1 杭州师范大学学报 自然科学版 年 主要试剂和仪器 限制性内切酶购自! 公司 *($&+- 聚合酶购自,$&&%"( 公司 质粒纯化试剂盒 核酸纯化试剂盒 +- 胶回收试剂盒购自 *"'# 基因组提取试剂盒购自天根 *. 仪 美国 -$7$ 凝胶成像仪 $# 蛋白电泳仪 天能!1 恒温培养振荡器

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1 第 卷第 期 年 月 杭州师范大学学报 自然科学版!"#"$%% &'" $((&) 环己酮单加氧酶的克隆表达及酶学性质分析 翟晓红 陈振明 杭州师范大学生物催化研究室 浙江杭州 摘 要 为研究鞘氨醇杆菌中环己酮单加氧酶的催化特性 从 +3 基因组 +- 克隆表达了一个编码环己酮单加氧酶的基因 并分析了该基因产物的酶学性质 该基因全长 2 编码 个氨基酸 理论分子量为 ;+# 将携带此基因的重组质粒!/1# 转入 =+! 后 获得了 ;+# 左右的表达产物 重组环己酮单加氧酶.:3 能氧化芳香族硫醚及其衍生物 链式硫醚 其他硫醚和酮类等底物 以 氯乙基苯基硫醚为底物时活力最高 >"'.:3 最适反应温度和 : 分别为 9 和 11 倾向于利用 -+*: 作辅酶 上述结果表明 重组.:3 是一个新型的环己酮单加氧酶 推测其与硫醚及酮类物质的氧化降解有关 关键词 环己酮单加氧酶 鞘氨醇杆菌 优化表达 酶学性质中图分类号 01 文献标志码 - 文章编号 ) #%$$' 单加氧酶 3( 家族属于黄素类单加氧酶 通常用来立体选择性氧化链状和环状的酮 生成相应的酯或内酯 也能催化硫 氮和磷的亲电氧化反应 同时 3( 还能催化酮和硼的亲核氧化反应 环己酮单加氧酶不仅可以提供极有价值的手性砌块 而且在手性药物的合成方面也具有很大的应用潜力 如它可以将极为廉价的非手性药物中间体双环 双键 酮 加氧转化为极为昂贵的手性酯 生成物与反应物的市场价格相差近 倍 它还可以催化含硫原子的手性前体生成光学活性 的手性药物如莫达非尼和质子泵抑制剂奥美拉唑等 不是所有该家族的酶都能够外源表达 自 世 纪 1 年代第一个 3 家族的环己酮单加氧酶.:3 的基因被克隆至今 通过 &""$&$&' 等方法已经获得 余种该类酶 已有几种.:3( 得到了商业利用 但是还存在不足 产量很低 酶不稳定等很多问题 更多有价值的 3 和基因工程菌尚有待发现 为了获得高活力的 3 该研究从鞘氨醇杆菌 +3 基因组中扩增出环己酮单加氧酶基因 在大肠杆菌 =+! 中实现了功能性表达 对其酶学性质进行了研究 并探讨了重组.:3 在硫氧化反应合成手性亚砜方面的应用潜力 材料和方法 材料 菌株和质粒 +3 购自.3 质粒!/1# 实验室保藏 收稿日期 通信作者 陈振明 男 副教授 主要从事生物催化和绿色化学研究!"#$"&'"#$"

2 1 杭州师范大学学报 自然科学版 年 主要试剂和仪器 限制性内切酶购自! 公司 *($&+- 聚合酶购自,$&&%"( 公司 质粒纯化试剂盒 核酸纯化试剂盒 +- 胶回收试剂盒购自 *"'# 基因组提取试剂盒购自天根 *. 仪 美国 -$7$ 凝胶成像仪 $# 蛋白电泳仪 天能!1 恒温培养振荡器 上海精宏 :?* 超净工作台 苏净安泰.,+ 培养基 *< 培养基 '= 蛋白胨 酵母提取物 葡萄糖 :1 9 高压灭菌 "$& = 培养基 '= 蛋白胨 酵母提取物 #.: 9 高压灭菌 "$& 8- 基因的克隆和表达 鞘氨醇杆菌 +3 的培养 菌体接入灭过菌的 *< 培养基 9 恒温振荡培养 基因组 +- 的提取 参照细菌基因组提取试剂盒 天根.:3 基因的 *. 