保护碱基 +) 扩增片段经 琼脂糖凝胶电泳检测后 得到 / 的单一条带 图 与预期扩增片段大小一致 图! 基因的 / 扩增电泳图 -/0 % "! %! - 重组质粒 /7 +/ 2 的鉴定结果 采用特异引物 2 和 ) 对菌落进行 +) 筛选 可扩增出 / 左右的片段 图 与 预期结果相符 提取的重组质粒 /+- 经测序结果正确 ; ;&!& +- 重组子菌落 +) 产物 ; ;&!& +)/&9 "&! "/ /+- 图 重组质粒 /7 +/ 2 菌落 / 鉴定 -/! %!%"0!0/7 +/ 2

4 期 江学斌等 猪源抗菌肽 在毕赤酵母中的表达及鉴定 - 酵母重组子的鉴定用 % 9!& & &! " +) 制备 +) 模板 通用引物 2 "& 和基因的下游引物 ) 筛选阳性克隆 由图 可知 - 及 泳道可见 / 左右的片段 即为阳性克隆 线性化重 组质粒 /+- 与酵母细胞染色体发生同源重组 酵母重组子 ; 1/+- 构建成功 经 31 筛选后 得到 株抗 31 的阳性菌株 ; ;&!& 酵母重组子 +) 产物 ; ;&!&+)/&9 "&! " )! 图 酵母重组子 / 鉴定电泳图 -/! %!%"0!! " - 酵母重组子表达产物的检测对上述筛选到的阳性酵母重组子进行诱导培养 取 诱导表达 的发酵上清进行 &!3, 检测 结果显示 在分子质量约 9 处有特异蛋白条带 图 与预期分子质量大小相符 而阴性对照未出现相应蛋白条带 表明抗菌肽 得到表达 ; 蛋白质分子质量标准 ; 1/+- 诱导表达 上清 阴性对照 ; &"! ;&!& 9/!& " "; 1/+- 9! &! "!"& 图 酵母重组子表达上清的 " 2 /)(& 分析 -" 2 /)(& % "!! %"0!! " - 抑菌活性鉴定结果抑菌活性测定结果显示 抗菌肽 可对大肠杆菌 金黄色葡萄球菌 枯草芽孢杆菌产生明显的抑菌圈 其中 对大肠杆菌的抑菌直径最大 金黄色葡萄球菌次之 最后为枯草芽孢杆菌 图 这说明 大肠杆菌对抗菌肽 最为敏感 其次是金黄色葡萄球菌 最后是枯草芽孢杆菌 结果表明 抗菌肽 对革兰氏阳性 阴性细菌均有良好的抑制效果

