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缨肴祁
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1 第３８卷第６期２０１４年１１月南京林业大学学报自然科学版Ｖｏｌ３８Ｎｏ６ＪｏｕｒｎａｌｏｆＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓＥｄｉｔｉｏｎＮｏｖ２０１４ｄｏｉ１０３９６９ｊｉｓｓｎ１０００２００６２０１４０６０２０痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的克隆表达及酶学性质研究李迅顾华祥王飞南京林业大学化学工程学院江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室江苏南京２１００３７摘要为了研究使用生物酶法制备共轭亚油酸的可行性笔者对痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶进行了异源表达和理化性质研究根据大肠杆菌偏好密码子优化了来源于痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶ＰＡＩ的基因ｐａｉ将克隆的基因在ＢＬ２１ＤＥ３中进行表达纯化目的蛋白获得重组ＰＡＩ蛋白ＳＤＳＰＡＧＥ结果显示重组ＰＡＩ分子质量为４８ｋｕ重组蛋白主要以包涵体沉淀的形式存在经测定重组ＰＡＩ在３５ｐｈ７０时酶活最高比酶活为７５２３ μｍｏｌｍｉｎｍｇ经３５保温２ｈ酶活保持９０以上ｐｈ为６５７０时ＰＡＩ具有较好的稳定性Ｍｎ２和Ｚｎ２对酶活力分别有２２４和１５８的抑制作用以亚油酸为底物时该酶的Ｋｍ值为１１３ｍｍｏｌＬｋｃａｔ为４６７ｓ１相关分析表明痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶性质优良适合以亚油酸为底物生物催化制备共轭亚油酸关键词痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶共轭亚油酸酶学性质中图分类号Ｑ７８６文献标志码Ａ文章编号１０００２００６２０１４０６０１０５０５ＣｌｏｎｉｎｇｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄｉｓｏｍｅｒａｓｅｆｒｏｍＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓＬＩＸｕｎＧＵＨｕａｘｉａｎｇＷＡＮＧＦｅｉＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＮａｎｊｉｎｇＦｏｒｅｓｔｒｙＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＪｉａｎｇｓｕＫｅｙＬａｂｏｆＢｉｏｍａｓｓＢａｓｅｄＧｒｅｅｎＦｕｅｌｓａｎｄＣｈｅｍｉｃａｌｓＮａｎｊｉｎｇ２１００３７ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔＩｎｏｒｄｅｒｔｏｓｔｕｄｙｏｎｔｈｅｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙｆｏｒｔｈｅｅｎｚｙｍａｔｉｃｓｙｎｔｈｅｓｉｓｏｆｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄＣＬＡｔｈｅｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄＬＡｉｓｏｍｅｒａｓｅｆｒｏｍＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓｗａｓｃｌｏｎｅｄａｎｄｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄＴｈｅＬＡｉｓｏｍｅｒａｓｅｇｅｎｅｐａｉｆｒｏｍＰａｃｎｅｓｗａｓｉｍｐｒｏｖｅｄｂｙｕｓｉｎｇｃｏｄｏｎｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎａｓＥｃｏｌｉｃｏｄｏｎｕｓａｇｅＴｈｅＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｅｎｃｏｄｉｎｇｍｏｄｉｆｉｅｄＬＡｉｓｏｍｅｒａｓｅｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｐｅｔ２０ｂｙｉｅｌｄｉｎｇｐｅｔ２０ｂｐａｉａｎｄｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄｉｎｔｏＥｃｏｌｉＢＬ２１ＤＥ３ＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＬＡｉｓｏｍｅｒａｓｅｈａｄａｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｓｓｏｆ４８ｋｕｓｈｏｗｉｎｇｍａｉｎｌｙｉｎｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｙｏｎＳＤＳＰＡＧＥＴｈｅｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＮｉＮＴＡａｎｄｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓ７５２３ μｍｏｌｍｉｎｍｇａｆｔｅｒｉｎｄｕｃｔｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＡｔｐｈ７０ａｎｄ３５ｔｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｅｎｚｙｍｅｒｅａｃｈｅｄｔｈｅｍａｘｉｍｕｍＴｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄｅｎｚｙｍｅｗａｓｓｔａｂｌｅｆｒｏｍｐｈ６５ｔｏｐｈ７５ａｎｄｒｅｔａｉｎｅｄａｐｐｒｏｘ９０ｏｆｉｔｓａｃｔｉｖｉｔｙａｆｔｅｒ２ｈａｔ３５ＡｌｏｗｌｅｖｅｌｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＬＡｉｓｏｍｅｒａｓｅ２２４ａｎｄ１５８ｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｗｉｔｈＭｎ２ａｎｄＺｎ２１ｍｍｏｌＬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙＴｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＬＡｉｓｏｍｅｒａｓｅｈａｄａＫｍｏｆ１１３ｍｍｏｌＬａｎｄｋｃａｔｏｆ４６７ｓ１ｆｏｒｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅＰａｃｎｅｓｌｉｎｏｌｅａｔｅｉｓｏｍｅｒａｓｅｃａｎｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙｃａｔａｌｙｚｅＬＡｔｏｔｒａｎｓ１０ｃｉｓ１２ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄｔ１０ｃ１２ＣＬＡＫｅｙｗｏｒｄｓＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｃｎｅｓｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄｉｓｏｍｅｒａｓｅｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄｅｎｚｙｍａｔｉｃｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ共轭亚油酸ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄＣＬＡ是ｃｉｓ１２ＣＬＡ被认为是主要的生物活性单体具有轭双键的十八碳二烯酸ｏｃｔａｄｅｃａｄｉｅｎｏｉｃａｃｉｄ异构体的总称其中ｃｉｓ９ｔｒａｎｓ１１ＣＬＡ和ｔｒａｎｓ１０脂减肥促进生长等作用在医药食品保健品和由亚油酸ｌｉｎｏｌｅｉｃａｃｉｄＬＡ衍生的一系列含有共收稿日期２０１４０３１７多种生理活性如抗癌症抗动脉粥样硬化降血化妆品等行业中具有广阔的应用前景１３修回日期２０１４０８２８基金项目国家林业公益性行业科研重大项目２０１００４００１国家自然科学基金面上项目３１２７０６１２３１１７０５３７江苏省高校自然科学研究重大项目１１ＫＪＡ４８０００１江苏高校优势学科建设工程资助项目ＰＡＰＤ第一作者李迅副教授博士通信作者王飞教授Ｅｍａｉｌｈｇｗｆｎｊｆｕｅｄｕｃｎ引文格式李迅顾华祥王飞痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的克隆表达及酶学性质研究Ｊ南京林业大学学报自然科学版２０１４３８６１０５１０９

2 106 南京林业大学学报 ( 自然科学版 ) 第 38 卷天然 CLA 主要存在于反刍动物如牛羊的乳脂以及肉制品中 [4], 只从动物中获得 CLA 并不能满足人类的需求, 因此有必要扩展 CLA 的来源途径 [5] 化学合成方法制得的产物往往包含一些活性功能尚不明确的异构体, 而亚油酸异构酶可特异性地催化 LA 转化为活性 CLA 异构体, 并且反应条件温和 [6], 而通过基因工程获得亚油酸异构酶是一 [7] 种快速获得 CLA 的方法张艳禾等将来源于 Lactobacillus reuteri PYR8 的亚油酸异构酶基因克隆至大肠杆菌中表达, 并对形成的包涵体作了 Ni 2+ - NTA 柱上复性研究, 由此获得有活性的重组酶 ; [8] Zhang 等则将痤疮丙酸杆菌 (Propionibacterium ac nes) 的亚油酸异构酶 ( PAI) 基因克隆至解脂耶氏酵母中, 对油脂成分提取分析发现其共轭亚油酸含量占总油脂含量的 6%, 较原始菌株有所提高 [9] Cody 等对亚油酸异构酶催化所得的共轭亚油酸进行生物活性分析, 通过肿瘤细胞实验发现其存在 [10] 潜在的抗肿瘤活性 ;Peng 等成功从 Clostridium sporogenes 的膜结合蛋白中分离纯化亚油酸异构酶, 并对其酶学性质作了深入的研究笔者按照大肠杆菌的优势密码子, 优化了痤疮丙酸杆菌 pai 基因, 将其转至大肠杆菌中进行诱导表达, 对得到的可溶性重组 PAI 进行纯化和酶学性质研究, 研究结果将为后期工业化生产 CLA 奠定基础 1 材料与方法 1.1 试验材料大肠杆菌 (Escherichia coli)bl21(de3) 和质粒 pet- 20b 购自 Novagen ( Darmstadt, Germany) 公司胰蛋白胨酵母提取物购于 Oxoid(Hampshire, England) 公司 ;T4 - DNA 连接酶, ExTaq 聚合酶 Primer Star HS 聚合酶各种限制性酶和 DNA Marker 购于 Takara( 大连 ) 公司 ; 常用生物试剂 Tris -HCl 氨苄青霉素和显色剂 GoldenView 等购自南京天为公司, 