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桓季
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1 动物营养学报 2015,27(5): Chinese Journal of Animal Nutrition doi: / j.issn x 不同处理水稻秸秆对体外瘤胃发酵模式甲烷产量和微生物区系的影响辛杭书刘凯玉张永根王明君李仲玉王志博潘春方李欣新刘可园 ( 东北农业大学动物科学与技术学院, 哈尔滨 ) 摘要 : 本试验旨在研究不同处理水稻秸秆对瘤胃发酵模式甲烷产量和微生物区系的影响以 3 头安装有永久性瘤胃瘘管的健康荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体, 各处理分别以干秸秆 ( 对照 ) 青贮秸秆氨化秸秆和碱化秸秆为发酵底物, 通过体外产气量法, 测定培养 72 h 内的产气量甲烷产量瘤胃发酵参数及瘤胃微生物区系的变化结果表明 : 青贮氨化和碱化处理均显著增加了秸秆体外培养 72 h 的产气量和 24 h 的总挥发性脂肪酸浓度 ( P<0.05), 碱化处理显著增加了 72 h 的甲烷产量 ( P<0.05), 青贮和氨化处理显著增加了 24 h 的丙酸含量 ( P<0.05), 显著降低了乙酸 / 丙酸 ( P < 0. 05) 各处理中以碱化秸秆的产气量 ( ml) 和甲烷产量 (43.23 ml) 最高与未处理的干秸秆相比, 氨化和碱化处理显著提高了体外培养 24 h 培养液中琥珀酸丝状杆菌的相对数量 ( P<0.05), 氨化处理显著降低了甲烷菌的相对数量 ( P<0.05), 而各处理对培养液中的白色瘤胃球菌黄色瘤胃球菌真菌和原虫的相对数量没有显著影响 ( P> 0.05) 由此可见, 对水稻秸秆进行青贮氨化和碱化处理, 可以不同程度地改变体外瘤胃的发酵模式甲烷生成以及瘤胃微生物区系的组成 ; 从甲烷减排角度考虑, 可选择青贮和氨化的处理方式关键词 : 水稻秸秆 ; 青贮 ; 氨化 ; 碱化 ; 瘤胃发酵 ; 甲烷 ; 微生物区系中图分类号 :S823 文献标识码 :A 文章编号 : X(2015) 甲烷是除二氧化碳 ( CO 2 ) 以外最主要的温室气体之一据政府间气候变化专门委员会 ( IPCC) 统计, 畜牧业排出的温室气体占 8% ~ 10.8%, 尤其是反刍动物养殖产业 [1] 而在各种温室气体中, 甲烷的温室效应潜势远大于 CO 2, 但由于其存在时间低于 CO 2, 可以作为优先减排对象 [2] 研究表明, 通过改良饲粮组分可以有效降低反刍动物温室气体的排放量, 进而减缓环境恶化的趋势 [3] 水稻秸秆是反刍动物重要的粗饲料原料之一, 加工处理后的水稻秸可以有效减少动物的甲 [4] 烷排放量华金玲等研究表明, 经过青贮和氨化处理的水稻秸秆能显著降低反刍动物的甲烷排放量然而, 青贮或氨化处理降低甲烷产量的机理如何, 是否是通过影响瘤胃微生物区系这一途径来实现的, 此类研究还鲜有报道针对这一问题, 设计了本试验, 通过体外产气法, 研究不同处理水稻秸秆 ( 青贮氨化和碱化 ) 对甲烷生成瘤胃发酵模式以及瘤胃微生物区系的影响, 应用实时定量 PCR( RT PCR) 方法对甲烷生成相关的微生物群落, 如甲烷菌黄色瘤胃球菌白色瘤胃球菌原虫真菌等进行相对定量分析, 旨在探究各处理的水稻秸秆对甲烷产生的影响是否通过改变某些微生物区系来实现的, 为生产实践提供理论科学依据收稿日期 : 基金项目 : 黑龙江省教育厅科技项目 ( ) ; 东北农业大学科学研究基金 (2010RCB33) 作者简介 : 辛杭书 (1982 ), 女, 辽宁抚顺人, 副教授, 博士, 主要从事反刍动物营养研究 E mail: xinhangshu@163.com

2 5 期辛杭书等 : 不同处理水稻秸秆对体外瘤胃发酵模式甲烷产量和微生物区系的影响材料与方法 1.1 不同处理水稻秸秆的制备由东北农业大学香坊农场提供优质的水稻秸秆 [ 干物质 ( DM) 32%], 切割成为 2 ~ 3 cm 长度后, 分别对其进行不同的加工处理, 每个处理设 3 个重复, 每个重复制作 5 kg 青贮秸秆 : 选用复合乳酸菌制剂 ( CFU / g), 按秸秆 DM 的 8% 进行喷洒添加, 充分混合, 使其含水量达到 75%( 每 5 kg 秸秆中菌剂水溶液的添加量约为 1.4 kg), 在青贮袋中压实并密封, 青贮处理 45 d 复合乳酸菌制剂由东北农业大学动物科学技术学院反刍动物营养实验室提供, 主要由植物乳酸菌 ( L.plantarum) 布氏乳杆菌 ( L.buchneri) 和干酪乳杆菌 ( L. casei) 构成氨化秸秆 : 将新鲜秸秆晾晒至其含水量达到 30%, 然后将秸秆 DM 5% 的尿素溶于水中 ( 每 5 kg 