扩增条件 根据. 数据库注册的环己酮单加氧酶基因序列设计引物 以 基因组 +- 为模板扩增环己酮单加氧酶.:3<* 基因 引物如下 *,.-/-/ /*./.-/.-..-///.--..//./19 预变性 (9 变性 (19 退火 ( 9 延伸 "$& 个循环 9 延伸 "$& 然后加 /#@ 9 延伸 "$& 扩增产物用 琼脂糖凝胶电泳检测 /- 克隆.:3 基因的纯化参照 *"'# 琼脂糖凝胶 +- 回收试剂盒相关操作 纯化后.:3 基因构建至!3/!#(% 连接产物转化 +: 感受态细胞 蓝白斑筛选阳性克隆 阳性克隆参照 *"'# 质粒小提试剂盒提取质粒 *. 验证 南京金斯瑞公司测序 表达载体构建 双酶切测序正确的!3/ 分离回收后的目的基因构建至!/1#A 获得!/1#A 表达载体 将此表达载体转化 =+! 感受态细胞 卡那霉素抗性筛选阳性克隆 获得目的基因工程菌 目的蛋白表达 诱导条件优化 将工程菌接于 "== 含 '"=4#& 中 9"$& 振荡培养过夜然后将菌液按 E 比例转接于装有 "== 培养基 含 '"=4#& 三角瓶中 继续进行菌体培养 当 + &" 到 1 时 加入 ""=*/1 9" 振荡培养 1 离心收菌 +*-! 浓缩胶 分离胶 分析目标产物表达情况 进一步表达条件优化以 + &" 约为 1 时 不同温度 不同摇床转速 "$&"$&"$&"$& 及向培养物中加入不同终浓度的 */ 进行诱导培养 通过 +*-! 分析考察诱导培养条件对目的基因表达的影响 )8- 的酶学性质及同源建模.:3 蛋白纯化及酶活力 采用 $ A 柱亲和层析一步法纯化蛋白.:3 操作步骤参照 $#( /3,#(7,5 试剂盒的使用指南 还原型辅酶 -+*: 在 &" 处有明显吸收 而氧化型 -+* A 无吸收.:3 在氧化硫化物生成光学亚砜的过程中会消耗 -+*: 生成 -+* A 引起吸光值降低 酶活力测定体系为 /$(:. "3:111"=-+*:" 茴香硫醚 " 蛋白 "' 酶活力单位定义为 在室

3 第 期 翟晓红 等 环己酮单加氧酶的克隆表达及酶学性质分析 温 9 下 每分钟消耗 "-+*: 的酶量定义为 个酶活力单位 >.:3 辅酶依赖性 分光光度法检测相同条件下.:3 以 -+: 和 -+*: 分别作辅酶时的活性 判断辅酶依赖型 温度和 : 对.:3 酶活力的影响 测定不同温度 9 9 下酶催化氧化茴香硫醚的活力以确定最适温度 采用 "3 /$(:.:11 和 "3 甘氨酸 #::11 检测不同 : 值 对硫氧化酶氧化茴香硫醚活力的影响 确定最适 : 每组设 组平行实验.:3 的底物特异性 测定纯化后的.:3 对 种不同底物 见表 的反应活性 确定.:3 的底物广谱性 三维结构分析及蛋白的同源建模 搜索瑞士生物信息研究所 5$((&(7$778$$&8"#7$( 提供的 5$(( 3$&' 建模服务 器 通过提交的序列信息在蛋白质结构库中搜寻模板 在 5$((2$5 中通过人工方法对局部结构进 行调整 采用蛋白质三维图像软件 5$((*2$5 打开并分析作图 表 8- 的底物特异性 ++'"&.&%%"&"$#$%#8- 硫醚类 底物名称 相对活性 酮类 相对活性 芳香族 茴香硫醚 环己酮 硫醚 苯乙烯基硫醚 环丁酮 苯乙硫醚 辛酮 甲氧基茴香硫醚 双环 庚 烯 酮 1 苯基腈乙基硫醚 甲氧基茴香硫醚 甲基 甲硫基苯 1 硫醚衍 氯乙基苯基硫醚 1 生物 氟苯甲硫醚 链式硫醚 烯丙基甲基硫醚 叔丁基甲基硫醚 双甲硫基甲烷 甲基硫环己酯 1 二噻烷 其他硫醚 二硫代坊 二甲硫基噻唑 结果与分析 8- 基因的克隆以抽提的 +3 基因组为模板 利用引物 *, 和 * 进行 *. 