中国畜牧兽医卷疱脓疱痂皮为主要特征羊口疮不仅给中国畜牧业造成巨大的经济损失而且严重威胁着人类的健康 $)% 属于痘病毒科副痘病毒属病毒对乙醚和氯仿较敏感紫外线照射可使其在短时间内失活病毒基因组全长约 8 中央编码区 $)$) 比较保守 $) 位于病毒基因组中部高度保守区

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庸易
5 years ago
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1 中国畜牧兽医! " # 羊口疮病毒,! 基因的真核表达研究朱姝庞峰李国华李亚颖彭冬梅杨小健聂鑫曹瑞勇王凤阳杜丽海南大学农学院海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室海口市动物基因工程重点实验室海口! 摘要试验旨在扩增羊口疮病毒 0:'0/$)%1- 基因并进行真核表达提取羊 $)% & 弱毒株基因组为模板参照 (- 上 1- 的基因序列利用 +,,+ 设计引物应用 $ 扩增 $) 目的片段凝胶回收后将其连入.&()+ 质粒构建重组质粒.&()$)+ 测序正确后瞬时转染 + 细胞应用荧光显微镜观察 > 鉴定融合蛋白的表达结果表明 1- 基因片段大小为 8. 重组质粒.&()$)+ 构建正确转染.&()$)+ 的 + 细胞有明显的绿色荧光表达的融合蛋白大小约为 / 本试验结果为进一步研究 $) 的作用机理奠定了基础关键词羊口疮病毒 1- 基因真核表达 + 细胞中图分类号 2! 文献标识码, 文章编号,*",/#-"6-')).,!%''.3-.-,) C5#4/,+()-6(/4/76&+(6*-7,+(B+&B,$/6>,+( )-665 &!&&,!#+' '& &!&!&& )&#&#!& '+#( #& $&# &' &'#!!&! 0)-#4-1/9*-1--; :0:'0/$)%4-6- *-:$)% &1-/1-'-109-;101-/-14-1-* : /--:1-6--(-14-.-:.0* :06*-1:1-6--9*.:-8$,: /0: &()+'-10110/10-*81.*.&()$)+,: / *81.*.&()$)+910: *-4--;.0-::/ :-814-:/0---* '1> / * 81.*.&()$)+ 910/1-00-1(0--:/0---/8-8 -0'- +-10:-1-8.&()$)+/-014-:/0--- * ;.0--:/.01-98/1/4-0-/1:/1:014-:/ *-4*:$) 1'"-*)$)%1-6---/01-;.0-+- 羊口疮又称羊传染性脓疱 16/-14 *& 是由羊传染性脓疱病毒 0:'0/$ )% 引起的一种人畜共患传染病主要感染羔羊和幼羊以口唇舌鼻乳房等部位形成丘疹水收稿日期基金项目海南省重大科技计划项目 C" 作者简介朱姝女江苏镇江人硕士生研究方向动物功能基因组学 &*33* 通信作者杜丽教授硕士生导师研究方向预防兽医学 &*4!*