秸秆中尿素水溶液的添加量约为 1.4 kg), 均匀地喷洒于秸秆上, 使其含水量达到 45%, 然后装入塑料袋中并密封, 氨化处理 30 d 碱化秸秆 : 将新鲜秸秆晾晒至其含水量达到 30%, 取秸秆 DM 4% 的氢氧化钠溶于水中 ( 每 5 kg 秸秆中氢氧化钠水溶液的添加量约为 0.8 kg), 均匀地喷洒于秸秆上, 使其含水量达到 40%, 装入塑料袋中并密封, 碱化处理 7 d 未处理干秸秆 : 晾晒至风干样, 作为对照 1.2 体外培养产气量和瘤胃发酵参数的测定 [5] 体外发酵产气量的测定采用 Menke 等及 [6] Schofield 等方法进行瘤胃液取自 3 头装有永久性瘤胃瘘管的健康奶牛, 于晨饲 2 h 后由瘤胃的不同位点采集瘤胃液, 装入事先预热并通入 CO 2 的保温瓶中, 立即盖严瓶口, 迅速返回实验室将采集的瘤胃液充分混合后经 4 层纱布过滤 ( 在 39 温水浴中进行, 通入 CO 2, 保持厌氧环境 ), 按比例与缓冲液混合后 ( 瘤胃液缓冲液 = 1 2, 体积比 ), 利用瓶口分配器迅速分装 (30 ml) 至已预热好, 通有 CO 2 并装有 g( DM 基础 ) 发酵 [5] 底物的培养瓶中其中缓冲液参照 Menke 等的方法进行配制每个处理设 3 个重复,3 个空白 ( 只装有瘤胃液与缓冲液 ) 发酵装置主体为 HZS H 型恒温水浴摇床, 其水浴温度和振荡速率均可调 ; 培养单位是用容积约 100 ml 的培养瓶, 其上安装有带塑料管的橡皮塞, 用于密封培养瓶 ; 塑料管上带有可调开关的三通阀以保证厌氧发酵环境 ; 三通阀与医用玻璃注射器 ( 可计量容积为 50 ml) 相连注射器每次使用之前须洗净烘干, 然后用少量液体石蜡涂在活塞筒的四周, 以防漏气, 并可减少气体产生过程中活塞向上移动的阻力记录和 72 h 的产气量, 并在和 72 h 用气体样品袋收集气体, 立即测定甲烷产量 [7] 在发酵 24 h 后, 迅速测定培养液中的 ph( sartorius PB-10 型酸度计, 赛多利斯科学仪器北京有限公司 ), 然后取 10 ml 培养液以测定挥发性脂肪酸 ( VFA) 的含量甲烷产量及 VFA 浓度的测定均采用岛津 GC-2010 气相色谱仪进行, 其中甲烷产量测定时的色谱条件为 : 热导检测器 ( TCD) ; 填充柱 TDX-01 色谱柱 ; 测定条件为柱温 150, 检测器 180, 进样口温度 180 ; 载气为氮气 ( N 2 ), 流速 30 ml / min; 进样量 200 μl VFA 浓度测定时的色谱条件为 : 汽化室参数为载气 N 2, 分流比 40 1, 进样量 0.4 μl, 温度 220 ; 色谱柱参数为 HP INNOWax 毛细管色谱柱恒流模式, 流量 2.0 ml / min, 平均线速度 38 cm / s; 柱温箱参数为程序升温 120 ( 3 min ) 10 / min 180 (1 min) ; 检测器参数为氢气 ( H 2 ) 流量 40 ml / min, 空气流量 450 ml / min, 柱流量 + 尾吹气流量 45 ml / min, 火焰离子检测器 ( FID) 温度 250 另取 10 ml 培养液快速转移至 -80 冰箱内保存, 用于微生物 DNA 的提取 1.3 瘤胃微生物总 DNA 的提取采用珠磨 - 十六烷基三甲基溴化铵 ( CTAB) [8] 法提取瘤胃微生物总 DNA 提取后, 用紫外可见分光光度计测定提取的总 DNA 浓度和纯度, 样品的 OD 260 nm 与 OD 280 nm 比值应在 1. 6 ~ 1. 8 之间 ( 平均在 1.75 左右 ), 且用琼脂糖凝胶电泳检测所提取的总 DNA 在加样孔附近呈现一致密亮带时, -20 保存备用 1.4 应用 RT PCR 技术检测微生物相对数量从瘤胃微生物总 DNA 中扩增真细菌 16S rdna PCR 反应体系 : 10 缓冲液 2 μl, 10 mmol / L 的 dntp 0.4 μl,10 μmol / L 的引物各 0.8 μl,25 mmol / L 的 MgCl μl, 模板 ( 瘤胃总 DNA) 0. 4 μl, TaqDNA 聚合酶 2 μl, ddh 2 O 为 13.6 μl, 总体积为 20 μl PCR 反应参数 :95

