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究敢张
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,008,8(11):43~47 金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株 RN40Δnuc1 的构建 1,,3 唐俊妮周锐 1 史贤明康名松陈焕春 (1 上海交通大学农业与生物学院食品科学与工程系陆伯勋食品安全研究中心上海 0040) ( 华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室武汉 ) (3 四川大学生命科学学院四川大学动物疾病防控生物工程研究中心成都 ) 摘要金黄色葡萄球菌存在两个核酸酶编码基因, 一个是葡萄球菌核酸酶 (Staphylococcal nuclease,snase), 命名为 nuc1, 另一个是耐热核酸酶 (Thermonuclease,TNase), 命名为 nuc,nuc 是一个新的候选基因, 以往认为金黄色葡萄球菌中的核酸酶只源于一个编码基因 nuc1, 为了进一步研究 nuc 基因的功能, 首先要将金黄色葡萄球菌 nuc1 基因缺失研究目的就是通过构建同源重组质粒 pbt Δnuc1, 将其电转入金黄色葡萄球菌菌株 RN40 中, 获得 nuc1 基因缺失突变株经过了 7 轮培养和筛选, 同源重组几率为 %(7/345), 筛选出的 nuc1 突变株用 PCR 方法和 RT PCR 进行了验证, 从而获得了 nuc1 基因缺失突变株 RN40Δnuc1 关键词金黄色葡萄球菌 nuc1 nuc 同源重组突变株构建中图分类号 Q789 金黄色葡萄球菌不仅是引起人类感染食物中毒急性肝功能衰竭等疾病的重要病原体 [1], 也是引起猪兔和牛等动物慢性葡萄球菌病的常见病原体 [], 严重时可致人和动物的死亡, 是目前最难以对付的病原菌之一金黄色葡萄球菌一个典型特征是能够产生大量的细胞外酶和毒素, 这些酶的作用是将宿主组织的有机化合物及大分子物质转化为细菌自身生长的营养物质 [3], 另外, 这些外酶也是促成细菌成功入侵宿主的重要因子 [4] 产胞外核酸酶是金黄色葡萄球菌的一个重要特征, 耐热核酸酶及其基因也已经成为检测金黄色葡萄球菌污染食品和引起感染的重要标志, 对其研究具有重要的意义 [5] [4] 001 年,Kuroda 等从 N315 和 Mu50 全基因中识别了个外酶, 其中有 6 个是新识别的候选者, 在所有个外酶中,Kuroda 等预测有两个核酸收稿日期 : 修回日期 : 十一五国家科技支撑计划食品安全关键技术重大项目 (006BAK0A14) 上海市重大专项 (07dz19508) 上海市科委平台建设项目 (06dz08) 资助项目通讯作者, 电子信箱 :xmshi@sjtu.edu.cn 酶存在于金黄色葡萄球菌中, 一个是葡萄球菌核酸酶 (Staphylococcalnuclease,SNase), 它的开放阅读框 (ORF) 是 SA0746, 命名为 nuc1, 另一个是耐热核酸酶 (Thermonuclease,TNase), 开放阅读框 (ORF) 是 SA1160, 命名为 nuc,nuc 是一个新基因 [4,5] 以往研究认为金黄色葡萄球菌胞外核酸酶的表达只是源于一个编码基因 nuc1 [6,7], 对 nuc 基因的结构和功能作者进行了相关研究 [5] 为了明确 nuc 基因能否在金黄色葡萄球菌中表达另一个具有活性的核酸酶, 首先要将金黄色葡萄球菌染色体上已知的 nuc1 基因缺失掉本研究通过构建同源重组穿梭质粒 pbt Δnuc1, 将其电转入金黄色葡萄球菌菌株 RN40 中, 从而获得葡萄球菌核酸酶基因 (nuc1) 的缺失突变菌株 RN40Δnuc1, 为进一步研究金黄色葡萄球菌染色体上 nuc 基因的结构与功能奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料菌株和质粒大肠杆菌 E.coliDH5α 由本室保存 ; 金黄色葡萄球菌 S.aureusRN40 由 Dr.Karen