2 中国畜牧兽医卷疱脓疱痂皮为主要特征羊口疮不仅给中国畜牧业造成巨大的经济损失而且严重威胁着人类的健康 $)% 属于痘病毒科副痘病毒属病毒对乙醚和氯仿较敏感紫外线照射可使其在短时间内失活病毒基因组全长约 8 中央编码区 $)$) 比较保守 $) 位于病毒基因组中部高度保守区域即第个完整阅读框编码 / 蛋白是主要的肝素结合活性蛋白能够与大多数哺乳动物细胞表面表达的硫酸乙酰肝素受体结合对于病毒吸附和入侵细胞起着一定的作用 $) 表达的蛋白存在黏多糖结合位点在 $)% 感染细胞早期 $) 表达的蛋白与黏多糖结合吸附到细胞表面进而感染细胞同时该蛋白是羊 $)% 表面微管的组成成分之一能够刺激机体产生中和抗体也能诱导细胞介导的免疫应答因而该蛋白被认为是机体产生免疫应答的主要免疫原蛋白同时也被认为是 $)% 亚单位疫苗研制的目的基因当前国内用于预防羊口疮的疫苗大多为弱毒株而弱毒株存在毒力反弹等缺陷所以研制高效的基因工程疫苗是必然趋势本试验对 $)% 1- 基因进行扩增和真核表达为进一步研究 $) 的蛋白功能及研制新的核酸疫苗奠定了基础材料与方法材料 $)% 基因组提取自羊 $)% & 弱毒株由海口市动物基因工程重点实验室保存.&() + 质粒载体 + 细胞均由海口市动物基因工程重点实验室保存大肠杆菌感受态细胞由海口市动物基因工程重点实验室氯化钙法制备 & 完全培养基由海口市动物基因工程重点实验室配置并保存病毒基因组 +, 小提试剂盒质粒提取试剂盒胶回收试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司 +#&$ 和 " 限制性内切酶均购自 $ 公司,60- 购自 9-1 公司, 显色液购自 4-0*)4-0 公司琼脂糖凝胶电泳装置购自北京六一仪器厂 &..-0: $ 仪购自德国 &..-0: 公司 ##,(& 电泳装置 2/1 - 凝胶成像仪! 酶标仪均购自美国 $ 公司 *./B 倒置显微镜购自日本 *./ 公司引物设计与合成根据在 (- 中查找的 $)% +C1- 基因序列登录号,7! 利用 +,,+ 软件设计对引物引物序列为 $))((,,,(,((,,(,,,,( 下划线部分添加的酶切位点是 "$)$ (((,,(,(,((((,,( 下划线部分添加的酶切位点是 +#&$ 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成 3& 基因组的提取按照病毒基因组 +, 小提试剂盒步骤取弱毒疫苗加 /:-0%(01-- 和 00-0$+, < 温浴 * 向裂解液加入无水乙醇溶液移至 #./* 中弃滤液 /:-0$>, 清洗 /:-0$> 清洗弃滤液将 #./* 移至 * $+-:0--1/8- 上加入 $+-:0-- 静置 *0* 离心 * ( 扩增,! 基因以 $)% 基因组为模板 $)) 和 $)$ 为引物用 $ 方法扩增目的片段 $ 反应程序 < 预变性 * < 变性! < 退火 < 延伸个循环 < 延伸 * < 终止反应反应结束后用 = 琼脂糖凝胶电泳对产物进行检测并用 +, 胶回收试剂盒纯化 $ 产物重组质粒 %&(3& 的构建与鉴定用限制性内切酶 " 和 +#&$ 双酶切 $ 产物和.&()+ 载体分别回收纯化 1- 基因片段和线性化的.&()+ 载体在 +, 连接酶的作用下 < * 将 1- 基因定向插入.&()+ 载体转化大肠杆菌感受态细胞挑取阳性克隆菌落 < 过夜摇菌提取质粒命名为.&()$)+ 用 " 和 +#&$ 对重组质粒.&()$)+ 进行酶切再利用琼脂糖凝胶电泳鉴定正确后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序重组质粒 %&(3& 转染 +! 细胞 + 细胞用含 = 胎牛血清的高糖 & 培养基常规培养转染前 4 用 = 胰酶消化对数期生长的细胞接种于孔板每孔? 细胞等到细胞融合度达 = = 时按.:-1*- 操作说明书将重组质粒转

聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到 %) 膜上用含 = 脱双酶切鉴定重组质粒 %&(3& 将.&()+ 载体和 $) 片段连接获得的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞大量扩增用试剂盒提取质粒 " 和 +#&$ 酶切重组质粒得到和 8. 两条带图说明 1- 基因已经成功插入.&()+ 载体中重组质粒.