扩增出环己酮单加氧酶编码基因 经测序该基因长为 2 见图 编码 个氨基酸 理论计算分子量为 ;+# 表达载体,+171 的构建获得环己酮单加氧酶基因后 将其连接到!3/!#(% 上 得到!3/ 重组质粒送去测序 将测序正确的环己酮单加氧酶基因连接到!/1#A 和 ) 双酶切 上 得到!/1#A 重组质粒 以上述两个限制性内切酶双酶切重组质粒 得到大小为 ;2 左右的片段 见图 证明环己酮单加氧酶基因已插入到!/1#A 载体中 成功构建了!/1#A 表达载体 将重组质粒!/1#A 转入到 =+! 感受态细胞 得到重组菌

4 杭州师范大学学报 自然科学版 年 图 4 产物.$%! #4 图,+11 双酶切结果 & "&%" #4 "! 9' 3"#; 诱导后全菌液 破碎后上清 $ 柱纯化后蛋白图 ) 表达产物及纯化后 16, 电泳检测结果 )16,!&&#%'"&."%"!& ) 重组 8- 的表达与纯化!.#" "!:" 通过 */ 浓度 温度 摇床转速等产酶因素优化 得到最佳培养条件为 9 培养至 + 为 1 时 添加 ""=*/9" 诱导 对重组菌进行超声波破碎并离心分离 $ 柱纯 化 重组酶纯化后的比活力为 >"' 为纯化前的 倍 蛋白大部分出现在上清液中 表明经过 表达条件优化该重组酶在水溶液中具有较好的溶解度 重组蛋白大小在 4+# 左右 符合预期 利用重组质粒携带的组氨酸标签 表达的重组酶经 $ A 亲和色谱纯化后 +*-! 检测 显示为单 一条带 图 实现了重组蛋白的一步纯化 0 酶学性质检测结果.:3 辅酶依赖性用 -+*: 作辅因子测定.:3 的比活力为 >"' 是用 -+: 作辅因子时的 倍左右 所 以.:3 更倾向于用 -+*: 作辅因子 温度和 : 对.:3 酶活力的影响测定不同温度下重组.:3 的酶反应初速度 研究温度对酶活力的影响 结果如图 # 所示 当氧化茴香硫醚 *3 时 酶活力在 9 达到最大值 然后随着温度的升高而降低 高温对重组酶的活力影响很明显 9 时相对酶活力仅有 图 0 温度对 8- 催化活性的影响 0,#"$%#%""%."!$%%#8- 图 08 对 8- 催化活性的影响 0,#"$%#8!$%%#8-

5 第 期 翟晓红 等 环己酮单加氧酶的克隆表达及酶学性质分析 在最适温度下 采用不同 : 值的缓冲体系 分别测定酶反应初速度 确定重组.:3 的最适 : 值 当以 *3 为底物时 : 值为 11 时酶活力最大 : 适应范围较窄 图 2.:3 的底物特异性选 *3 作为标准底物 活力为 >"' 测定其他 种底物的相对活性 表 由表中数据可知.:3 几乎对所有的芳香族硫醚及其衍生物都具有较高的活性 但是对直链的硫醚活性普遍较低 对甲基硫环己酯和 二噻烷的活性也很高 可以考虑作为催化合成各种手性亚砜的催化剂 ( 同源建模 #(7 分析表明.:3 的基因与醋酸钙不动杆菌的环己酮单加氧酶 &#&; -(($& --1 具有同源性 氨基酸相似性为 预测该片段的氨基酸序列 并进行氨基酸同源性对比时发现该片段与单加氧酶家族诸多成员具有较高的同源性 并且包含两个 ))) 序列 可成为,-+ 和 3 的非共价结合位点 和一个 3 家族的特征性指纹,<)))):))) 1 第一个氨基酸发生了变异但是仍然同属于芳香族氨基酸 仍然可以判定.:3 为 3 家族 通过 3+!= 同源建模服务器对其进行 + 结构模拟分析 发现该酶具有经典的 3 三维结构和,-+ 的结合域 图 讨 论 图 ( 重组环己酮单加氧酶的 ) 结构模拟 (%.$%."!#"$!!