2584 临床与病理杂志, 2017, 37(12) Keywords (IRF1) expression levels in peripheral blood of children with bronchial asthma and clini

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1 临床与病理杂志 J Clin Pathol Res 2017, 37(12) doi: /j.issn View this article at: 支气管哮喘患儿外周血中 ADAM8,IRF1 的表达水平及其临床意义梁雯慧, 庄帝钱, 刘雅玲, 郭瑞雪 ( 深圳市龙华区中心医院儿科, 广东深圳 ) [ 摘要 ] 目的 : 探讨去整合素金属蛋白酶 8(disintegrins metalloproteinase 8,ADAM8) 干扰素调控因子 1(interferon regulatory factor 1,IRF1) 在支气管哮喘患儿外周血中的表达水平及其临床意义方法 : 选取 2015 年 3 月至 2017 年 3 月在我院诊治的 83 例支气管哮喘患儿为研究对象, 根据全球哮喘防治倡议 (Global Initiative for Asthma,GINA) 分为轻度持续组 47 例, 中度持续组 19 例, 重度持续组 17 例, 同期选取 35 例健康儿童作为对照组采用荧光定量 PCR(fluorescent quantitative PCR,qRT- PCR) 法检测各组儿童外周血中 ADAM8,IRF1 mrna 水平 ; 采用 Western 印迹检测各组儿童外周血中 ADAM8,IRF1 蛋白水平 ; 采用肺功能仪检测各组儿童肺功能 ; 分析 ADAM8,IRF1 蛋白水平与肺功能的相关性结果 : 与对照组比较, 哮喘患儿外周血中 ADAM8,IRF1 mrna 和蛋白水平均显著上调 (P<0.05), 中重度哮喘患儿外周血中 ADAM8,IRF1 mrna 和蛋白水平明显高于轻度患儿 (P<0.05) 哮喘患儿外周血中 ADAM8 与 IRF1 的表达呈正相关 (r=0.815,p<0.05) 哮喘患儿外周血中 ADAM8,IRF1 蛋白表达水平与第 1 秒用力呼气量 (forced expiratory volume in 1 second,fev1) 第 1 秒用力呼气量与用力肺活量比值 (forced expiratory volume in 1 second and forced vital capacity ratio,fev1/fvc) 用力呼气峰值流速(force expiratory peak velocity,pef) 等肺功能指标均呈负相关 (P<0.05) 结论:ADAM8,IRF1 在哮喘患儿外周血中高表达, 与肺功能呈负相关, 具有协同致炎作用, 提示 ADAM8,IRF1 可作为临床上评估哮喘病情发展的参考指标, 推测二者可作为治疗哮喘的新靶点 [ 关键词 ] 支气管哮喘 ; 去整合素金属蛋白酶 8; 干扰素调控因子 1; 儿童 ; 肺功能 ADAM8 and IRF1 expression levels in peripheral blood of children with bronchial asthma and clinical significance LIANG Wenhui, ZHUANG Diqian, LIU Yaling, GUO Ruixue (Department of Pediatrics, Central Hospital of Longhua District of Shenzhen, Shenzhen Guangdong , China) Abstract Objective: To explore disintegrins metalloproteinase 8 (ADAM8) and interferon regulatory factor 1 收稿日期 (Date of reception): 通信作者 (Corresponding author): 梁雯慧, lianghuiwen1981@sina.com 基金项目 (Foundation item): 深圳市科技计划项目 ( JCY ) This work was supported by Shenzhen Science and Technology Plan Project, China ( JCY ).

