Microsoft Word - 明日醫學基金會申請表格_Chih-Ho Lai_2011.doc

Size: px

Start display at page:

Download "Microsoft Word - 明日醫學基金會申請表格_Chih-Ho Lai_2011.doc"

螗桶逮
5 years ago
Views:

1 財團法人明日醫學基金會專題研究計畫申請書一基本資料 : 申請條碼 : 本申請案所需經費 ( 單選 ) A 類 ( 研究主持費及執行計畫所需經費 ) B 類 ( 研究主持費, 限人文處計畫, 不須填寫表 C002 及 C004 至 C009) 計畫類別 ( 單選 ) 一般型研究計畫新進人員研究計畫特約研究計畫其他研究型別個別型計畫整合型計畫計畫歸屬自然處工程處生物處人文處科教處永續會申請機構 / 系所 ( 單位 ) 中國醫藥大學醫學系本計畫主持人姓名賴志河職稱副教授身分證號碼本計畫名稱中文探討彎曲桿菌引起腸胃炎之分子機轉英文 Molecular mechanisms of Campylobacter jejuni-induced gastroenteritis 整合型總計畫名稱整合型總計畫主持人身分證號碼全程執行期限自民國 100 年 1 月 1 日起至民國 101 年 12 月 31 日研究學門 ( 請參考本申請書所附之學門專長學門代碼名稱 ( 如為其他類, 請自行填寫學門 ) 分類表填寫 ) BI 研究性質純基礎研究導向性基礎研究應用研究技術發展本計畫是否為國際合作計畫否 ; 是, 合作國家 :, 請加填表 I001~I003 本計畫是否申請海洋研究船否 ; 是, 請務必填寫表 C014 本計畫是否有進行下列實驗 :( 勾選下列任一項, 須附相關實驗之同意文件 ) 人體實驗基因重組實驗動物實驗計畫連絡人姓名 : 賴志河電話 :( 公 ) ext 7729 ( 宅 / 手機 ) 通訊地址台中市學士路 91 號醫學系微生物學科傳真號碼 chl@mail.cmu.edu.tw 1

2 二申請補助經費 : ( 一 ) 請將本計畫申請書之第四項 ( 表 C004) 第五項 ( 表 C005) 第六項 ( 表 C006) 第七項 ( 表 C007) 第八項 ( 表 C008) 所列費用個別加總後, 分別填入研究人力費耗材物品及雜項費用研究設備費國外或大陸地區差旅費及出席國際學術會議差旅費欄內 ( 二 ) 若有申請國際合作研究計畫費用者, 請將表 I002 之 C 類經費合計欄金額填入國際合作研究計畫國外學者來臺費用欄內, A 類經費與 B 類經費合計欄金額填入國際合作研究計畫出國差旅費欄內 ( 三 ) 管理費為申請機構配合執行本計畫所需之費用, 其計算方式係依本會規定核給補助管理費之項目費用總和及各申請機構管理費補助比例計算後直接產生, 申請人不須填寫管理費欄 ( 四 ) 貴重儀器中心使用額度係將第九項 ( 表 C009) 所列使用費用合計數填入 ( 五 ) 請依各年度申請博士後研究之名額填入下表 ( 六 ) 申請機構或其他單位 ( 含產業界 ) 提供之配合項目, 請檢附相關證明文件金額單位 : 新台幣元補助項目執行年次第一年 (100 年 01 月 ~ 100 年 12 月 ) 第二年 ( 年月 ~ 年月 ) 第三年 ( 年月 ~ 年月 ) 第四年 ( 年月 ~ 年月 ) 第五年 ( 年月 ~ 年月 ) 業務費研究人力費耗材物品及雜項費用國際合作研究計畫國外學者來臺費用研究設備費國外差旅費國外或大陸地區差旅費出席國際學術會議差旅費國際合作研究計畫出國差旅費管理費合計貴重儀器中心使用額度國內外地區共名共名共名共名共名博士後研究大陸地區共名共名共名共名共名申請機構或其他單位 ( 含產業界 ) 提供之配合項目 ( 無配合補助項目者免填 ) 配合單位名稱配合補助項目配合補助金額配合年次證明文件三主要研究人力 : 2

3 ( 一 ) 請依照主持人共同主持人協同研究人員及博士後研究等類別之順序分別填寫類別姓名服務機構 / 系所職稱在本研究計畫內擔任之具體工作性質項目及範圍 * 每週平均投入工作時數比率 (%) 主持人賴志河中國醫藥大學 / 醫學系副教授統籌及推動本研究計畫參與主 80% 要實驗工作整理文獻背景及撰寫研究成果註 : 每週平均投入工作時數比率係填寫每人每週平均投入本計畫工作時數佔其每週全部工作時間之比率, 以百分比表示 ( 例如 :50% 即表示該研究人員每週投入本計畫研究工作之時數佔其每週全部工時之百分五十 ) ( 二 ) 如申請博士後研究, 請另填表 CIF2101 及 CIF2102( 若已有人選者, 請務必填註人選姓名, 並將其個人資料表併同本計畫書送本會 ) 3

4 五耗材物品及雜項費用 : ( 一 ) 凡執行研究計畫所需之耗材物品及雜項費用, 均可填入本表內 ( 二 ) 說明欄請就該項目之規格用途等相關資料詳細填寫, 以利審查 ( 三 ) 若申請單位有配合款, 請於備註欄註明 ( 四 ) 請分年列述金額單位 : 新台幣元項目名稱說明單位數量單價金額備註消耗性器材細胞培養耗材..培養年 1 基胎牛血清無菌培養皿液態氮無菌吸管 CO 2 氣體及離心管等消耗性器材微生物培養耗材..培年養基洋菜膠棉棒培養皿無菌吸管及離心管等 1 消耗性器材 Reporter assay kit, 組 ELISA assay kit 分析 IL-8,NF-κB 及 AP-1 promoter activity, 每組十瓶 ( 盤 ), 共五組 5 消耗性器材分子生物學實驗藥品年 1 與耗材..限制酶聚合酶電泳膠緩衝液及 DNA marker 等消耗性器材蛋白質電泳試劑與耗批材..電泳配製試劑 protein marker PVDF membrane 及濾紙等 1 消耗性器材吸管玻璃瓶塑膠年 1 瓶及血清瓶等耗材 4