%8-# 鞘氨醇杆菌中含有 1 个 3 编码基因 是筛选和研究 3 的一个良好酶源 通过基因克隆在大肠杆菌中实现高效表达 并利用 :$(7#' 作为纯化标签纯化重组酶 是一个较为高效的研究 3 的 策略 但是外源表达时重组蛋白常以包涵体形式存在 根据文献外源基因以包涵体形式表达是因为外源基因在大肠杆菌中表达过快 没有得到正确折叠 其能否以可溶形式表达不仅取决于基因 载体和宿主三者之间的相互关系 而且受到诱导物的浓度 诱导温度等条件的影响 本文中通过优化.:3 的诱导表达条件在低温 9 诱导下获得了.:3 的可溶性高效外源表达 本实验中 将携带.:3 基因的重组质粒!/1# 转入 =+! 后 获得了 ;+# 左右的表达产物 与预期相符 使用 $ 柱纯化后测定其最适反应温度为 9 与热稳定的 *-3 相似 与其他 3 不同的是.:3 对酮类底物活性普遍偏低对硫化物的活性较高 尤其是以 氯乙基苯基硫醚为底物时活力最高 >"' 重组.:3 作为一种新型的生物催化剂 推测其主要与硫化物的代谢有关 随着手性化学合成中手性砌块需求的不断增加 环境友好 能耗低 排放少 的手性生物合成技术中 的生物催化剂 酶的研究开发显得越来越重要 一方面是寻找新的酶种 另一方面对已有酶进行分子改造 提高其性能 通过实验测定了.:3 的一些酶学基本性质 为进一步探索.:3 的热稳定性 离子浓度和有机试剂对酶活性的影响及对酶的对映体选择性的影响以及结构改造等打下基础 相关研究

6 杭州师范大学学报 自然科学版 年 工作正在进行中 参考文献?#"2$#&$,*#(7#*##>(8$(#7%#&&"&%'&#(8""2$&#&7#(#2$#7# %(78#%$$'#&(8$$#7$&($7&'%#&$&'$&$&'11 李华 邵宗泽 一株太平洋深海环己酮降解菌的筛选与功能研究 微生物学报 111 -#&'"7 -$#7$&(8#%$$'"&%'&#(($&'#&$(%&7($(.&7'#&$."$(7% 1 姜标 黄浩 罗军 等 硫化物的生物氧化成手性亚砜 有机化学 *#"$&+!/,##$ 3 +$(%($'&#&#$#7$&(8#%$$'"&%'&#((3/7#&(/ 3#7(#.&<.* *#(. /.%#&& 3&%'&#(&.&$&'#&@&+7"$&#7$& &#8#7$'%1111 4$(&-&(>/#%$$'3&%'&#(($&'#&$%&7($(3"#&%&$%&(& 1,##$3 4#"2; 3;:#&&7$8$#7$&8##%$$'"&%'&#((@&"7$8,! =71 3$#-<#&#$&#&'##.%(7#77(8.%#&&3&%'&#(#."+"#$&3 "&7(#&#$$&'.8#7-"."11111 $&3-"%#4*2$$#7$&#&8$&'82#7$#$&($&2%7$&($($ $&',##$3 $&:7(+*:3+$(%8#7"(7#2#%$$'"&%'&#(2%'&""$&$&'- 3$2$$7& :#&: =$7#&(8"#7$&8'#&$(8$(#7*11 刘庆彬 酶催化工艺用于制药工业的研究进展 化工进展 吕彤 刘扬 赵青 等 烯酮还原酶基因的克隆与优化表达 应用与环境生物学报 1 #&$&'@$&'?#=$(#&.&?&"$&'&7#$#7$&(82$#7#%($($&$&''&"$(7%8"$# (%&7($(#77$&(7$#(#&." 卢小春 赖敦岳 裴曾飞 等 苯乙醇的酶法拆分工艺优化 杭州师范大学学报 自然科学版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