2 44 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.8No Batista 惠赠 (International Asociation for Food 主要试剂 DNA 聚合酶高保真 DNA 聚合酶 Protection,NorthAmerica); 质粒 puc19( 购自 TaKaRa 公 [8] 司 ); 质粒 pbt 由 BrücknerR 惠赠 (Universityof Kaiserslautern, 德国 ); 质粒 p646 由华中农业大学微生物重点实验室分室赵昌明博士提供 DNA 回收试剂盒及限制性核酸内切酶 (BamHⅠ EcoR Ⅰ PstⅠ) 购自 TaKaRa 公司,T4DNA 连接酶购自 Promega 公司, 氨苄青霉素 (Amp), 红霉素 (Erm) 等购自武汉晶美公司 1.1. 培养基 LB 液体和固体培养基 ;BM 液体和固引物实验所用引物见表 1 体培养基表 1 用于扩增相关基因的引物 Table1 Primerpairsusedtoamplifyrelatedgenes 引物名称 Nuc1F1 Nuc1F Nuc1B1 Nuc1B nuc1 1 nuc1 nuc 1 nuc 引物序列 5 GGCGAATTCCTAGTAAAATTGTAGATAAA 3 扩增 nuc1 基因上游 141bp 片段 5 GGCGGATCCCGGTCTGTGAAATGTGATGAGT 3 5 CCCGGATCCTAATGCTTTGGGGTCTACTG 3 扩增 nuc1 基因下游 1154bp 片段 5 CCCCTGCAGATTCGTTGTCGTATCCCCTA 3 5 AGTATATAGTGCAACTTCAACTAA 3 扩增 nuc1 基因内部序列 450 bp 片段 5 ATCAGCGTTGTCTTCGCTCCAAAT 3 5 ATCATTATTGTAGGTGTATTAGC 3 扩增 nuc 基因内部序列 30 bp 片段 [7] 5 CAGGCGTATTCGGTTTC 3 1. DNA 的提取金黄色葡萄球菌基因组 DNA 的提取方法详见参考文献 [9] 1.3 nuc1 基因上下游同源片段的 PCR 扩增根据 GenBank 中报道的金黄色葡萄球菌全基因组序列, 采用 PRIMER5.0 软件设计出 nuc1 基因上下游同源序列的引物 :Nuc1F 和 Nuc1B( 见表 1),PCR 反应体系 (0.0μl) 如下 : 基因组 DNA,1.0μl( 约 ~5ng);10 TaqDNA 缓冲液,.0μl,mmol/LdNTPs,1.0μl; μmol/l 引物,1.0μl;TaqDNA 聚合酶,0.5μl; ddh O,13.5μl PCR 反应条件为 :94 5min;94 1min,5 1min,7 1min,35 个循环 ;7 10min 1.4 同源重组载体 pbt nuc 的构建应用限制性内切酶 