5 消耗性器材清潔劑酒精有機批 1 溶劑及化學試劑等資訊設備費 A4 紙碳粉夾光碟年片等資訊耗材 1 論文投稿費期刊雜誌投稿篇 2 合計 5

6 十一研究計畫中英文摘要 : 請就本計畫要點作一概述, 並依本計畫性質自訂關鍵詞 ( 一 ) 計畫中文摘要 ( 五百字以內 ) 彎曲桿菌可在動物引起腹瀉, 同時也是在人類造成腸胃炎的主要細菌之一, 近年來已逐漸受到重視, 因此探討彎曲桿菌的特性及其致病因子更顯現其重要性而細胞致死腫脹毒素 (cytolethal distending toxin, Cdt) 在空腸彎曲桿菌的致病上被認為扮演非常重要角色, 我們的初步分析結果顯示 Cdt 對於空腸彎曲桿菌來說應該是一必需的毒素, 我們也利用重組 CdtA, B, C 三個毒素次單位觀察其對細胞的致病機制, 發現重組 Cdt 具有抑制細胞週期的功能因此, 本計畫將研究空腸彎曲桿菌細胞致死腫脹毒素及探討三個毒素次單位 (subunits) 對細胞致病的作用機制細胞脂質筏 (lipid rafts) 對於微生物的感染或是毒素的內噬及運送非常重要, 我們先期的研究發現彎曲桿菌的 Cdt 會藉由脂質筏來感染宿主細胞, 因此我們將利用已純化的重組 Cdt 蛋白質研究 Cdt 次單位與免疫細胞脂質筏交互作用並利用小鼠初級 T cells 探討 Cdt 毒素的作用及探討彎曲桿菌感染細胞引起 NF-κB 與 AP-1 路徑之發炎反應是否受脂質筏的影響除此之外, 我們將進一步利用超高速離心及蛋白質體學的分析方法找尋脂質筏中 CdtA 與 CdtC 結合的分子或接受體, 並利用共軛焦顯微鏡研究 CdtB 於細胞內的輸送途徑這些研究結果將有助於了解彎曲桿菌及其細胞腫脹毒素的致病機轉並提供臨床醫師治療彎曲桿菌導致腸胃炎之參考關鍵詞 : 空腸彎曲桿菌細胞毒素脂質筏膽固醇介白素 -8 6

7 ( 二 ) 計畫英文摘要 ( 五百字以內 ) Campylobacter sp. are the most common causes of human gastroenteritis as well as livestock diarrhea worldwide. While Campylobacter infections are quit common and often severe, relatively little is known about mechanisms of their pathogenesis. It is thought that bacterial virulence factors are more important for those infectious diseases. Numerous cytotoxins in Campylobacter jejuni have been described, but only cytolethal distending toxin (Cdt) has been well characterized. While the molecular characterization of cdt gene in clinical isolates in Taiwan was still absence. Our preliminary data showed that cdt gene was existed in all clinical isolates, indicated that cdt was essential for clinical diseases. In addition, we found that purified recombinant CdtA, B, C fusion proteins have their cytopathic effects in the induction of cell cycle arrest. In the aim of this research plan, we will examine the molecular mechanisms of CdtA, B, C subunits on epithelial cells. Lipid rafts are crucial for microbe infection and toxins delivery. We hypothesized that Campylobacter Cdt-mediated immunotoxicity is raft-dependent. The association of three Cdt subunits with lipid rafts on immune cells will be investigated. We will also examine the interaction of Cdt and mouse primary T cells. Whether NF-κB and AP-1 signaling pathway are involved in Cdt-mediated cytopathic effects via lipid rafts will be also determined in this project. Further investigation of common receptors of CdtA and CdtC will be analyzed by sucrose gradient ultracentrifuge and proteomics approaches. The trafficking pathway of CdtB in toxin-treated cells will be also confirmed by Confocal microscopy. These results will help us to understand the complicated processes of Cdt-induced cell pathogenesis and would be beneficial for the clinical diagnosis and treatment of Campylobacter-induced gastroenteritis. Keywords: Campylobacter jejuni, cytotoxin, lipid rafts, cholesterol, interleukin-8 7