5 ()I 中!国!畜!牧!兽!医 ) 卷! B! BVG 对照) A!抗菌肽纯品) %!阴性对照) 0')!诱导 0)'/06 表达上清 B! BVG, L) A! B V, 2 5 LG3G "3) %! R3;5 _3, L) 0! )! =WG3-5 5 ^=Y>%%(I!GM\CEN!M?>! % -"W, 3" ^ 0) /06 图 '! 抗菌肽 G?PR 的抑菌活性 K '!FL =03 B0 6 3 = S 3 7G?PR /E :, 效率高'能 利 用 甲 醇 作 为 唯 一 碳 源 等 优 点 %+& 另 &! 讨! 论 外!其 细 胞 内 无 天 然 质 粒!而 GM\CEN 为 整 合 型 载 抗生 素 在 畜 禽 养 殖 业 的 滥 用!细 菌 抗 药 性 越 来 体!将含有目的基因 的 表 达 载 体 通 过 同 源 重 组 的 方 越普遍!长期使用抗 生 素 造 成 畜 禽 机 体 的 免 疫 力 下 式整合到酵母染色 体 中!从 而 获 得 目 的 基 因 稳 定 整 降!引起畜禽肠道菌群失衡!在畜产品和环境中造成 合的表达工程菌株!防 止 了 重 组 表 达 载 体 随 酵 母 的 &抗菌肽是生物体内 繁殖而丢 失 的 危 险 %)+& 试 验 首 先 根 据 毕 赤 酵 母 密 经诱导产生的一种 具 有 生 物 活 性 的 小 分 子 多 肽!在 码子偏好性对抗菌肽 M?>! % 进 行 优 化!使 其 适 合 在 哺乳动物体内主要有 >3 ^ 3-: -:和 C5 63 L, " -:两 酵母中表达)其次!将基因克隆到酵母分泌表达载体 残留!进而威 胁 到 人 类 健 康 /+ I+ 耐药性等特点!不仅 可 以 抗 病 及 增 强 动 物 机 体 的 免 1K 甲醇诱导!重 组毕 赤酵 母 GM\CEN 上)最后!经 &' 成功地分泌 并 表 达 了 抗 菌 肽 M?>! %& 抑 菌 试 验 中! 疫力!还可提高 料 重 比 E+!是 抗 生 素 理 想 的 替 代 品! 以 =Y>%%(I! GM\CEN 表达上清作为阴 性对 照!结 果 大类 &与传统抗 生 素 相 比 具 有 无 药 残'不 易 产 生 同时也可作为一种高效优质的 绿 色 饲 料 添 加 剂 %&+ & 但从生物体中提取 的 天 然 抗 菌 肽 含 量 极 低!提 取 工 %%+ 显示其并未引起抑菌效果!因此!可认为抑菌效果确 实是由 M?>! % 产生的&另外!重组抗菌肽 M?>! %分!且 资 源 有 限!化 学 合 成 子质量约为 )' 1W!常 规 甘 氨 酸 电 泳 难 以 得 到 理 想 制备难以保持抗菌 肽 的 天 然 结 构 及 活 性!采 用 基 因 的分辨率!因此!本试验中采用三羟甲基甘氨酸代替 工程方法生产抗菌肽是解决问题的一条经济有效的 甘氨 酸! M?>! % 获 得 较 好 的 分 辨 率!所 表 达 的 抗 菌 艺复杂!肽体外活性不高 %0+ 肽 M?>! % 对大肠杆菌'金黄色葡 萄 球 菌 和 枯 草 芽 孢 本研 究 选 择 毕 赤 酵 母 表 达 系 统!除 具 有 原 核 表 杆菌均有较好的抑菌活性&本试验成功分泌并表达 达系统的优点外!还 具 有 稳 定 性 高'表 达 量 高'分 泌 了具有生物活性的抗 菌 肽 M?>! %!为 M?>! %生物特 途径 &

6 期 江学斌等 猪源抗菌肽 在毕赤酵母中的表达及鉴定 性的进一步研究和开发新型抗菌药物奠定了基础 参考文献 6 3E9 D;! 9 & "9!!'/&!//&!!!D&! & 9!!" + & "!& ""!!! &!!!3! "&9 "9&! & "!!! & """9"!!'/&!D & --- 程 驰 孙文魁 陈义辉 等 )&% 和 ( - 基因在藏猪与约克夏猪免疫组织中的表达水平的比较研究 D 内蒙古农业大学学报 & %!& ;!" ;9"/!&! " &!! "!! /!&!!9&"' "!!! D(- 1!!& + 3!! 3 &9 "&! "/&"! %!"% "&/ %! "D,) &! -- 1 "! )!2,!!!",'/&! 9!! & "!&!&%! " D +1! -1-1 舒黛廉 任 敏 王 钰 等 抗菌肽研究现状及其在 - 畜牧业中的应用前景 D 中国畜牧兽医 1 晏家友 张 纯 唐 凌 等 抗菌肽 3 的研究进展 D 中国畜牧兽医 -- - 江学斌 张敏静 林健聪 等 抗菌肽 +! &/ 在毕赤酵母中的组成型表达及中试发酵研究 D 饲料工业 -- 李 波 韩文瑜 日粮中添加天蚕素抗菌肽对断奶仔猪生产性能 免疫性能及血清生化指标的影响 D 中国畜牧兽医 -- &!!?!" "9&! "!!!/!/"! " % "! " "!&! % D 0 &- - 张庆华 王 青 尚田田 等 抗菌肽的活性机制及其分子设计研究进展 D 中国畜牧兽医! D &!&E?!! 9 ;% "!! % '!/!&' "&'/& "!!"% "&/ %! " D!-- -- 郭春和 焦茂兴 何 俊 等 抗菌肽 )% 基因在毕赤酵母中的表达与抗菌活性分析 D 中国预防兽医学报 1-1 责任编辑 吴 艳

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