EcoRI BamHI 及 BamHI Pst I 将扩增的上下游片段产物分别进行酶切, 产物胶回收后, 用 T4DNA 连接酶将其与 puc19 载体进行连接, 并转化大肠杆菌 DH5α, 用含 Amp 抗性的 LB 固体培养基筛选和鉴定将鉴定正确的阳性克隆命名为 puc NUCFB 进一步用 BamH I 酶切载体 p646, 将来自 p646 的红霉素抗性片段 (erm) 连接到 puc NUCFB 上, 筛选出正确的阳性克隆子命名为 puc nuc1, 然后将构建的片段用 PstI 和 EcoRI 酶切, 再与穿梭质粒 pbt 连接, 从而构建获得同源重组载体 pbt nuc1 1.5 pbt nuc1 的电转化和 RN40 nuc1 的筛选采用电转化方法将重组穿梭质粒 pbt nuc1 导入金黄色葡萄球菌 RN40 菌株中电转条件 : 电压 1.8 kv, 通电时间.5ms 获得的转化子通过温度和红霉素抗性压力进行同源重组, 具体操作如下 : 挑取含重组质粒的金黄色葡萄球菌单菌落于 BM(Cm0μg/ml) 的液体培养基中,37 过夜培养取 1ml 菌液接种于新鲜的 100mlBM(Em.5μg/ml) 的液体培养基中,40 振荡培养 4h 共重复 7 次, 每天按接种于新鲜的 100mlBM(Em.5μg/ml) 的液体培养基中,40 培养 4h(00r/min) 最后一轮, 取 1ml 菌液加入 100ml 不含抗生素的 BM 液体培养基中,40, 菌 4h 取该瓶中的 100μl 菌液以十倍梯度稀释, 稀释到 10 7 倍后, 取适量的稀释菌液涂布于含 Em.5μg/ml 的 LB 平板上,37, 过夜培养挑取单菌落分别点到含有 Em.5μg/ml 的 BM 平板上和 Cm10μg/ml 的 BM 平板上相应的位置上, 过夜培养其中在 Em.5μg/ml 的 LB 平板上生长, 而在 Cm10μg/ml 的 LB 平板上不能生长为初步筛选的金黄色葡萄球菌 nuc1 缺失突变株最终 erm 片段重组于 S.aureusRN40 基因组中, 获得金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株, 并将其命名为 S. aureusrn40 nuc1 1.6 突变株的 PCR 验证分析以提取的金黄色葡萄球菌缺失突变株和亲本株的基因组 DNA 为模板, 应用金黄色葡萄球菌核酸酶基因 nuc1 内部引物 (nuc1 1 和 nuc1 ), 以及 nuc 基因的内部引物 (nuc 1 和 nuc )( 详见表 1) 进行 PCR 扩增 PCR 反应条件为 :94 5min;94 30s,5 40s,7 30s,35 个循环 ;7 5min 取 10μl 进行 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测, 以 DL000DNAMarker 为对照, 确认反应产物