3 1634 动物营养学报 27 卷变性 7 min;95 1 min,55 1 min,72 3 min, 35 个循环 ;72 延伸 7 min RT PCR 的引物参照 [9] Denman 等报道的瘤胃总细菌甲烷菌黄色瘤胃球菌白色瘤胃球菌和真菌引物序列 [ 表 1, 由上海生工生物工程 ( 上海 ) 股份有限公司 ] 所用仪器为 ABI7500 型 RT PCR 仪,RT PCR 的反应条件参照 SYBR Premix Ex Taq TM 试剂建立 25 μl 反应体系表 1 实时定量 PCR 引物序列 Table 1 Primer sequences for RT PCR [9] 目标菌 Target species 总菌 Total bacteria 白色瘤胃球菌 R.albus 黄色瘤胃球菌 R.flave faciens 琥珀酸丝状杆菌 F.succinogene 甲烷菌 Methanogens 原虫 Protozoa 真菌 Fungi 引物序列 Primer sequences(5 3 ) F:CGGCAACGAGCGCAACCC R:CCATTGTAGCACGTGTGTAGCC F:GTTTTAGGATTGTAAACCTCTGTCTT R:CCTAATATCTACGCATTTCACCGC F:GATGCCGCGTGGAGGAAGAAG R:CATTTCACCGCTACACCAGGAA F:GGCGGGATTGAATGTACCTTGAGA R:TCCGCCTGCCCCTGAACTATC F:TTCGGTGGATCDCARAGRGC R:GBARGTCGWAWCCGTAGAATCC F:GCTTTCGWTGGTAGTGTATT R:CTTGCCCTCYYAATCGTWCT F:GAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTC R:CAAATTCACAAAGGGTAGGATGATT 1.5 计算公式根据下面公式将瘤胃微生物相对数量表示为相对于瘤胃总细菌 16S rdna 的百分比 : 目标菌相对数量 ( %)= 2 -(Ct 目标菌 -Ct 总细菌 ) 100 [3] 式中 :Ct 目标菌为以目标菌引物所测的 Ct 值, Ct 总细菌为以总细菌为引物所得的 Ct 值采用下列模型计算动态产气参数 : y = B [1-e -c (t-lag) ] 式中 :y 为 t 时间点 g 底物 DM 的产气量 ( ml),b 为 g 底物 DM 理论最大产气量 (ml),c 为样本的产气速度 ( h -1 ),t 为体外培养时间 ( h),lag 为产气延滞期 ( h) 1.6 数据统计分析试验数据用 Excel 初步记录并做简单处理, 利用 7500 System Software 分析 RT PCR 结果然后采用 SAS 9.1 软件包进行数据统计分析, 并用混合模型 ( mixed procedure) 进行多重比较 2 结果 2.1 不同处理水稻秸秆对 72 h 产气量及甲烷产量的影响由表 2 可知, 与未处理的干秸秆相比, 不同处理方法可显著提高秸秆 72 h 体外培养的产气量 (P<0.05), 青贮氨化和碱化处理分别将产气量提高了 5.62% 9.37% 和 21.38% 甲烷产量的变化趋势与产气量相似, 各处理秸秆的甲烷产量由高到低依次为碱化秸秆氨化秸秆青贮秸秆和干秸秆, 其中碱化处理效果显著 ( P<0.05) 碱化秸秆的产气速度最快, 显著高于其他 3 种秸秆 ( P < 0.05) 秸秆经青贮处理后, 其产气延滞期显著低于其他 3 种秸秆 ( P<0.05), 干秸秆氨化秸秆和碱化秸秆之间的差异不显著 ( P >0.05) 在 72 h 体外培养过程中, 产气量的动态变化参见图 1, 在 12 h 之前, 青贮秸秆产气量最高, 其他由高到低为碱化秸秆氨化秸秆和干秸秆 ; 而在 12 h 之后, 碱化秸秆的产气量一直处于最高水平, 干秸秆最低, 青贮和氨化秸秆居中甲烷产量的动态变化趋势与体外产气量相似 ( 图 2)

4 5 期辛杭书等 : 不同处理水稻秸秆对体外瘤胃发酵模式甲烷产量和微生物区系的影响 1635 Table 2 表 2 不同处理水稻秸秆对体外培养 72 h 产气量及甲烷产量的影响 Effects of different treated on rumen gas production and methane production after 72 h in vitro incubation 项目 Items 干秸秆 Dried rice straws 青贮秸秆 Rice straws silage 氨化秸秆 Aminated 碱化秸秆 Alkalified SEM P 值 P value 产气量 Gas production / ml c b b a 4.46 <0.001 甲烷产量 Methane production / ml b b b a 产气速度 Rate of gas production / 10-3 h b b b a 产气延滞期 Demurrage time of gas production / h 5.65 a 2.68 b 5.40 a 5.41 a 0.37 <0.001 同行数据肩标不同小写字母表示差异显著 ( P<0.05) 下表同 Means with different small letter superscripts in the same row differ significantly ( P<0.05). The same as below. 