8 十二研究計畫內容 : A. 研究計畫之背景一彎曲桿菌及其致病因子 1. 彎曲桿菌的微生物特性彎曲桿菌本身的菌體較小, 為革蘭氏陰性 (Gram negative) 桿菌, 具有彎曲 (spirally curved) 的外觀及一端到二端的單鞭毛, 因此具有運動性而彎曲桿菌與幽門螺旋菌 (H. pylori) 最大的不同, 則在於尿素酶幽門螺旋菌具有尿素酶陽性, 彎曲桿菌則無此酵素 (1) 不同菌種的彎曲桿菌感染宿主的差異相當大, 例如 : 空腸彎曲桿菌 (C. jejuni) 除了感染牲畜動物寵物之外, 還易感染人類, 而胎兒彎曲桿菌 (C. fetus) 則大部分只感染牛羊等牲畜動物 ; 但是感染人類則仍以空腸彎曲桿菌為主 (2) 2. 彎曲桿菌與臨床疾病感染彎曲桿菌之後, 重要的臨床症狀包括胃腸炎 (gastroenteritis) 急性腹痛(acute abdominal pain) 敗血症(septicemia) 以及一種與急性神經性麻痺症狀有關的 Guillain Barŕe syndrome (GBS) (3,4) 在歐美國家的報導發現彎曲桿菌為世界上最常引起人類腹瀉的致病菌, 在美國平均每年約有兩百萬個病例 (3), 雖然不致引起患者死亡, 但卻會影響大眾健康與對經濟的負擔而彎曲桿菌在台灣的流行病學情況與國外大不相同, 根據台灣的研究發現, 在中部地區之腹瀉或胃腸炎患者糞便檢體中僅 2.5% 分離出彎曲桿菌, 為台灣中部次重要的細菌性腸胃炎致病菌 (5), 這與歐美或其他已開發國家有明顯的不同, 而研究也指出在台灣感染彎曲桿菌的病患大多是小於五歲的孩童, 所分離出的彎曲桿菌則以空腸彎曲桿菌最常見 (6) 3. 彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素 (Cytolethal Distending Toxin, Cdt) 細胞致死腫脹毒素 ( 以下簡稱 Cdt) 是由 Johnson 和 Lior 在 1988 年所發表 (Johnson and Lior, 1988b), 他們發現在某種大腸桿菌中有一種毒素會造成倉鼠卵巢細胞 (Chinese hamster ovary cells, CHO cells) 明顯的變長腫脹, 隨即也在彎曲桿菌中發現具有 Cdt 毒素 (7), 之後陸陸續續在 Hemophilus ducreyi (8) Actinobacillus actinomycetemcomitans (9) Shigella dysenteriae (10) subsets of Helicobacter species (11) 中發現 Cdt 為一 holotoxin, 是由三個位置相近的基因所表現, 分別為 cdta cdtb cdtc, 空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素預期的蛋白質大小分別為和 Da (12) Cdt 會造成許多種的細胞腫脹最後使細胞死亡, 除了細胞腫脹外,Cdt 還會造成染色絲濃縮裂解 (13) 且和調控腸道上皮細胞 IL-8 的分泌有關 (14), 另外會使細胞週期暫停在 G2/M 時期 (15-17), 這也是除了細胞腫脹之外另一項判斷 Cdt 活性的指標 4. 細胞致死腫脹毒素對細胞週期的影響細胞週期的調控是由許多複雜的分子所調控, 由多個 kinases 及 phosphatases 的磷酸化或去磷酸化作用使分子活化或不活來調控當 Cdt 處理細胞時會發現細胞中的 CDK1(cyclin-dependent kinase, 一調控細胞周期由 G2 進入 mitosis 的重要分子 ) 皆處於高度磷酸化的不活化狀態, 並使細胞暫停在 G2/M 時期 (13,17,18) 8

9 二脂質筏的生化功能 1. 脂質筏的結構脂質筏位於細胞膜上, 最主要由膽固醇 (cholesterol) 磷脂質 (phospholipid) 及鞘脂質 (sphingolipid) 所組成, 而其存在的型態大略可分為三種 : (i) 膠體脂質呈半固體狀 (ii) 無排序液態全部的脂質都為液體狀態 (iii) 固定排序液態磷脂質與飽和的碳水化合物, 再加上膽固醇共同形成緊密的結構, 這幾種成分分別在細胞膜的生物活性上提供重要功能 (19) 而這三種成分即形成動態且具有規則並緊密包裹於細胞膜內的脂質筏 (20) 由於脂質筏的結構非常穩定, 因此可以抵抗一些清潔劑的作用, 例如 : 以 Triton X-100 在低溫的狀態下處理細胞, 細胞膜上的脂質筏並不會被溶解, 因而形成所謂的清潔劑抵抗性的細胞膜 (detergent-resistant membrane, DRM), 在這個完整而穩定的結構中, 不僅僅含有膽固醇與磷脂質, 尚含許多重複的蛋白質, 這些蛋白質有些提供訊息的傳遞, 有些則使脂質筏形成更穩定的結構, 而有些則可提供微生物感染細胞的新途徑 (21,22) 表一與脂質筏相互作用的微生物及毒素 [Adapted from (21)] 2. 微生物與脂質筏的作用目前已知脂質筏不但可以提供並放大活化細胞的訊息傳遞, 而且可以使細胞骨架重組細胞膜凹陷, 因而有助於細胞執行內噬作用 (endocytosis), 近年來有更多新的研究報告指出脂質筏亦可提供微生物感染細胞的一種新途徑, 這些可以藉由脂質筏而感染宿主細胞的微生物包括細菌細菌毒素與病毒, 甚至連傳染性蛋白 (prion) 亦可與脂質筏作用 ( 表一 )(21); 以微生物感染宿主的角度而言, 這些微生物一旦藉由脂質筏進到宿主細胞內, 不但可以使細胞膜裂開與細胞骨架重組而讓微生物更易進入宿主細胞, 而且尚可避免細胞內溶小體的分解作用, 因此脂質筏的形成對微生物感染宿主而言是非常有利的, 例如 : 志賀氏桿菌 (Shigella flexneri) 可藉由其侵入素 (invasin)ipab 與脂質筏相關蛋白 CD44 交互作用 (23) 同樣的情況也發生在綠膿桿菌 9