2 2584 临床与病理杂志, 2017, 37(12) Keywords (IRF1) expression levels in peripheral blood of children with bronchial asthma and clinical significance. Methods: A total of 83 cases of children with bronchial asthma treated in our hospital from March 2015 to March 2017 were selected as the study objects and divided into a mild persistent group (n=47), a moderate group (n=19), and a severe group (n=17) according to Global Asthma Initiative (GINA); 35 healthy children in the same period were as the control group. ADAM8 and IRF1 mrna levels in peripheral blood of children in each group were detected by fluorescent quantitative PCR (qrt-pcr), ADAM8 and IRF1 protein levels in peripheral blood of children in each group were tested by Western blot, lung function in each group was tested by lung function tester. The relevance of ADAM8, IRF1 protein levels and lung function was analyzed. Results: Compared with those in the control group, ADAM8, IRF1 mrna and protein levels in peripheral blood of asthmatic children significantly increased (P<0.05). ADAM8, IRF1 mrna and protein levels in peripheral blood of children with moderate and severe asthma were significantly higher than those of mild children (P<0.05). ADAM8, IRF1 mrna and protein levels in peripheral blood of asthmatic children were negatively correlated with the forced expiratory volume in 1 second (FEV1), forced expiratory volume in 1 second and forced vital capacity ratio (FEV1/FVC), forced peak expiratory flow (PEF) and other lung function indexes. Conclusion: ADAM8 and IRF1 high expression in peripheral blood of asthmatic children is negatively related to lung function, with synergistic proinflammatory effect. It is suggested that ADAM8 and IRF1 can be used as reference indexes for evaluating the development of asthma in clinic, and the two can be used as a new target for asthma treatment. bronchial asthma; integrin metalloproteinase 8; interferon regulatory factor 1; children; pulmonary function 支气管哮喘, 简称哮喘, 是以气道慢性炎症为特征的一种异质性疾病, 近年来其发病率呈全球上升趋势 [1] 临床上主要依靠药物治疗哮喘, 如长效 β 2 激动剂 (long acting beta-agonists,laba) 皮质类固醇 (corticosteroid,cs), 但对重度哮喘治疗效果不佳 [2] 因此寻找新的治疗靶点对有效治疗重度哮喘非常必要去整合素金属蛋白酶 8(disintegrins metalloproteinase 8,ADAM8) 是一种高度保守的类型 I 跨膜分泌型糖蛋白, 与气道中炎症细胞的迁移有关 [3] 干扰素调控因子 1(interferon regulatory factor 1,IRF1) 属于 IRF 家族, 