图 1 不同处理水稻秸秆的 72 h 体外产气量的动态变化 Fig.1 The dynamic change of gas production of different treated in 72 h 图 2 不同处理水稻秸秆的 72 h 体外甲烷产量的动态变化 Fig.2 The dynamic change of methane production of different treated in 72 h 2.2 不同处理水稻秸秆对瘤胃发酵参数的影响由表 3 可知, 不同处理方法对水稻秸秆体外培养氨态氮 ( NH 3 N) 浓度有显著的影响 ( P < 0.05), 其中氨化秸秆的 NH 3 N 浓度最高, 其次为青贮秸秆和碱化秸秆, 而干秸秆的 NH 3 N 浓度最低与未处理的干秸秆相比, 不论是青贮氨化还是碱化, 均显著提高了体外培养的挥发性脂肪酸 ( TVFA) 浓度 ( P <0.05), 其中青贮秸秆和氨化秸秆显著提高了丙酸的含量 ( P<0.05), 降低了乙酸 / 丙酸 ( P<0.05), 碱化秸秆与干秸秆具有相似乙酸 / 丙酸 ( P>0.05) 而对于甲烷 / TVFA 而言, 氨化秸秆显著低于干秸秆和碱化秸秆 ( P<0.05) 2.3 不同处理水稻秸秆对瘤胃微生物区系的影响由表 4 可知, 与未处理的干秸秆相比, 秸秆经不同加工处理后, 显著影响了培养液中琥珀酸丝状杆菌和甲烷菌相对数量 ( P <0.05), 其中氨化和碱化处理显著提高了瘤胃培养液中琥珀酸丝状杆菌的相对数量 ( P<0.05), 而氨化处理显著降低了培养液中甲烷菌的相对数量 ( P <0.05), 但各处理方式对瘤胃培养液中白色瘤胃球菌黄色瘤胃球菌真菌和原虫的相对数量没有显著影响 ( P > 0.05) 由图 5 可知, 不同处理的秸秆对各时间点的瘤胃微生物区系有明显的影响, 并且各处理中的各种微生物相对数量均随着时间的变化而变化, 虽然变化规律并不是很一致, 但均呈现一定的持续性其中, 各处理的白色瘤胃球菌随着时间的增加而呈现先升高后下降, 再升高再下降的趋势, 但产生变化的时间各点略有不同黄色瘤胃球菌和真菌则随着时间的增加而呈现先增加后下降的趋势在 12 h 前, 青贮秸秆培养液中琥珀酸丝状杆菌的相对数量显著高于干秸秆, 其变化趋势与黄色瘤胃球菌相似对于甲烷菌而言, 各处理后秸秆在 12 h 前相对稳定, 而在 12 h 后, 呈现出先

5 1636 动物营养学报 27 卷增加后下降, 而后再增加再下降的趋势, 尤其是青贮秸秆, 在 12 h 前几乎没有明显的变化各处理秸秆随着时间的变化对原虫相对数量变化趋势类似, 总体趋于增加, 但变化幅度很小 Table 3 表 3 不同处理水稻秸秆对体外培养 24 h 瘤胃发酵参数的影响 Effects of different treated straws on rumen fermentation parameters after 24 h in vitro incubation 项目 Items 干秸秆 Dried rice straws 青贮秸秆 Rice straws silage 氨化秸秆 Aminated 碱化秸秆 Alkalified SEM P 值 P value 氨态氮 NH 3 N / ( mg / dl) c b a b ph 总挥发性脂肪酸 TVFA / ( mmol / L) c b a a 1.47 <0.001 乙酸 Acetate / % 丙酸 Propionate / % b a a b 丁酸 Butyrate / % 乙酸 / 丙酸 Acetate / propionate 4.62 a 4.37 c 4.46 bc 4.58 ab 甲烷 / 总挥发性脂肪酸 Methane / TVFA / (10 2 ml / mmol) a ab b a 表 4 不同处理水稻秸秆体外培养 24 h 的微生物区系的影响 Table 4 Effects of different treated on microflora after 24 h in vitro incubation % 项目 Items 干秸秆 Dried rice straws 青贮秸秆 Rice straws silage 氨化秸秆 Aminated 碱化秸秆 Alkalified SEM P 值 P value 白色瘤胃球菌 R.albus / % 黄色瘤胃球菌 R.flavefaciens / % 琥珀酸丝状杆菌 F.succinogene / % 7.08 b 7.20 b 9.08 a 8.38 a 甲烷菌 Methanogen / 10-1 % 2.56 a 2.53 a 2.20 b 2.37 ab 真菌 Fungi / 