10 (Pseudomonas aeruginosa) 感染呼吸道上皮細胞, 使得脂質筏相關蛋白 CD95(Apo-1) 匯集在脂質筏中, 因而導致感染細胞更容易進行凋亡 (apoptosis)(24,25) 除此之外, 我們實驗室最近的研究也發現幽門螺旋菌注射 CagA 毒素進入上皮細胞亦是經由脂質筏的協助 (26) 由以上的研究文獻可以得知, 脂質筏在細菌感染細胞的過程扮演著許多重要角色, 不但提供微生物進入細胞的管道, 亦可保護細菌免於受宿主細胞的免疫攻擊 3. 細菌毒素與脂質筏的作用不只是細菌菌體的分子可與脂質筏作用, 有些細菌亦會分泌致病毒素, 再藉由脂質筏的攜帶而對宿主細胞產生病理效應, 例如 : 霍亂毒素 (cholera toxin), 一旦霍亂毒素與受器結合後會形成複合物, 附近的液泡或是脂質筏上的 caveolae 會帶著毒素輸送到靠近細胞膜, 並與 Gs protein 及腺苷酸環化酶 (adenyl cyclase) 作用, 進而活化腺苷酸環化酶, 而使 ATP 轉變為 camp, 因而造成細胞內的氯離子與水份過度分泌引起腹瀉其他細菌分泌的毒素如 : 炭疽毒素 (anthrax toxin) (27) 與幽門螺旋菌的液泡毒素 (vacuolating cytotoxin)(28,29) 等, 也都陸續被發現是經由脂質筏誘導受體群聚 (raft-induced receptor cluster) 而引起細胞的病變, 因此當毒素結合受器再透過脂質筏匯集, 造成細胞內一些訊息被大量活化而傳遞, 一旦訊息開始被傳遞後, 受細菌感染細胞就會引起致病效應在先前我們研究幽門螺旋菌感染細胞的過程發現 : 不僅僅是細菌本身會跟脂質筏作用, 有些細菌分泌的毒素 ( 例如 : 幽門螺旋菌的 VacA 與 CagA) 亦是依賴脂質筏來運輸進入細胞, 以執行其致病機轉 (28,30), 因此我們認為脂質筏對於細菌感染細胞及之後產生致病效應 (cytopathic effects) 扮演著非常重要的角色 B. 初期研究成果 (Preliminary results) 1. 表現與純化 CdtA CdtB 及 CdtC 蛋白質我們將三個去除 signal sequence 的 Cdt 次單元基因個別構築到 pet-21d (+) 中利用 E.coli 大量表現, 為得到大量並足夠純度的重組蛋白質, 利用低溫 (16 ) 誘導來純化重組蛋白質, 重組的 Cdt 蛋白質其氨基端 (N-terminal) 會多出 methionine 及 alanine, 碳基端 (C-terminal) 會多出 6 個 histidine, 預測分子量分別為及 Da (CdtA CdtB 及 CdtC) 目前我們已經可以利用大腸桿菌表現出三個毒素的蛋白質, 重組後的 Cdt 次單元蛋白質經純化後如圖一所示純化後的蛋白質因帶有 His-tagged, 因此可利用 anti-his monoclonal antibody 辨識, 如圖二所示 2. 重組 Cdt 完全毒素 (holo toxin) 活性雖然我們已經可以有效表現 Cdt 蛋白質, 但是並無法卻認這三個毒素次單位具有生化活性, 為證實經由 E.coli 表現的三個重組 CdtA, B, and C 次單元蛋白質可以組成具有 Cdt 完全毒素毒性的蛋白質, 我們將三個 Cdt 次單元蛋白質以每個濃度 439 nm, 比例 1:1:1(CdtA:CdtB:CdtC) 處理細胞 24 小時後, 待毒素處理 48 小時後以顯微鏡觀察細胞型態並收集細胞, 用 70% 酒精固定細胞後, 以 propidium iodide 染細胞核, 用流式細胞儀偵測其核酸含量以分析細胞週期我們發現 : 在重組 Cdt 蛋白質的處理下細胞明顯比 negative control 腫脹 ( 圖三 ), 而且細胞週期也暫停在 G2/M 時期 ( 圖四 ), 暫停在 G2/M 時期的細胞有 % 而 negative 的只有 7.96 % 的細胞在 G2/M 時期此外, 我們收集空腸彎曲桿菌的培養上清液, 並濃縮 100 倍, 再將其稀釋 4 倍到細胞培養液中, 並依照上述方法處理作為 positive control, 發現細胞處於 G1 時期有 40 %, 而 G2 時期則有 27.4%; 因此由初步研究的結果證實我們所純化的 Cdt 蛋白質 (CdtA, B, and C) 是具有生化活性的功能 10

圖一經純化的重組 His-tagged Cdt 蛋白質電泳圖 (A) 箭頭所指的 CdtA 為可溶性的重組 His-tagged CdtA 蛋白質 ;(B) 其中的 CdtA 為經由 8 M urea 純化再重新摺疊的重組 His-tagged CdtA 蛋白質,CdtB 和 CdtC 為可溶性的重組 His-tagged 蛋白質 M:protein marker 圖二西方墨點法分析

11 圖一經純化的重組 His-tagged Cdt 蛋白質電泳圖 (A) 箭頭所指的 CdtA 為可溶性的重組 His-tagged CdtA 蛋白質 ;(B) 其中的 CdtA 為經由 8 M urea 純化再重新摺疊的重組 His-tagged CdtA 蛋白質,CdtB 和 CdtC 為可溶性的重組 His-tagged 蛋白質 M:protein marker 圖二西方墨點法分析 Cdt 毒素蛋白利用 anti-his monoclonal antibody 偵測經純化的重組 Cdt-His-tagged 蛋白質 (A) CdtA 為可溶性的重組 His-tagged CdtA 蛋白質 ;(B) 其中的 CdtA 為經由 8 M urea 純化再重新摺疊的重組 His-tagged CdtA 蛋白質,CdtB 和 CdtC 為可溶性的重組 His-tagged 蛋白質 11

圖三重組 His-tagged Cdt 蛋白質造成細胞腫脹左圖為未處理的控制組, 右圖為處理 His-tagged Cdt 蛋白質 ( 各個次單元濃度皆為 439 nm) 圖四重組 His-tagged Cdt 蛋白質細胞週期暫停在 G2/M 時期左圖為未處理的控制組, 右圖為處理 His-tagged Cdt 蛋白質 C.

toxin( 典型的 AB 毒素 ) 的 B chian( 會和 galactosides 結合促使 A chain 被攝入 ) 有相似性因此 Cdt 可能為一典型的 AB 毒素, 而 CdtA 或 CdtC 甚至是多個次單元對於 Cdt 和細胞接受器的結合有關因此本計畫主要欲以表現及純化的重組 Cdt 蛋白質研究探討各個次單元的功能,