是一种核转录因子, 参与调节细胞免疫细胞分化等生理过程 [4] 因此, 本研究通过比较 ADAM8,IRF1 在中重度哮喘患儿轻度哮喘患儿健康儿童外周血中的表达水平, 分析二者与哮喘程度及肺功能的相关性, 旨在探讨 ADAM8,IRF1 在哮喘发病中的作用, 为治疗哮喘寻找新靶点 1 对象与方法 1.1 对象选取 2015 年 3 月至 2017 年 3 月我院儿科诊治的支气管哮喘患儿 83 例, 根据全球哮喘防治倡议 (Global Initiative for Asthma, GINA) 分为轻度持续组 47 例, 中度持续组 19 例, 重度持续组 17 例所有患者在 4 周内均未使用激素和免疫抑制剂治疗另选取同期体检的 35 例健康儿童作为对照组轻度持续组男 25 例, 女 22 例 ; 年龄 4~12(7.8±2.5) 岁中重度持续组男 19 例, 女 17 例 ; 年龄 4~12(7.3±3.2) 岁 ; 对照组男 17 例, 女 18 例 ; 年龄 5~12(8.3±2.3) 岁 3 组儿童的性别年龄等一般资料差异无统计学意义 (P>0.05) 本研究经医院伦理委员会批准通过并取得研究对象监护人知情同意纳入标准 : 符合 2016 年中华医学会儿科学分 [5] 会呼吸学组修订的儿童支气管哮喘诊断标准中第 1~4 条或第 4,5 条者, 可诊断为哮喘诊断标准 : 1) 反复咳嗽喘息胸闷, 多与接触冷空气变应原物化刺激运动呼吸道感染及过度通气等有关, 常在夜间和 / 或凌晨发作或加剧 2) 发作时双肺可闻及散在或弥漫性, 以呼气相为主的哮鸣音, 呼气相延长 3) 以上体征症状抗哮喘治疗有效, 或自行缓解 4) 排除其他所致咳嗽喘息胸闷 5) 临床症状不典型者, 应具备支气管舒张试验阳性抗炎治疗后肺通气改善支气管激发试验阳性昼夜最大呼气峰流量变异率 ( 连续 2 周 ) 13% 中至少 1 项排除标准 : 排除其他肺部疾病等引起的咳嗽喘息胸闷及其他免疫性疾病

3 支气管哮喘患儿外周血中 ADAM8,IRF1 的表达水平及其临床意义梁雯慧, 等标本采集及保存采集各组儿童空腹静脉血 (4 ml/ 人 ), 加入 EDTA 抗凝管中, 采用 Ficoll-hypaque 密度梯度离心法分离外周血血清和单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cell,pbmc), 血清分装至 200 µl EP 管, 70 保存 ;PBMC 加入 200 µl TRIzol( 瑞士 Roche 公司 ) 或 200 µl 蛋白裂解缓冲液 ( 含 protease inhibitor Cocktail), 70 保存 1.3 荧光定量 PCR 检测 ADAM8,IRF1 mrna 水平采用 TRIzol 法提取外周血 PBMC 总 RNA 利用反转试剂盒 (Takara) 合成 cdna 引物序列见表 1 荧光定量 PCR(fluorescent quantitative PCR, qrt-pcr) 反应体系共 10 µl: cdna(100 ng/µl) 0.5 µl,sybr Green Master Mix 5 µl, 正反方向引物 (10 µmol/l) 各 0.4 µl,rnase-free H 2 O 3.7 µl 采用 Bio-Rad 定量 PCR 仪进行扩增反应反应条件 : 95,2 min;95,15 s;60,30 s;72, 20 s;40 个循环采用 2 Ct 法对数据进行分析每个样品进行 3 次生物学重复 1.4 Western 印迹检测 ADAM8,IRF1 蛋白水平提取外周血 PBMC 中总蛋白, 采用 BCA 试剂盒测定蛋白总量以 β-actin 蛋白作为内参, 采用 Western 印迹检测外周血血清中 ADAM8 蛋白水平和 PBMC 中 IRF1 蛋白水平采用 Tanon 软件采集图像并对蛋白表达水平进行半定量分析 1.5 肺功能检查采用耶格肺功能检测仪 ( Jaeger) 检测各组儿童的肺功能, 各项指标一次同步测得, 包括第 1 秒用力呼气量 (forced expiratory volume in one second, FEV 1 ) 第 1 秒用力呼气量与用力肺活量比值 (FEV 1 /forced vital capacity ratio,fev 1 /FVC) 用力呼气峰值流速 (peak expiratory flow,pef), 结果以占正常预计值的百分比表示检测至少重复 3 次, 数值变化不超过 5%, 取最佳值用于分析 1.6 统计学处理采用 SPSS 20.0 统计学软件进行分析, 计量资料以均数 ± 标准差 (x±s) 表示, 两组间比较 t 检验进行差异性分析采用 Pearson 法进行相关性分析 P<0.05 为差异有统计学意义 2 结果 2.1 外周血中 ADAM8,IRF1 mrna 水平与对照组比较, 哮喘患儿外周血中 ADAM8, IRF1 mrna 水平均显著上调, 差异有统计学意义 (P<0.05); 中重度患儿外周血中 ADAM8,IRF1 mrna 水平均明显高于轻度患者 (P<0.05, 表 2) 2.2 外周血中 ADAM8,IRF1 蛋白水平 ADAM8, IRF1 蛋白在哮喘患儿外周血中的表达量显著高于对照组, 差异有统计学意义 (P<0.05); 中重度患儿外周血中 ADAM8,IRF1 