008,8(11) 唐俊妮等 : 金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株 RN40Δnuc1 的构建 45 1.7 RNA 的提取金黄色葡萄球菌 RNA 的提取详见参考文献 [5] 1.

为对照, 确认反应产物结果.1 nuc1 基因同源上游下游片段的 PCR 扩增应用 nuc1 上下游同源序列设计的引物 Nuc1F 和 Nuc1B 分别进行 PCR 扩增, 产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测, 扩出条带的分子量与预期吻合, 分别为 141bp( 上游,Nuc1F) 和 1154bp( 下游,Nuc1B)( 图 1) 图 1 nuc1 上游同源臂的 PCR 扩增 Fig.

穿梭载体 pbt nuc1 的构建及鉴定结果以提取构建质粒的 DNA 为模板分别进行上下游片段的 PCR 扩增和酶切鉴定, 扩增结果见图 a, 上下游序列都能扩增出来相应的长度, 对质粒进一步进行酶切分析 ( 图 b), 表明同源重组质粒 pbt nuc1 的构建是正确的.

3 008,8(11) 唐俊妮等 : 金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株 RN40Δnuc1 的构建 RNA 的提取金黄色葡萄球菌 RNA 的提取详见参考文献 [5] 1.8 突变株的 RT PCR 验证分析以提取的金黄色葡萄球菌缺失突变株和对照菌株的 RNA( 经 DNase 消化 ) 为模板, 首先反转录为 cdna, 再以 cdna 为模板, 以 nuc1 和 nuc 的内部引物 (nuc1 1 和 nuc1 ;nuc 1 和 nuc ) 进行 RT PCR 扩增取 10 μl 进行 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测, 以 DL000DNA Marker 为对照, 确认反应产物结果.1 nuc1 基因同源上游下游片段的 PCR 扩增应用 nuc1 上下游同源序列设计的引物 Nuc1F 和 Nuc1B 分别进行 PCR 扩增, 产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳检测, 扩出条带的分子量与预期吻合, 分别为 141bp( 上游,Nuc1F) 和 1154bp( 下游,Nuc1B)( 图 1) 图 1 nuc1 上游同源臂的 PCR 扩增 Fig.1 PCRamplificationoftheupstream and downstreanfragmentsofnuc1gene 1:Downstroeamfragment(1154bp);:00bp DNAladder;3:Upstreamfragment(141bp). 穿梭载体 pbt nuc1 的构建及鉴定结果以提取构建质粒的 DNA 为模板分别进行上下游片段的 PCR 扩增和酶切鉴定, 扩增结果见图 a, 上下游序列都能扩增出来相应的长度, 对质粒进一步进行酶切分析 ( 图 b), 表明同源重组质粒 pbt nuc1 的构建是正确的.3 金黄色葡萄球菌 nuc1 缺失突变株的获得含重组质粒的金黄色葡萄球菌 RN40 经 40,7 次传代, 使重组质粒在此过程中逐渐丢失, 并在此过程图提取质粒的 PCR 扩增和酶切鉴定 Fig. PCRamplificationofplasmidfrom S.aureus andidentificationofpbt Δnuc1byrestrictionanalysis M:DNAMarker;1:PCRamplificationbyNuc1Fprimers;:PCR amplificationbynuc1bprimers;m1:dl000bpdnamarker;m: DL15000DNAMarker;3:pBT Δnuc1/BamHI 中逐渐实现同源基因的替换基因替换成功菌株的质粒完全丢失,Em 抗性基因替换金黄色葡萄球菌染色体上 nuc1 基因的全部序列, 能在含 Em(.5μg/ml) 平板上生长质粒本身所含的 Cm 抗性基因却因质粒完全丢失而使宿主菌对 Cm 敏感, 在含 Cm(10μg/ml) 平板上不生长通过挑选了 354 个单菌落, 最后得到了 7 株对 Cm 敏感, 对 Em 具有抗性的菌株 ( 和 10 号 ) 表明在这 7 株菌落中, 双交换可能产生接着这 7 株菌在对应的 Cm 平板和 Em 平板上划线, 进一步确认这 7 株菌确实对 Cm 敏感, 而对 Em 具有抗性 ( 图 3) 图 3 所挑选的 7 株菌落在 Cm 平板和 Em 平板上划线生长情况 Fig.3 Theselectedsevencolonieswere Cm sensitiveandem resistant (a)theselectedsevencolonieswerecm sensitive (b)theselectedsevencolonieswereem resistant

46 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.8No.11008.

基因片段扩出, 初步判定为 66 号为 RN40Δnuc1 突变株图 5 突变株和对照菌株的 RT PCR 结果 Fig.