12 圖三重組 His-tagged Cdt 蛋白質造成細胞腫脹左圖為未處理的控制組, 右圖為處理 His-tagged Cdt 蛋白質 ( 各個次單元濃度皆為 439 nm) 圖四重組 His-tagged Cdt 蛋白質細胞週期暫停在 G2/M 時期左圖為未處理的控制組, 右圖為處理 His-tagged Cdt 蛋白質 C. 研究計畫目的及目標 Cdt 有三個次單元, 目前已知 CdtB 為一 DNase I-like 蛋白質, 並且和 Cdt 造成細胞週期停在 G2/M 時期有關 (13,31), 這三個次單元對於造成 Cdt 毒性為缺一不可 (32), 但是 CdtA 和 CdtC 的功能目前還都不清楚利用 NCBI 網站的 PSI-Blast 工具我們發現 CdtA 的一段胺基酸序列和 Ricin toxin( 典型的 AB 毒素 ) 的 B chian( 會和 galactosides 結合促使 A chain 被攝入 ) 有相似性因此 Cdt 可能為一典型的 AB 毒素, 而 CdtA 或 CdtC 甚至是多個次單元對於 Cdt 和細胞接受器的結合有關因此本計畫主要欲以表現及純化的重組 Cdt 蛋白質研究探討各個次單元的功能, 並利用流式細胞儀以間接免疫螢光分析哪一次單元為結合次單元並對其結合特性作酵素學上的分析先前許多研究已發現細胞脂質筏對於微生物的感染或是毒素的內噬 (internalization) 及運送非常重要 (21), 我們推測彎曲桿菌與其 Cdt 極有可能藉由脂質筏來感染宿主細胞的原因有以下兩個原因 :(1) 我們分析空腸彎曲桿菌侵襲或黏附細胞的基因發現 : 其 ciab 基因 (Campylobacter invasion antigen B) 的基因序列與沙門氏桿菌 (Salmonella typhimurium) 的 sipb 及志賀氏桿菌 12

13 (Shigella flexneri) 的 ipab 基因有很高的相似性 ( 約 40~45%), 而 sipb 及 ipab 基因所製造的蛋白質在最近都被報導是依靠細菌的第三型分泌系統 (type III secretion system, TTSS) 與細胞膜脂質筏交互作用來運送毒力因子 (33,34);(2) 除此之外其他細菌如 : 嗜血桿菌 (Haemophilus ducreyi) 及放線菌 (Actinobacillus actinomycetemcomitans) 的 Cdt 亦被發現是藉由脂質筏來造成細胞週期靜止 (cell cycle arrest)(35,36) 因此由上述兩個重要的發現, 我們推測彎曲桿菌極有可能藉由脂質筏來感染宿主細胞, 並將其 Cdt 經由 cholesterol-rich 的區間輸送到細胞質內, 因而引起細胞的致病現象 ; 為了證實我們的假設, 最後我們將探討彎曲桿菌細胞腫脹毒素對細胞致病的作用機制, 特別是著重在與細胞 lipid rafts 的交互作用及細胞內傳遞路徑之研究因此, 為了證實我們的推測, 我們預計完成三大目標 : 一探討彎曲桿菌細胞腫脹毒素對細胞致病的作用機制二研究 Cdt 次單位與免疫細胞脂質筏交互作用三利用小鼠 primary T cells 探討 Cdt 毒素的作用目標一探討彎曲桿菌細胞腫脹毒素對細胞致病的作用機制 1. 表現及純化 CdtA CdtB 及 CdtC 蛋白質 :Cdt 有三個次單元, 目前已知 CdtB 為一 DNase I-like 蛋白質, 並且和 Cdt 造成細胞週期停在 G2/M 時期有關, 這三個次單元對於造成 Cdt 毒性為缺一不可, 但是 CdtA 和 CdtC 的功能目前還都不清楚因此本研究計畫初步將利用 Cdt 的重組蛋白質研究探討哪一次單元為結合次單元 (binding subunit) 並對其結合特性作酵素學上的分析本實驗將利用 pet 表現純化系統, 將三個扣除 signal sequence 的 cdt 次單元基因個別構築到 pet-21d (+) 中利用 E.coli 大量表現為得到大量並足夠純度的重組蛋白質, 利用低溫 (16 ) 誘導或是 8 M urea 來純化重組蛋白質, 純化的 CdtA B C 重組蛋白質可用於分析毒素的活性及毒素與細胞結合的能力 2. 測試重組 Cdt 完全毒素 (holo toxin) 毒性及 CdtB DNase 的活性 : 為了測試 Cdt 的活性, 接下來我們將利用三個 Cdt 次單元蛋白質以比例 1:1:1 (CdtA:CdtB:CdtC) 處理細胞 24 小時後, 再換成完全培養基繼續培養, 待毒素處理 48 小時後以顯微鏡觀察細胞型態並收集細胞, 用 70% 酒精固定細胞後, 以 propidium iodide (PI) 染細胞, 用流式細胞儀偵測其核酸含量, 並以 ModFit LT Ver. 3.0 DNA 直方圖分析軟體來定量細胞週期於 G1, S, 及 G2/M 此外, 為證明經純化的重組 CdtB 具有 DNase 的酵素活性, 我們將利用質體 DNA 分別與不同濃度的重組 CdtB 蛋白質一起反應, 在 37 作用 1 小時後, 再以 1 % 瓊脂凝膠電泳膠分析並且定量其 DNase 的活性 3. 偵測 CdtA-His 是否具有專一性結合到細胞表面的能力 :Hemophilus ducreyi 的 Cdt 進入細胞是藉由 clathrin coated pits 的途徑進入, 由於 clathrin coated pits 上有許多的接受器會嵌在細胞膜上, 所以 Cdt 進入細胞可能會先經由和細胞上的接受器結合 (37) 我們先期比對基因序列, 利用 NCBI 網站的 PSI-Blast search 及 conserved domain (CD) database search 發現,CdtA 的一段氨基酸序列和 Ricin toxin ( 典型的 AB 毒素 ) 的 B chian 有相似性基於上述假設, 本研究將利用流式細胞儀, 以間接免疫螢光染色法分析 CdtA 是否即為負責和細胞結合的次單元或是由 CdtC 或是兩者共同負責 4. 分析 CdtA, CdtC 與細胞專一性的結合對 Cdt 完全毒素 (holotoxin) 的功能 : 基因上的證據顯示三個 Cdt 次單元蛋白質對於造成 Cdt 毒性來說是必須的, 但是目前只了解 CdtB 為 Cdt 完全毒素 13