3 期朱姝等羊口疮病毒 1- 基因的真核表达研究染到 + 细胞中同时设置对照组.&() + 转染至 + 细胞和未转染组转染 4 8 荧光显微镜观察转染 4 后将长有细胞的孔板放置在倒置荧光显微镜的载物台上荧光观察可见试验组与对照组细胞中绿色荧光蛋白表达情况 ;')'-$2 检测融合蛋白观察结束后用移液抢吸掉旧的培养基加 *& 洗涤细胞次用 = 胰酶消化收集各组细胞用预冷的细胞裂解液裂解细胞处理收集蛋白用酶标仪检测蛋白浓度再进行 = 聚丙烯酰胺凝胶电泳后转移到 %) 膜上用含 = 脱双酶切鉴定重组质粒 %&(3& 将.&()+ 载体和 $) 片段连接获得的重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞大量扩增用试剂盒提取质粒 " 和 +#&$ 酶切重组质粒得到和 8. 两条带图说明 1- 基因已经成功插入.&()+ 载体中重组质粒.&()$)+ 构建成功脂奶粉的 # 室温封闭 4 取出后用含 * 9-- 的 # 洗涤次每次 * 稀释的羊抗 &() 多克隆抗体作为一抗室温孵育 4 再次用含 *9-- 的 # 洗涤次每次 * 稀释的 $ 标记的兔抗羊 6( 作为二抗室温孵育 4 再用上述方法洗涤最后按! 比例加入, 显色试剂, 液液和超纯水配制成显色液均匀滴加到 %) 膜上显色并进行曝光检测拍照结果与分析 ( 扩增,! 基因琼脂糖凝胶电泳结果显示在 8. 处出现特异条带图测序结果显示该目的片段与 (- 中提供的 $)% +C $) 同源性为 = 表明 $) 扩增正确图,! 基因 ( 扩增电泳图 &2( #$.#.,!2'' #+," +, 0-0 质粒.&()+.&()$)+ 双切鉴定结果 +, 0-0 #+," +, 0-0.&()+. */8--*-6-1-1:1:.&() $)++, 0-0 图重组质粒 %&(3& 双酶切鉴定图 &29,$''4"'*2')*'.#.-' #$#)*%&(3& 荧光显微镜观察重组质粒.&()$)+ 转染 + 细胞 4 后在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达情况结果见图由图可知转染空质粒.&()+ 和重组质粒.&()$)+ 的细胞都有明亮的绿色荧光未转染的细胞组没有绿色荧光 ;')'-$2 检测 %&(3& 融合蛋白由图可知未转染的 + 组没有出现任何条带转染空质粒.&()+ 的细胞表达蛋白在 / 处有一条特异性条带转染重组质粒.&( )$)+ 的细胞蛋白在约 / 处有特异条带符合 &()$) 融合蛋白的理论值大小结果显示重组质粒.&()$)+ 在 + 细胞中成功表达

中国畜牧兽医卷, 未转染细胞转染空质粒.&()+ 细胞转染重组质粒.&()$)+ 细胞,510:-1---10:-1-8.*.&()+-100:-1-80-*81.*.&() $)+ 图转染 5 后荧光显微镜观察结果? &2&$,-')''-)')'-#-'),$)#.'--#).'25? 未转染细胞转染空质粒.&()+ 的细胞转染重组质粒.

4 中国畜牧兽医卷, 未转染细胞转染空质粒.&()+ 细胞转染重组质粒.&()$)+ 细胞,510: :-1-8.*.&()+-100:-1-80-*81.*.&() $)+ 图转染 5 后荧光显微镜观察结果? &2&$,-')''-)')'-#-'),$)#.'--#).'25? 未转染细胞转染空质粒.&()+ 的细胞转染重组质粒.&()$)+ 的细胞 4-0*# -1: /0> : :-1-8.*.&()+-10:-1-80-*81.*.&() $)+4-0*#-1: /0> 图 ;')'-$2 检测 %&(3& 融合蛋白的表达 &2+*'.#.'6-').%&(3&.,)-'";')'-$2 讨论羊口疮在中国养羊地区普遍存在严重威胁着畜牧业的发展国内的一些临床保守治疗如擦涂 = 碘酊高锰酸钾灌服解毒消疮饮抗生素等都无法很好而有效地控制其感染接种疫苗是目前防止 $)% 感染羊的最有效方法而免疫灭活疫苗弱毒疫苗后可能会出现抗体水平低毒力反弹等现象所以研制有效的新型疫苗极为重要本试验克隆了 1- 基因构建了.&()$) + 真核表达载体将其瞬时转染 + 细胞经过培养在荧光显微镜下观察到已经表达融合蛋白的细胞通过 > 试验验证了融合蛋白的大小研究证实囊膜蛋白与体液免疫和细胞免疫有关用囊膜亚单位制剂免疫羊能有效地刺激机体产生抗体 1- 基因编码的蛋白是病毒囊膜的主要成分之一是主要的肝素结合活性蛋白对病毒吸附和入侵细胞起着一定的作用王光祥等利用软件 #, 服务器预测 $)% ) 蛋白的二级结构利用试验检测 $)% ) 蛋白的大小进一步完善对 ) 蛋白的研究本试验为 $) 的真核表达较杨钰等的原核表达不仅成功构建了重组质粒.&()$)+ 而且更深一步地研究了 $) 蛋白在不同细胞里的表达情况为后期 $) 蛋白的研究及亚单位疫苗和核酸疫苗研制奠定了基础本试验对 $) 蛋白的研究过程中利用 > 检测融合蛋白的大小与刘嫒等的真核表达相比不仅可以观察到重组质粒.&()$)+ 在 + 细胞中成功表达更可以验证融合蛋白的大小