4 46 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.8No 金黄色葡萄球菌 nuc1 缺失突变株的 PCR 验证挑取在含 Em 平板上生长, 而在 Cm 平板上不生长的这 7 株菌落, 接液体培养基, 提取各菌株基因组 DNA, 扩增基因组上 nuc1 和 nuc 基因,PCR 产物经 1% 的琼脂糖凝胶电泳 ( 图 4), 第 66 号无 nuc1 的扩增片段, 表明该菌株的 nuc1 基因已经缺失, 其它菌株的 PCR 产物均有 nuc1 基因片段扩出, 初步判定为 66 号为 RN40Δnuc1 突变株图 5 突变株和对照菌株的 RT PCR 结果 Fig.5 RT PCRanalysisofnuc1andnucexpresionin wildtypestrainrn40andmutantstrainrnδnuc1 RNase freednasei treatedrnasampleomiting reversetranscriptusedasanegativecontrol 图 4 金黄色葡萄球菌 nuc1 缺失突变株的 PCR 鉴定 Fig.4 IdentificationofS.aureunuc1 deletionmuantbypcr M:DL000Marker;Neg:Negative control;rn40:positivecontrol.5 金黄色葡萄球菌 nuc1 缺失突变株的 RT PCR 验证按照 1.7 中的方法提取了 66 号菌株和对照菌株 RN40 的总 RNA, 分别以提取的总 RNA 为反转录模板, 以 nuc1 和 nuc 内部引物进行了 RT PCR( 图 5), 对照菌株 RT PCR 两条带都能检测出, 而突变株 66 号 RT PCR 只有 nuc 基因检测出,nuc1 基因未检测出, 表明 nuc1 基因已被成功敲出掉 3 讨论本研究目的是通过构建穿梭质粒 pbtδnuc1, 将其电转入金黄色葡萄球菌菌株, 经同源重组筛选获得葡萄球菌核酸酶基因 (nuc1) 的缺失突变株 RN40Δnuc1 同源重组技术目前已经愈来愈广泛地应用在基因组染色体上产生突变 [10], 在细菌细胞中, 要想对感兴趣的基因产生突变或缺失, 通常是插入一个抗性基因到有复制缺陷的质粒上 [11] 在本实验中, 为了使金黄色葡萄球菌 nuc1 基因被剔除掉, 在构建重组质粒时, 分别在 nuc1 基因的上游及下游序列设计了两对引物, 扩增出 nuc1 基因上下游序列的同源部分, 进一步在两段同源序列之间用来自质粒 p646 上的 erm 抗性基因进行连接, 用它作为筛选标志, 成功构建重组穿梭质粒 pbt Δnuc1 在实验中较难克服的一个问题是将质粒转入金黄色葡萄球菌中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌之间的宿主特异性识别系统不同, 从大肠杆菌来源的 DNA 进入金黄色葡萄球菌后会被降解, 选用金黄色葡萄球菌菌株 RN40 作为受体菌株, 是因为它是一种限制缺陷菌株, 可以让大肠杆菌来源的 DNA 存在通常,G + 菌的转化方法有原生质体转化和电转化两种, 对于构建的质粒, 原生质体转化可能存在耗时长转化效率低稳定性差等缺点 [1] 通过反复摸索电转化的条件, 成功建立金黄色葡萄球菌电转化平台 ; 电转缓冲液是一个影响因素, 金黄色葡萄球菌最理想的电转化缓冲液是 10% 甘油, 甘油浓度高 (15% 和 0%) 或浓度低 (5%) 都会降低转化效率 [13] ; 质粒 DNA 浓度是第二个影响因素, 浓度过低或过高, 转化效率有所下降, 当质粒 DNA 浓度过低时,DNA 分子太少不足以产生高转化效率 ; 而浓度过高时, 细胞能吸收的 DNA 分子过饱和, 反而不利于转化, 实验中, 质粒 DNA 浓度为 0.5~1μg/μl; 电转前, 重组质粒和金葡菌在室温下作用 30min 并在室温下进行电转, 这与大肠杆菌不同,4 时, 电转效率可能下降到最佳效果的 0% [13] 本实验电转条件在电压 1.8kV, 通电时间.5ms 时转化效率最高同源重组筛选是实验中要解决的另一个关键问题, 应用温敏性穿梭质粒 pbt 在大肠杆菌中表达氨苄抗性, 在金黄色葡萄球菌中表达氯霉素抗性的特点 [8],