14 中負責酵素活性的次單元, 而 CdtA 和 ( 或 )CdtC 是可能是幫助扮演幫助 CdtB 進入細胞的角色, 或是扮演和細胞結合的角色, 迄今也尚未完全了解為證實此專一性的結合對 Cdt 完全毒素是必須的, 我們將利用細胞週期分析, 將培養小時的 CHO 細胞以固定濃度的 CdtB 及 CdtC 另加 CdtA 處理細胞 24 小後, 換成完全培養基繼續培養, 待毒素處理 48 小時後收集細胞, 再用流式細胞儀分析細胞週期目標二探討 Cdt 次單位與免疫細胞脂質筏 (lipid rafts) 交互作用 1. 測試 Cdt 次單位個別與細胞結合的能力 : 為了分析彎曲桿菌 Cdt 與免疫細胞的交互作用, 我們將以免疫細胞株 Jurkat 來探討個別 Cdt 次單位與細胞結合的能力, 我們的實驗將 : (1) 利用流式細胞分析儀來分析個別 CdtA, B, or C 次單位與 Jurkat 細胞的結合能力 (2) 我們也將以共軛焦顯微鏡觀察個別 CdtA, B, or C 在 Jurkat 細胞膜上的分布情形 2. 偵測 CdtABC 三個毒素次單位是否與細胞膜脂質筏交互作用 : 為了分析 CdtA, B, C 是否與細胞膜脂質筏交互作用, 我們將 : (1) 純化重組 CdtA, B, and C (holotoxin) 與細胞結合, 再利用共軛焦顯微鏡來觀察 Cdt 分子是否與細胞脂質筏或其內的蛋白質有交互作用 (2) 另外我們也將 Cdt 結合的細胞以 1% TritonX-100 溶解再以超高速離心分層 (sucrose gradient ultracentrifuge fractionation), 來偵測 Cdt 是否位於 cholesterol-rich fractions 之內 (3) 緊接著我們將探討利用 MβCD (methyl-β-cyclodextrin) 去除細胞膜脂質筏之後,Cdt 的細胞結合能力或造成細胞週期停滯是否會有影響 (4) 最後我們將利用共軛焦顯微鏡 (confocal microscope) 一併探討 Cdt 在細胞內的作用分子及傳遞路徑是否與脂質筏有關目標三探討 Cdt 毒素與小鼠初級 T lymphocytes 的作用 1. 探討 Cdt holotoxin 是否會抑制小鼠 spleen cells 的活化 : 利用六週大的小鼠 C57BL/6J, 取其 spleen cells, 再加入 mitogen concanavalin A (ConA) 以活化 T lymphocytes, 接著加入 CdtA, B, C 或是 holotoxin 與細胞作用, 最後藉由流式細胞分析儀分析 Cdt 造成細胞週期停滯的情況 2. 證明以 MβCD 去除細胞膜脂質筏之後,Cdt 造成細胞週期停滯的影響 : 另外再以 MβCD 去除細胞膜脂質筏之後, 接著加入 holotoxin 與細胞作用, 分析 Cdt 造成細胞週期停滯是否亦會受到脂質筏存在與否的影響 14

15 八研究方法及進行步驟 : 1. 空腸彎曲桿菌的培養與儲存原因 : 為了分析 cdt 基因在不同菌株的差異與存在的機率方法 : 我們將細菌培養在固態培養基的菌轉塗佈到新鮮的培養基 (2.8% Brucella broth,1.5% agar,amphotericin B 1ug/ml,10% 綿羊紅血球,pH 7.5) 上, 在 37 下以微需氧條件 (5 % O 2, 10 % CO 2,85 % N 2 ) 培養 2 到 3 天待細菌在固態或液態環境培養到一定菌數時, 便儲存在包含 Brucella broth 及 15 % 甘油 (glycerol) 的冷凍培養基中 (freezing medium), 並且迅速置於 -70 的冷凍櫃中保存 2. 空腸彎曲桿菌染色體 DNA 的抽取原因 : 為分析不同來源菌種其 cdt 基因的序列方法 : 收集已在固態培養基長滿的細菌, 加入 lysis bufer 600μl (20 mm 的 Tris-Cl,40 mm 的 NaCl,10 mm EDTA,0.2% SDS,protease K 20μg /ml) 中作用再以 phenol/chloroform (1: 1) 萃取 DNA, 實驗方法如我們之前所述 (38) 3. 細胞致死腫脹毒素基因序列分析質體的選殖原因 : 為確認及了解台灣地區空腸彎曲桿菌的細胞致死腫脹毒素基因序列是否與歐美等國外地區的菌株有所差異方法 : 因此必須分析此段 DNA 的序列, 所以便要將 cdt 基因選殖出來, 其基因選殖步驟如下 : 使用根據 gene bank 中 Campylobacter jejuni (81-176) 的 cdtabc gene 所設計的寡核苷酸引子對, 以空腸彎曲桿菌染色體 DNA 為模板, 置於 DNA 溫度循環控制機進行反應再以 1 % 瓊脂凝膠電泳膠分析, 以確認複製所得的核酸片段為 2.6 Kbp 的 cdt 基因將聚合酶鏈鎖反應的產物以瓊脂凝膠電泳膠分離, 利用 Gel Extraction System Kit (Viogene) 純化, 並以 1 % 瓊脂凝膠的電泳確定 DNA 之品質及濃度 4. 回收純化各個 Cdt 次單元蛋白質 pet 純化系統為純化載體 pet-cdta cdtb 和 cdtc 中大量表現的 CdtA-H CdtB-H 及 CdtC-H 純化步驟主要參照 TALON Metal Affinity Resins User Manual (CLONTECH) 將已活化帶有載體 pet-cdta( 或 pet-cdtb cdtc) 的 E.coli 接種到 15 ml LB 液態培養基 ( 含有 100μg/ml ampicillin) 中, 置於 37 恆溫培養箱中培養 6 小時後, 取出 10 ml 再接種入 LB (100 g/ml ampicillin) 液態培養基中培養 4 小時, 隨後加入 IPTG, 置於恆溫培養箱中, 震盪培養 (IPTG 濃度溫度及時間如表三 ) 將誘導過後之菌液以 6,000 rpm 離心 10 分鐘, 回收菌體利用超音波破碎機打破細菌, 隨後置於 4 離心機以 15,000 rpm 離心 15 分鐘取上清液, 以 0.45 m 的濾膜過濾後, 置於冰液中待用, 此即為粗萃取液取適量之 TALON metal affinity resin(clontech), 均勻地滴入管柱中, 讓樹脂慢慢沉澱於管底, 然後使管柱內之液體緩慢流出流盡後加入緩衝液, 讓緩衝液流過管柱, 以沖掉殘餘的酒精, 隨後將過濾好的粗萃取液滴入管柱中再加入 elution buffer ( 含 20 mm Tris-HCl,100 mm NaCl 和 150 mm imidazole, ph 7.0) 此時結合於 resin 上的 Cdt 會被洗出, 同時以微量離心管置於管柱下方, 回收所洗出之蛋白質, 利用透析膜進行透析, 將所有回收之蛋白質溶液置入透析膜中, 之後再以 1 倍 PBS 緩衝液 (ph 7.4) 進行透析交換 5. 蛋白質電泳凝膠製備與電泳分析 (SDS-PAGE) 組合蛋白質電泳儀器組件, 配製 12~14 % SDS-PAGE, 倒入玻璃夾層中, 加入去離子水壓平 15