10-2 % 原虫 Protozoa / 10-2 % 讨论体外发酵产气量是衡量饲料可消化性的重要指标之一, 而产气量与营养物质的消化率往往呈正相关性 [10], 本试验选用的 3 种处理方法均显著提高了体外发酵的产气量, 表明青贮氨化及碱化均能一定程度上改善水稻秸秆的质量, 这与前人研究结果相一致 [11-12] 这是由于对秸秆进行处理后, 能改变其纤维类成分的相对含量, 从而有利于瘤胃微生物的发酵 [13] 而青贮处理后的秸秆, 其体外发酵的产气延滞期显著低于其他 3 种秸秆, 这可能由于青贮秸秆含有较高含量的有机酸和乳酸菌, 从而缩短了秸秆的发酵产气延滞期 [14] 通过青贮氨化或碱化处理的秸秆的产气量显著高于干秸秆, 说明此 3 种处理能有效提高秸秆的消化率而氨化秸秆的甲烷 / TVFA 最低, 说明甲烷能的损失量降低, 这与前人的研究结果一致 [15-16] [17] Getachew 等通过体外发酵研究得出, 饲料中的慢速降解部分能产生更多的甲烷水稻秸秆通过氨化处理后, 显著降低了秸秆中性洗涤纤维 ( NDF) 的含量, 而 NDF 是生成乙酸的前体物质, 所以 NDF 含量的降低会使瘤胃发酵模式发生变化 ( 由乙酸型转向丙酸型发酵 ), 进而使参与生成甲烷的底物 H 2 有所减少经过处理的水稻秸秆体外发酵后的 NH 3 N 浓度都有明显的增加, 这是由于处理后的秸秆, 其发酵能力提高, 进而使粗蛋白质的降解速度加快 [18] 其中氨化秸秆的培养液 NH 3 N 浓度高于青贮秸秆

6 ５期辛杭书等不同处理水稻秸秆对体外瘤胃发酵模式甲烷产量和微生物区系的影响和碱化秸秆原因是氨化处理由于添加了氮源为１６３７ＮＨ３Ｎ所致微生物发酵提供更多含量的含氮底物来生成图５Ｆｉｇ５不同处理水稻秸秆对体外培养７２ｈ微生物相对数量的影响Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｒｅａｔｅｄｒｉｃｅｓｔｒａｗｓｏｎｍｉｃｒｏｂｅｎｕｍｂｅｒｄｕｒｉｎｇ７２ｈｉｎｖｉｔｒｏｉｎｃｕｂａｔｉｏｎＶＦＡ是反刍动物能量利用的主要形式主要包括乙酸丙酸和丁酸这３种酸约占瘤胃发酵ＶＦＡ总产量的９５１９２０在本试验中３种不同法可通过降低乙酸丙酸来降低甲烷的产量这与Ｒｕｓｓｅｌｌ２１和Ｃａｏ等１６报道结果相吻合瘤胃中的纤维降解细菌主要有黄色瘤胃球处理水稻秸秆的试验组中ＴＶＦＡ浓度均高于干秸菌白色瘤胃球菌琥珀酸丝状杆菌和溶纤维丁酸秆这可能由于青贮青贮和氨化处理可以将秸秆弧菌Ｆｅｒｎａｎｄｏ等２２研究发现在高粗饲粮条件的细胞壁变疏松有利于微生物的发酵进而产生下琥珀酸丝状杆菌为瘤胃发酵中的优势菌群更多的ＶＦＡ并且青贮秸秆和氨化秸秆的乙酸这与本试验的研究结果相似尿素氨化处理提高丙酸有显著降低这也进一步表明这２种处理方了秸秆在瘤胃发酵中产生的琥珀酸丝状杆菌相对

7 1638 动物营养学报 27 卷 [23] 数量, 这与陈伟健等研究结果一致 Wanapat [24] 等采用 RT PCR 技术进行动物体内试验, 发现氨化处理后的水稻秸秆, 显著提高了瘤胃培养液中白色瘤胃球菌和黄色瘤胃球菌的数量然而, 本试验并未发现相似的结果, 这可能是由于体内试验和体外试验条件差异原因所产生不同的瘤胃内环境条件所致在培养前期, 青贮秸秆能显著提高琥珀酸丝状杆菌的相对数量, 琥珀酸丝状杆菌在瘤胃发酵中的主要产物为乙酸和琥珀酸, 并不产生 H 2 所以, 青贮处理可能通过促进不产氢菌的生长来降低秸秆发酵中 H 2 的产生, 从而减少甲烷的生成 [25] 真菌在瘤胃纤维降解中同样发挥重要的作 [26] 用 Wood 等通过体外研究表明, 瘤胃真菌和产甲烷菌对纤维的降解存在促进作用, 而甲烷菌的存在能改变瘤胃真菌的活性改变发酵产物, 使其趋于产生更多的乙酸甲烷和 CO 2 本试验表明, 在培养初期, 青贮秸秆的培养液中真菌和甲烷菌的相对数量最低, 表明青贮处理不利于甲烷菌和真菌的生长而真菌相对数量并不受处理条件的影响在 16 h 前青贮秸秆的培养液中, 甲烷菌相对数量低于其他 3 种秸秆, 这可能是由于青贮秸秆含较高的有机酸, 致使甲烷菌的生长受到抑制所致 [27] 所以在体外培养初期, 青贮秸秆的单位甲烷产量最低而氨化秸秆降低了 24 h 体外发酵甲烷菌的相对数量, 这与瘤胃培养液内纤维类物质代谢有关有研究表明, 甲烷菌数量与秸秆中 NDF 的含量呈明显的正相关性 [28] 当纤维类物质含量低时 ( 如氨化秸秆 ), 培养底物发酵能力增强, 甲烷生成底物 H 2 的供给量相对充足, 从而使甲烷的排放量增多 ; 而对于干秸秆而言, 由于纤维类物质含量高, 通过增加甲烷菌数量来提高甲烷产量, 进而保持瘤胃内环境稳定 3 种不同处理方法均没有显著影响秸秆发酵中瘤胃原虫相对数量, 原虫在瘤胃中以细菌真菌等为其主要捕食对象 [29], 并且与甲烷菌存在共生关系因此可以通过驱除原虫来减少甲烷菌, 进而降低甲烷的排放量 [30] 本试验结果表明, 原虫相对数量与甲烷菌变化并不一致 4 结论 1 对水稻秸秆进行青贮, 氨化和碱化处理, 可以不同程度地改变体外瘤胃的发酵模式, 甲烷生成以及瘤胃微生物区系的组成 2 从甲烷减排角度考虑, 可选择青贮和氨化的处理方式参考文献 : [ 1 ] VELLINGA TH V,DE HAAN M H A,SCHILS R L M,et al. Implementation of GHG mitigation on inten sive dairy farms:farmer preferences and variation in cost effectiveness [ J ]. Livestock Science, 2011, 137 (1 / 2 / 3) : [ 2 ] 张博, 陈国谦, 陈彬. 甲烷排放与应对气候变化国家战略探析 [ J]. 中国人口资源与环境, 2012, 22 (7) :8-14. [ 3 ] VERMEULEN S J, AGGARWAL P K, AINSLINE A,et al.options for support to agriculture and food se curity under climate change [ J ]. Environmental Sci ence and Policy,2012,15( 1) : [ 4 ] 华金玲, 张永根, 王立克, 等. 水稻秸青贮对反刍动物甲烷排放的影响 [ J]. 东北林业大学学报,2012,40 (7) : [ 5 ] MENKE K H,STEINGASS H.Estimation of energetic feed value obtained from chemical analysis and in vitro gas production using rumen fluid[ J].Animal Re search and Development,1988,28:7-55. [ 6 ] SCHOFIELD P,PELL A N. Measurement and kinetic analysis of the neutral detergent soluble carbohydrate fraction of legumes and grasses[ J].Journal of Animal Science,1995,73( 11) : [ 7 ] 胡伟莲, 王佳堃, 吕建敏, 等. 瘤胃体外发酵产物中的甲烷和有机酸含量的快速测定 [ J]. 浙江大学学报 : 农业与生命科学版,2006,32(2) : [ 8 ] BÜRGMANN H, PESARO M, WIDMER F, et al. A strategy for optimizing quality and quantity of DNA extracted from soil [ J ]. Journal of Microbiological Methods,2001,45( 1) :7-20. [ 9 ] DENMAN S E,MCSWEENEY C S.Development of a real time PCR assay for monitoring anaerobic fungal and cellulolytic bacterial populations within the rumen [ J].FEMS Microbiology Ecology,2006,58( 3) : [ 10] MENKE K H,RAAB L,SALEWSKI A,et al.the es timation of the digestibility and metabolizable energy content of ruminant feedingstuffs from the gas produc tion when they are incubated with rumen liquor in vitro[ J].The Journal of Agriculture Science,1979,93 (1) :