蛋白水平均显著高于轻度患者 (P<0.05, 表 3) 2.3 儿童肺功能比较与对照组比较, 哮喘患儿肺功能显著下降, 表现在 FEV 1,FEV 1 /FVC 及 PEF 等检测指标显著降低, 差异有统计学意义 (P<0.05); 中重度哮喘患儿 FEV 1,FEV 1 /FVC 及 PEF 等肺功能指标明显低于轻度患者 (P<0.05, 表 4) 2.4 哮喘患儿 ADAM8 与 IRF1 表达的相关性分析采用 Pearson 法分析, 哮喘患儿外周血 ADAM8 与 IRF1 表达呈正相关 (r=0.815,p<0.05; 图 1) 2.5 哮喘患儿 ADAM8 和 IRF1 蛋白水平与肺功能相关性分析经 Pearson 法分析, 哮喘患儿 ADAM8,IRF1 蛋白表达与 FEV 1,FEV 1 /FVC 和 PEF 等肺功能指标呈负相关, 差异有统计学意义 (P<0.05, 表 5) 表 1 qrt-pcr 引物序列 Table 1 Primers for qrt-pcr 基因正向引物 5' 3' 反向引物 5' 3' ADAM8 GGGAGAAACAACGAAGTTG GGTGTGATCAAGCACAGAT IRF1 GCGGCACCTGGCGCACGGCT GGTGGCAAGCACCAAGAC β-actin GTGACGTGGACAATCCGCAAG GGAAGGTGGACAACGGACGC

4 2586 临床与病理杂志, 2017, 37(12) 表 2 4 组儿童外周血中 ADAM8,IRF1 mrna 相对表达量 Table 2 Expression of ADAM8 and IRF1 mrna in peripheral blood of four groups 组别 n ADAM8/β-actin IRF1/β-actin 对照组 ± ±0.14 轻度持续组 ±0.12* 1.32±0.16* 中度持续组 ±0.62* # 1.87±0.19* # 重度持续组 ±0.33* # 2.23±0.21* # 与对照组比较,*P<0.05; 与轻度持续组比较, # P<0.05; 与中度持续组比较, P<0.05 Compared with the control group, *P<0.05; compared with the mild persistent group, # P<0.05; compared with the moderately persistent group, P<0.05. 表 3 4 组外周血中 ADAM8,IRF1 蛋白相对表达量 Table 3 Expression of ADAM8 and IRF1 protein in peripheral blood of four groups 组别 n ADAM8/β-actin IRF1/β-actin 对照组 ± ±0.24 轻度持续组 ±0.25* 1.49±0.45* 中度持续组 ±0.41* # 1.98±0.35* # 重度持续组 ±0.61* # 2.65±0.55* # 与对照组比较,*P<0.05; 与轻度持续组比较, # P<0.05; 与中度持续组比较, P<0.05 Compared with the control group, *P<0.05; compared with the mild persistent group, # P<0.05; compared with the moderately persistent group, P<0.05. 表 4 4 组儿童肺功能的比较 Table 4 Difference of lung function among four groups 组别 n FEV 1 /% FEV 1 /FVC/% PEF/% 对照组 ± ± ±13.22 轻度持续组 ±8.47* 89.39±11.59* 85.95±11.72* 中度持续组 ±7.91* # 75.43±10.63* # 72.43±9.36* # 重度持续组 ±10.11* # 63.73±9.57* # 58.82±12.19* # 与对照组比较,*P<0.05; 与轻度持续组比较, # P<0.05; 与中度持续组比较, P<0.05 Compared with the control group, *P<0.05; compared with the mild persistent group, # P<0.05; compared with the moderately persistent group, P<0.05.