16 凝膠界面, 待凝膠凝固後旋即倒入 4 % 十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠並插入樣品槽製造梳, 凝固後將玻片架於電泳槽上取蛋白質樣品液置於凝膠之樣品槽中, 將電泳槽充滿 1 倍蛋白質電泳緩衝液 (250 mm glycine, 0.1% sodium dodecyl sulfate, 25 mm Tris-HCl, ph 8.5), 以 100 伏特電壓進行電泳約 2-4 小時, 使蛋白質依分子量大小分離 6. 西方墨點法 (Western Blot) 由於我們純化的蛋白質都是含有 6 x His 的 fusion proteins, 因此我們可以利用 anti-his Ab 來偵測專一性的純化蛋白取自得到的蛋白質利用 % 蛋白質凝膠電泳, 使蛋白質依分子量大小分離, 再轉漬至 PVDF 膜取出 PVDF 膜改置入含稀釋的初級抗體 (anti-his-tag Ab) 之含 5% 脫脂奶 TTBS 溶液內, 再將 PVDF 膜移至含稀釋的二級抗體 (IgG HRP conjugated) 中, 最後將 PVDF 膜以混合的冷光呈色劑作用 3 分鐘, 進行自動放射顯影 7. 利用流式細胞儀細胞致死腫脹毒素與細胞結合能力分析原因 :CdtA 的氨基酸序列和 Ricin toxin ( 典型的 A-B 型毒素 ) 的 B chian 相似, 為了證實我們所純化出來的 CdtA-His 具有細胞結合能力方法 : 將培養在 Alpha-MEM 完全培養基的 CHO 細胞與不同濃度的 Cdt (Cdt 在含 3 % BSA 的 PBS 緩衝液中 ) 在 4 下處理不同的時間, 接著細胞以 anti-his-tag (0.1 μg/ml, Novagene) 於 4 下作用兩小時, 再與 FITC-labeled anti-mouse IgG (1:200, Calbiochem) 於 4 下作用兩小時最後以 Flow Cytometer (Becton Dickinson) 分析細胞表面結合毒素的能力 8. 細胞週期分析原因 : 三個 Cdt 次單元蛋白質對於造成 Cdt 毒性來說是必須的缺一不可, 為了分析分析 CdtA, CdtC 與細胞專一性的結合對 Cdt 完全毒素 (holotoxin) 的功能, 也就是 CdtA, CdtC 幫助扮演幫助 CdtB 進入細胞的角色, 以執行 cell cycle arrest 的功能方法 : 我們將 CHO 細胞培養小時, 以不同濃度的 Cdt 蛋白質在完全培養基中處理細胞 24 小時, 偵測前將固定好的細胞以轉速 1,000 rpm 離心 10 分鐘移除上清液, 加入配置好的染劑 (1% Triton X-100, 20 μg/ml RNase A, 20 g/ml propidium iodide) 混合均勻, 靜置 30 分鐘後, 以流式細胞分析儀 (Becton Dickinson) 測量細胞中 DNA 的含量 9. Cdt 與免疫細胞結合能力分析原因 : 為了探討 CdtA, B, C 與免疫細胞的結合能力方法 : 將培養在 RPMI-1640 完全培養基的 Jurkat 細胞與不同濃度的 CdtA, B, C 次單位在 4 下使其結合但不會內噬到細胞質中, 接著細胞以 anti-his-tag (0.1 μg/ml, Novagene) 於 4 下作用兩小時, 再與 FITC-labeled anti-mouse IgG (1:200, Calbiochem) 於 4 下作用兩小時最後以 Flow Cytometer (Becton Dickinson) 分析 Jurkat 細胞表面結合毒素的能力 10. 超高速離心分層原因 : 為了確認共軛焦顯微鏡所觀察到的結果, 我們利用 sucrose-gradient 超高速離心來分析 Cdt 次單位是否位於脂質筏 DRM 分層之中方法 :Jurkat 細胞與 CdtA, B, C 在 37 下作用 2 小時, 在以 1% Triton X-100 於 4 下作用 1 小時, 然後再將細胞溶解液置入 40%, 30% 與 5% 的 sucrose 之中, 進行超高速離心 36,000rpm,4 下離心 20 小時 (Beckman Coulter), 待離心結束由上層至下層每 500μl 分一層, 經 aceton 沉澱, 再進行 Western blot, 以 anti-his Ab 來偵測 Cdt 各個 subunits 是否位於 sucrose 濃度梯度比較小的上層 (fractions 1~5 即 lipid rafts) 16