5 期朱姝等羊口疮病毒 1- 基因的真核表达研究小结本试验利用已知序列设计特异引物采用 $ 技术从羊 $)% & 弱毒株基因组中扩增获得 1- 基因全序列的 $ 产物成功构建了重组质粒.&()$)+ 并将其转染进 + 细胞在荧光显微镜下观察到绿色荧光利用 > 确定.&()$)+ 融合蛋白的大小在 / 为以后更多地研究 $) 蛋白结构研制新型疫苗奠定基础参考文献殷震刘景华动物病毒学第版北京科学出版社刘嫒杨钰鲜思美等羊口疮病毒贵州株 - 基因克隆及生物信息学分析 " 中国畜牧兽医吉艳红尚佑军王光祥等羊口疮病毒 - 基因的克隆及其细胞表位预测 " 中国兽医科学罗云中之义羊传染性脓疱病毒分离及生物学特征研究 " 中国动物检疫! 向智龙卓建华程振涛等贵州地区羊口疮病毒基因克隆及原核表达载体构建中国畜牧兽医! #60,/# :**/* :0:'0/101-1"# &&&'! (#60,/#-16-;.0-:14-0:'0/ /- /8/1'-"!#&#!&!#/..!#60,() '1:0:'0/).01-" # 赵魁贺文琦高丰羊传染性脓疱皮炎病毒研究进展 " 中国畜牧兽医! 杨宏卓杨迪羊口疮的防制 " 中兽医医药杂志张倩王震张辉等表达羊传染性脓疱病毒 - 基因的重组山羊痘病毒的构建与特性鉴定 " 微生物学报!! 王玲玲刘永杰郑海学等羊口疮疫苗研究进展, 第十二届中国羊业发展大会论文汇编田婷婷羊口疮疫苗研制及其免疫效果评估杨凌西北农林科技大学邵洪泽羊传染性脓疱病毒 - 基因克隆表达及分子生物学检测方法的建立与初步应用长春吉林农业大学王光祥尚佑军吕占禄等羊口疮病毒 ) 蛋白二级结构分析与表位预测 " 中国人兽共患病学报!! 杨钰冯杰刘嫒等重庆地区羊口疮病毒的分离鉴定及 - 基因的原核表达 " 中国畜牧兽医刘嫒冯将鲜思美等羊口疮病毒 - 和基因真核表达质粒构建及其在细胞中的表达 " 中国人兽共患病学报! 责任编辑晋大鹏

材料方法

材料方法生物技术通报张发洲杨慧兰为了构建单纯疱疹病毒型感染细胞多肽真核表达质粒应用技术从株的基因组中扩增基因并连接至真核表达载体对阳性克隆进行菌落酶切和测序鉴定后成功构建了重组质粒用转染试剂盒将重组质粒转染至细胞中并用及检测其表达情况结果显示基因在细胞中得到正确表达真核表达质粒的构建成功为进一步研究对宿主细胞的影响奠定了基础单纯疱疹病毒型感染细胞多肽