5 支气管哮喘患儿外周血中 ADAM8,IRF1 的表达水平及其临床意义梁雯慧, 等 2587 ADAM8 3 讨论 R 2 线性 = IRF1 图 1 哮喘患儿 ADAM8 与 IRF1 表达相关性分析 Figure 1 Correlation analysis of ADAM8 and IRF1 in children with bronchial asthma 表 5 哮喘患儿 ADAM8,IRF1 蛋白水平与肺功能的相关性 Table 5 Correlation between lung function and expression of ADAM8, IRF1 in children with bronchial asthma 指标 FEV 1 /% FEV 1 /FVC/% PEF/% r P r P r P ADAM < < <0.001 IRF < < <0.001 支气管哮喘是儿童期最常见的一种气道慢性炎症性疾病, 其具体的发病机制尚不清楚目前认为, 气道炎症是支气管哮喘发病机制之一, 由多种免疫细胞及炎症因子参与 [6] 目前中重度哮喘患者约占总人数的 10%, 然而其花费却占 80%, 因此, 寻找有效靶点以提高中重度哮喘患者的治疗效果非常重要本研究 83 例支气管哮喘患儿为研究对象, 同期选取 35 例健康体检儿童作为对照, 分别采用 qrt-pcr 与 Western 印迹对外周血中 ADAM8,IRF1 mrna 和蛋白表达水平进行检测, 并探讨二者与肺功能临床指标的关系 ADAM 属于分泌型糖蛋白金属蛋白酶家族, 在嗜酸性粒细胞嗜中性粒细胞巨噬细胞单核细胞等多种免疫细胞中均有表达, 参与调节炎症细胞的迁移, 与肺癌等病理生理过程相关 [7] [8] 张林等发现 :ADAM33 基因 v4 多态性与支气管哮 [9] 喘易感性有关方丽萍等发现 :ADAM33 的表达 [10] 与哮喘的严重程度有关刘燕等发现 :ADAM10 基因 rs 位点的多态性与儿童哮喘的易感性有 [11] 关 Knolle 等发现 :ADAM8 能诱导小鼠炎症细胞凋亡, 促进炎症细胞从肺部清除, 推测 ADAM8 具有抗炎特性, 可减轻小鼠过敏性气道炎症 Oreo [12] 等发现 :ADAM8 在严重哮喘患者痰液中的表达水平明显增加, 与气道中炎症细胞嗜中性粒细胞的聚集相关, 表明 ADAM8 能促进炎症细胞向 [12] 哮喘患者气道迁移与 Oreo 等研究结果一致的是, 本研究发现哮喘患儿外周血中 ADAM8 mrna 和蛋白表达水平均明显上调, 且与 FEV 1, FEV 1 / FVC, PEF 等肺功能指标呈高度负相关提示 ADAM8 高表达能诱导哮喘发生, 促进病情发展 IRF 是一类转录因子, 定位于细胞核, 通过干扰素 (interferon, IFN) 信号通路参与调节多种基因表达, 参与细胞免疫细胞分化等生理过程 [13] [14] 研究发现大鼠感染呼吸道合胞病毒后, IRF1 能通过调节大鼠神经源性炎症介质的表达, [15] 促进气道炎症的发生 Bosco 等发现 IRF7 在病毒诱导的哮喘发作过程中发挥着重要作用, 推测 [16] IRF7 可作为治疗哮喘的新靶点 Chen 等发现 IRF4 在过敏性哮喘患者单个核细胞中高水平表达, 推测 IRF4 参与过敏性哮喘患者全身炎症的发 [17] 生 Wang 等发现 IRF5 与哮喘易感性和疾病严重程度有关推测 IRF1 高表达参与哮喘的发生, 通过参与炎症反应, 影响哮喘患者的肺功能, 促进病情发展 [14] 本研究发现 ADAM8 和 IRF1 在哮喘患儿外周血中均呈现高水平表达, 采用 Pearson 对二者进行相关性分析发现 : 哮喘患儿外周血中 ADAM8 和 IRF1 的表达呈高度正相关提示 ADAM8,IRF1 具有协同致炎作用, 共同参与哮喘疾病的发生发展过程综上所述, 本研究结果表明 :ADAM8, IRF1 在哮喘患儿外周血中明显高表达, 与 FEV 1, FEV 1 /FVC,PEF 等肺功能指标高度负相关, 具有协同致炎作用, 提示 ADAM8,IRF1 可作为临床上评估哮喘病情发展的参考指标, 推测二者可作为治疗哮喘的新靶点参考文献 1. Becker AB, Abrams EM. Asthma guidelines: the Global Initiative for Asthma in relation to national guidelines[ J]. Curr Opin Allergy Clin Immunol, 2017, 17(2): 中华医学会呼吸病学分会哮喘学组. 支气管哮喘防治指南 (2016 年版 )[ J]. 中华结核和呼吸杂志, 2016, 39(9): Chinese Medical Association Respiratory Diseases Branch Asthma Group. Guidelines for prevention and treatment of bronchial asthma

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600 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 were significantly decreased, but the levels of IL-12 in two groups were significantly increa

600 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 were significantly decreased, but the levels of IL-12 in two groups were significantly increa 现代药物与临床 Drugs & Clinic 第 31 卷第 5 期 2016 年 5 月 599 喘可治注射液联合细辛脑注射液治疗小儿毛细支气管炎的临床研究唐辉英, 佘定平, 马颐娇深圳市儿童医院呼吸科, 广东深圳 518026 摘要 : 目的探讨喘可治注射液联合