8 5 期辛杭书等 : 不同处理水稻秸秆对体外瘤胃发酵模式甲烷产量和微生物区系的影响 1639 [11] 张文举, 晏向华, 龚月生, 等. 青贮对玉米秸营养价值及其瘤胃有效降解率的影响 [ J]. 中国草食动物, 2003,23( 1) :8-9. [12] 刘丹. 化学处理对稻草超微结构和瘤胃微生物活力的影响 [ D]. 硕士学位论文. 杭州 : 浙江大学,2004: [13] 范华, 裴彩霞, 董宽虎. 不同保存方法对秸秆营养价值的影响 [ J]. 中国农学通报,2007,23(11) : [14] 华金玲. 水稻秸青贮制作营养价值和利用效果的比较 [ D]. 博士学位论文. 哈尔滨 : 东北农业大学, 2008: [15] BLÜMMEL M, GIVENS D I, MOSS A R. Compari son of methane produced by straw fed sheep in open- circuit respiration with methane predicted by fermenta tion characteristics measured by an in vitro gas proce dure[ J].Animal Feed Science and Technology,2005, : [ 16] CAO Y, TAKAHASHI T, HORIGUCHI K I, et al. Effect of adding lactic acid bacteria and molasses on fermentation quality and in vitro ruminal digestion of total mixed ration silage prepared with whole crop rice [ J]. Japanese Society of Grassland Science,2010,56 (1) : [ 17] GETACHEW G,ROBINSON P H, DEPETERS E J, et al. Methane production from commercial dairy ra tions estimated using an in vitro gas technique[ J].An imal Feed Science and Technology,2005, : [18] 冯仰廉. 反刍动物营养学 [ M]. 北京 : 科学出版社, [19] 李炯明, 庄苏, 王恬, 等. 海南霉素对人工瘤胃体外发酵调控的影响 [ J]. 家畜生态学报,2007,28( 1) : [20] 李旺. 瘤胃挥发性脂肪酸的作用及影响因素 [ J]. 中国畜牧杂志,2012,48(7) : [ 21] RUSSELL J B.The importance of ph in the regulation of ruminal acetate to propionate ratio and methane pro duction in vitro[ J].Journal of Dairy Science,1998,81 (12) : [22] FERNANDO S C,PURVIS H T,NAJAR F Z,et al. Rumen microbial population dynamics during adapta tion to a high grain diet[ J].Applied and Environmen tal Microbiology,2010,76( 22) : [23] 陈伟健, 王翀, 王佳堃, 等. 体外法研究氨化处理对稻草发酵特性及其微生物数量的影响 [ J]. 中国奶牛, 2011( 14) : [ 24] WANAPAT M,CHERDTHONG A.Use of Real-time PCR technique in studying rumen cellulolytic Bacteria population as affected by level of roughage in swamp buffalo[ J]. Current Microbiology,2009,58( 4) : [25] 池振明. 现代微生物生态学 [ M].2 版. 北京 : 科学出版社,2010. [26] WOOD T M,WILSON C A,MCCRAE S I,et al. A highly active extracellular cellulase from the anaerobic rumen fungus Neocallimastix frontalis[ J]. FEMS Mi crobiology Letter,1986,34( 1) : [27] 郭嫣秋, 胡伟莲, 刘建新. 瘤胃甲烷菌及甲烷生成的调控 [ J]. 微生物学报,2005,45(1) : [28] 郭嫣秋. 瘤胃产甲烷菌定量检测与微生物菌群调控研究 [ D]. 博士学位论文. 杭州 : 浙江大学, 2008: [ 29] JOUANY J P, USHIDA K. The role of protozoa in feed digestion review [ J]. Asian Australasian Journal of Animal Sciences,1999,12( 1) : [30] 陈丹丹, 刁其玉, 姜成钢, 等. 反刍动物甲烷的产生机理和减排技术研究进展 [ J]. 中国草食动物科学, 2012,32( 4) :66-69.