17 References 1. On, S. L. (1996) Clin Microbiol Rev 9(3), Wooldridge, K. G., and Ketley, J. M. (1997) Trends Microbiol 5(3), Ketley, J. M. (1997) Microbiology 143 ( Pt 1), Hadden, R. D., Gregson, N. A., Gold, R., Willison, H. J., and Hughes, R. A. (2001) J Neuroimmunol 119(2), Lin, C. W., Yin, P. L., and Cheng, K. S. (1998) Zhonghua Yi Xue Za Zhi (Taipei) 61(6), Li, C. C., Chiu, C. H., Wu, J. L., Huang, Y. C., and Lin, T. Y. (1998) Scand J Infect Dis 30(1), Johnson, W. M., and Lior, H. (1988) Microb Pathog 4(2), Cortes-Bratti, X., Chaves-Olarte, E., Lagergard, T., and Thelestam, M. (1999) J Clin Invest 103(1), Shenker, B. J., McKay, T., Datar, S., Miller, M., Chowhan, R., and Demuth, D. (1999) J Immunol 162(8), Okuda, J., Kurazono, H., and Takeda, Y. (1995) Microb Pathog 18(3), Young, V. B., Chien, C. C., Knox, K. A., Taylor, N. S., Schauer, D. B., and Fox, J. G. (2000) J Infect Dis 182(2), Pickett, C. L., Pesci, E. C., Cottle, D. L., Russell, G., Erdem, A. N., and Zeytin, H. (1996) Infect Immun 64(6), Lara-Tejero, M., and Galan, J. E. (2000) Science 290(5490), Hickey, T. E., McVeigh, A. L., Scott, D. A., Michielutti, R. E., Bixby, A., Carroll, S. A., Bourgeois, A. L., and Guerry, P. (2000) Infect Immun 68(12), Shenker, B. J., Dlakic, M., Walker, L. P., Besack, D., Jaffe, E., LaBelle, E., and Boesze-Battaglia, K. (2007) J Immunol 178(8), Nesic, D., and Stebbins, C. E. (2005) PLoS Pathog 1(3), e Bielaszewska, M., Sinha, B., Kuczius, T., and Karch, H. (2005) Infect Immun 73(1), Hontz, J. S., Villar-Lecumberri, M. T., Potter, B. M., Yoder, M. D., Dreyfus, L. A., and Laity, J. H. (2006) J Biol Chem 281(35), Simons, K., and Toomre, D. (2000) Nat Rev Mol Cell Biol 1(1), Brown, D. A., and London, E. (2000) J Biol Chem 275(23), Manes, S., del Real, G., and Martinez, A. C. (2003) Nat Rev Immunol 3(7), Dykstra, M., Cherukuri, A., Sohn, H. W., Tzeng, S. J., and Pierce, S. K. (2003) Annu Rev Immunol 21, Lafont, F., Tran Van Nhieu, G., Hanada, K., Sansonetti, P., and van der Goot, F. G. (2002) Embo J 21(17), Kowalski, M. P., and Pier, G. B. (2004) J Immunol 172(1), Grassme, H., Jendrossek, V., Riehle, A., von Kurthy, G., Berger, J., Schwarz, H., Weller, M., Kolesnick, R., and Gulbins, E. (2003) Nat Med 9(3), Lai, C. H., Chang, Y. C., Du, S. Y., Wang, H. J., Kuo, C. H., Fang, S. H., Fu, H. W., Lin, H. H., Chiang, A. S., and Wang, W. C. (2008) Infect Immun 76(7), Abrami, L., Liu, S., Cosson, P., Leppla, S. H., and van der Goot, F. G. (2003) J Cell Biol 160(3),

18 28. Kuo, C. H., and Wang, W. C. (2003) Biochem Biophys Res Commun 303(2), Nakayama, M., Hisatsune, J., Yamasaki, E., Nishi, Y., Wada, A., Kurazono, H., Sap, J., Yahiro, K., Moss, J., and Hirayama, T. (2006) Infect Immun 74(12), Lai, C. H., Chang, Y. C., Du, S. Y., Wang, H. J., Kuo, C. H., Fang, S. H., Fu, H. W., and Wang, W. C. (2007) Infect Immun (submitted and under review) 31. Hontz, J. S., Villar-Lecumberri, M. T., Dreyfus, L. A., and Yoder, M. D. (2006) Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun 62(Pt 3), Lara-Tejero, M., and Galan, J. E. (2001) Infect Immun 69(7), van der Goot, F. G., Tran van Nhieu, G., Allaoui, A., Sansonetti, P., and Lafont, F. (2004) J Biol Chem 279(46), Hayward, R. D., Cain, R. J., McGhie, E. J., Phillips, N., Garner, M. J., and Koronakis, V. (2005) Mol Microbiol 56(3), Guerra, L., Teter, K., Lilley, B. N., Stenerlow, B., Holmes, R. K., Ploegh, H. L., Sandvig, K., Thelestam, M., and Frisan, T. (2005) Cell Microbiol 7(7), Boesze-Battaglia, K., Besack, D., McKay, T., Zekavat, A., Otis, L., Jordan-Sciutto, K., and Shenker, B. J. (2006) Cell Microbiol 8(5), Cortes-Bratti, X., Karlsson, C., Lagergard, T., Thelestam, M., and Frisan, T. (2001) J Biol Chem 276(7), Lai, C. H., Kuo, C. H., Chen, Y. C., Chao, F. Y., Poon, S. K., Chang, C. S., and Wang, W. C. (2002) J Clin Microbiol 40(10),

福利部疾病管制署,2013;Lin, Wang, Tung, & Chen, 2009) 腸病毒的型別繁多, 廣泛的分布於全球, 在室溫中存活穩定, 適合在濕熱的環境下生存, 常發生在夏季及早秋, 而在熱

福利部疾病管制署,2013;Lin, Wang, Tung, & Chen, 2009) 腸病毒的型別繁多, 廣泛的分布於全球, 在室溫中存活穩定, 適合在濕熱的環境下生存, 常發生在夏季及早秋, 而在熱預防並不難 - 談腸病毒的照護與預防台北醫學大學公共衛生系趙映婷基隆長庚醫院護理部陳淑賢基隆長庚醫院小兒科蔡明翰前言腸病毒這個病名我們並不陌生, 但是我們到底對腸病毒的了解有多少? 很多人常常把腸病毒感冒流感病毒