5 008,8(11) 唐俊妮等 : 金黄色葡萄球菌核酸酶基因缺失突变株 RN40Δnuc1 的构建 47 出现氯霉素敏感, 红霉素抗性的筛选子可能是发生交换的菌株, 因为质粒上的氯霉素可能被丢失, 本实验中重组几率大约是 %(7/345),7 个筛选子中, 只有 66 号经验证是发生了双交换的重组子, 其它 6 个则是发生了单交换的重组子, 说明单交换发生的机率远远高于双交换另一方面, 当进行重组时, 不知道细菌在哪个生长阶段重组效率最高, 所以每次接种后培养 4h, 以确保同源重组的效率最高温敏性穿梭质粒 pbt 在 30 时很稳定, 但当温度高于 40 时就变得不稳定, 很容易丢失培养温度选择 40, 温度太高不会增加同源重组的效率, 反而会抑制细菌的生长 [8] 在第一轮培养时, 采取了 30 培养温度, 以便让质粒更好复制, 在随后的 7 轮中, 培养温度升到 40 以便让质粒丢失另外, 在筛选突变株时, 红霉素的浓度也非常重要, 选用浓度为.5μg/ml, 当红霉素的浓度大于.5μg/ml, 明显会降低双交换的频率 [8] 筛选出的金黄色葡萄球菌核酸酶基因突变株进一步用 PCR 方法和 RT PCR 进行验证, 从而获得了金黄色葡萄球菌 nuc1 基因缺失突变株 RN40Δnuc1, 为进一步研究 nuc 基因的结构与功能奠定了重要的基础参考文献 [1]ArvidsonS,TegmarkK.Regulationofvirulencedeterminants instaphylococusaureus.intjmedmicrobiol,001,91(): 159~170 []VancraeynestD,HaesebrouckF,HermansK.MultiplexPCR asayforthedetectionofhighvirulencerabbitstaphylococus aureusstrains.veterinarymicrobiology,007,11(3):368~ 37 [3] DingesM M,Orwin P M,SchlievertP M. Exotoxinsof Staphylococusaureus.ClinMicrobiolRev,000,13:16~34 [4] Kuroda M,Ohta T,Uchiyama I, etal. Whole genome sequencing of meticilin resistant Staphylococus aureus. Lancet,001,357:15~140 [5] 唐俊妮. 金黄色葡萄球菌耐热核酸酶相关基因的功能与特征分析. 武汉 : 华中农业大学, 生命科学技术学院,007. Tang J N. Characterization and function analysis ofthe thermostablenucleasegenesinstaphylococusaureus.wuhan: HuazhongAgriculturalUniversity,ColegeofLifeSciencesand Techondogy,007. [6]ConeJL,CusumanoCL,TaniuchiH,etal.Staphylococcal nuclease(foggistrain)i.theaminoacidsequence.jbiol Chem,1971,46:3103~3110 [7]CotonFA,HazenEE,LeggM J.StaphylococcalNuclease: ProposedMechanism ofactionbasedonstructureofenzyme Thymidine3,5 bisphosphate calcium IonComplexat1.5 angstromresolution.pnas,1979,76:551~555 [8]BrücknerR.GenereplacementinStaphylococuscarnosusand Staphylococusxylosus.FEMSMicrobiolLet,1997,151:1~8 [9]TangJN,ShiXM,ShiC,etal.Characterizationofaduplex PCR asay forthe detection ofenterotoxigenic strains of Staphylococusaureus.JRapidMethAutom Microbiol,006, 14:01~17 [10]RuvkunGB,AusubelFM.Ageneralmethodforsite directed mutagenesisinprokaryotes.nature,1981,89:85~88 [11]BaeT,SchneewindO.AlelicreplacementinStaphylococus aureuswithinduciblecounter selection.plasmid,006,55:58 ~63 [1] Chang H C, Bergdol M S. Purification and some physicochemicalpropertiesofstaphylococcalenterotoxin D. Biochemistry,1979,18:1937~194 [13]AugustinJ,G tzf.transformationofstaphylococusepidermidis and other staphylococcal species with plasmid DNA by electroporation.femsmicrobiollet,1990,66:03~08 ConstructionofStaphylococcalNucleaseMutant S.aureusRN40Δnuc1 TANGJun ni 1,,3 ZHOURui SHIXian ming 1 KANGMing song CHENHuan chun (1DepartmentofFoodScienceandTechnologyandBorLuhFoodSafetyCenter,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai 0040,China) (StateKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,ColegeofVeterinaryMedicine,HuazhongAgriculturalUniversity,Wuhan ,China) (3BioengineeringResearchCenterforAnimalDiseasePreventionandControl,SchoolofLifeScience,SichuanUniversity,Chengdu ,China) Abstract TwoORFsinStaphylococusaureusgenomeswerepredictedtoencodenucleases.Oneis encodedthenucleasea(snase)withoutagenename(termednuc1);theotherisencodedathermonuclease (TNase)withanameofnuc(termednuc).TofurtherinvestigatethefunctionofnucinS.aureus,the resultingplasmid, pbt Δnuc1 wassuccesfuly constructed. The recombinantplasmid pbt Δnuc1 was introducedintos.aureusrn40byelectroporation.usingtheresistantmarkerforsevenpasagesofculture, therecombinationratewasabout% (7/345).Anuc1 deletedmutantofs.aureusstrainrn40(termed RN40Δnuc1)wassuccesfulyconstructedandconformedbyPCRandRT PCR. Keywords Staphylococusaureus nuc1 nuc Homologousrecombination Mutantconstruction

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

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