9 1640 动物营养学报 27 卷 Effects of Different Treated Rice Straws on Pattern, Methane Production and Microflora of in Vitro Ruminal Fermentation XIN Hangshu LIU Kaiyu ZHANG Yonggen WANG Mingjun LI Zhongyu WANG Zhibo PAN Chunfang LI Xinxin LIU Keyuan ( College of Animal Science and Technology, Northeast Agricultural University, Harbin , China) Abstract: The aim of this study was to investigate the effects of different treated on pattern, meth ane production and microflora of in vitro ruminal fermentation. Three Holstein cows fitted with permanent ru men fistulas were used as the donor of rumen fluid. Untreated dry rice straw ( control), rice straw silage, ami nated and alkalified were used as substrates, and the changes of gas production, methane production, ruminal fermentation parameters, as well as ruminal microbes during 72 h incubation were deter mined using in vitro gas production method. The results showed as follows: the treatments of silage, ammonia tion and alkalization significantly increased 72 h gas production and 24 h total volatile fatty acid concentration of incubated in vitro ( P<0.05), the treatment of alkalization significantly increased 72 h methane production ( P < 0. 05), and the treatments of silage and ammoniation significantly increased 24 h propionate content ( P<0.05) and significantly decreased acetate / propionate ( P <0.05). Among all the treatments, gas production ( ml) and methane production ( ml) were the highest in the treatment of alkalization ( P<0.05). Compared with untreated dried, the treatments of ammoniation and alkalization signifi cantly increased the relative number of F. succinogenes in culture medium after 24 h in vitro incubation ( P< 0.05), and that of ammoniation significantly decreased the relative number of Methanogens ( P<0.05), how ever, different treatments had no significant effects on the relative number of R. albus, R. flave faciens, proto zoa and fungi ( P>0.05). It is concluded that treatments of rice straw, such as silage, ammoniation and alkali zation can change pattern, methane production and microflora of in vitro ruminal fermentation; considering from methane production control, the treatments of silage and ammoniation are optional. [ Chinese Journal of Animal Nutrition, 2015, 27( 5) : ] Key words: rice straw; silage; ammoniation; alkalization; rumen fermentation; methane; microflora Author, XIN Hangshu, associate professor, E mail: xinhangshu@163.com ( 责任编辑王智航 )

吴根良等不同前作对设施草莓土壤环境动态变化和经济效益的影响 4 土传病害也因此日趋严重严重影响草莓的产量和品质轮作尤其是水旱轮作是克服连作障 5 6 233 棚揭开大棚膜其他大棚不揭膜都按常规进行水肥农药的管理 8 月初前作结束后用产品名碍的有效技术措施之一其中有关水稻草 7

吴根良等不同前作对设施草莓土壤环境动态变化和经济效益的影响 4 土传病害也因此日趋严重严重影响草莓的产量和品质轮作尤其是水旱轮作是克服连作障 5 6 233 棚揭开大棚膜其他大棚不揭膜都按常规进行水肥农药的管理 8 月初前作结束后用产品名碍的有效技术措施之一其中有关水稻草 7 24( 2) : 232 237 浙江农业学报 Acta Agriculturae Zhejiangensis 2012 http: / / www zjnyxb cn 2012 24( 2) : 吴根良忻雅童建新等不同前作对设施草莓土壤环境动态变化和经济效益的影响 J 浙江农业学报 232 237 不同前作对设施草莓土壤环境动态变化和经济效益的影响 1 吴根良忻 ( 1 1 * 雅童建新1