常用化学试剂均为分析纯 Gel / PCR Extraction Kit 质粒小量提取试剂购自 BIOMIGA ( 上海, 中国 ) 公司引物由上海生工生物工程有限公司合成, 测序和全基因合成由上海捷瑞生物工程有限公司完成亚油酸甲酯化产物共轭亚油酸甲酯化标准品及底物亚油酸均购自 Sigma 公司, 其他试剂均为国产分析纯 LLB 培养基 (10 g / L 胰蛋白胨 5 g / L 酵母提取物 5 g / L NaCl) SOC 培养基等参考文献 [11]; 亚油酸乳化液为 60 g / L 的亚油酸,72 g / L Tween80, 加水至 10 ml 于冰水浴下进行超声波乳化分散 1.2 目的基因的设计与合成根据密码子使用频率数据库信息 ( Codon Usage Database ) 将编码亚油酸共轭酶基因 (Genbank No. AX062088) 按大肠杆菌偏好密码子优化 [12] 在不改变氨基酸序列的前提下, 采用 JCat 密码子优化软件选择最优密码子, 同时参考 mrna 的二级结构进行微调使之活化能尽可能高, 使 mrna 更易于表达密码子优化后的 pai 基因经全合成后连接至克隆载体 pgh 中, 得到重组质粒 pgh-pai 1.3 重组 PAI 的克隆及表达根据密码子优化的亚油酸共轭酶基因序列设计引物 : 上游引物 P1 为 cgccatatgtctatctccaaaga cagccg, 斜体部分是 Nde I 酶切位点 ; 下游引物 P2 为 ccgctcgagaacgaagaagcgggtaacc, 斜体部分是 Xhol I 酶切位点以 pgh-pai 为模板,PCR 扩增亚油酸异构酶基因片段, 经 Nde I Xhol I 双酶切后, 与同样双酶切的质粒 pet-20b 连接, 转化至大肠杆菌中挑选单菌落, 进行双酶切和测序鉴定 [11] 将获得的阳性重组质粒 pet-20b-pai 转入大肠杆菌 BL21(DE3), 经 IPTG 诱导表达 1.4 重组 PAI 的分离纯化收集诱导表达的菌体, 破碎细胞, 收集上清, 通过亲和 Ni 2+ 柱 (Novagen, USA) 进行纯化, 用不同浓度的咪唑缓冲液进行梯度洗脱, 收集组分用 0.1 mol / L 磷酸氢二钠 - 柠檬酸缓冲液 ( ph = 7. 0) 对 PAI 酶液透析过夜, 酶液于 4 保存以备后用采用分离胶浓度为 12%SDS-PAGE 分析重组蛋白的表达及纯化效果 1.5 重组 PAI 的酶活测定在 1.65 cm cm 螺帽试管中, 依次加入 4 75 ml 0 1 mol / L Na 2 HPO 4 - 柠檬酸缓冲液 ( ph 7 0) 0 2 ml 重组 PAI 酶液 50 ml 亚油酸乳化液 r / min 振荡反应 1 h 后, 从中取 200 ml 加入 30 ml 10% 三氯乙酸终止反应, 再加入 1 ml 正己烷振荡萃取 10 min, 离心去除乳化层, 取上层正己烷部分, 经适当稀释后测定 234 nm 处的吸光值 [13], 由测得的吸光值根据 CLA 标准曲线确定生成 CLA 的量定义每分钟生成 1 mg 的 CLA 所需酶量为 1 个酶活单位采用 Brandford 法 [14], 以牛血清蛋白作为标准蛋白, 测定蛋白浓度 2 结果与分析 2.1 pai 基因的密码子优化由于各种微生物的密码子偏好性不同, 为了使

第 6 期李迅, 等 : 痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的克隆表达及酶学性质研究 107 pai 在大肠杆菌中更高效地表达, 对 pai 的基因进行了密码子优化 GC 含量从原始序列的 60. 3% 降到了 51.7%, 更接近大肠杆菌自身的 GC 含量, 同时密码子适应指数 CAI 值从优化前的 0 69 提升到了 0.86 优化结果显示 pai 基因经密码子优化后更适宜在大肠杆菌中进行表达 2.

pai 基因的 PCR 克隆产物 ; 2. pet-20b- pai 被 Nde I 和 Xhol I 的酶切结果图 1 重组质粒 pgh-pai 酶切验证的琼脂糖凝胶电泳图 Fig.1 Analysis by agarose gel electrophoresis of digestion of pgh pai 2.

3 第 6 期李迅, 等 : 痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的克隆表达及酶学性质研究 107 pai 在大肠杆菌中更高效地表达, 对 pai 的基因进行了密码子优化 GC 含量从原始序列的 60. 3% 降到了 51.7%, 更接近大肠杆菌自身的 GC 含量, 同时密码子适应指数 CAI 值从优化前的 0 69 提升到了 0.86 优化结果显示 pai 基因经密码子优化后更适宜在大肠杆菌中进行表达 2.2 重组载体的构建以克隆载体 pgh-pai 为模板,PCR 扩增得到亚油酸异构酶 PAI 成熟肽编码序列, 琼脂糖凝胶电泳显示其大小为 bp 左右 ( 图 1), 与其真实长度 bp 大小相符重组质粒 pet-20b-pai 经双酶切 (Nde I 和 Xhol I) 鉴定 ( 图 1) 及测序验证正确 M. DNA marker; 1. pai 基因的 PCR 克隆产物 ; 2. pet-20b- pai 被 Nde I 和 Xhol I 的酶切结果图 1 重组质粒 pgh-pai 酶切验证的琼脂糖凝胶电泳图 Fig.1 Analysis by agarose gel electrophoresis of digestion of pgh pai 2.3 重组蛋白的低温诱导及纯化将 25 诱导培养所得的重组菌菌体经超声波破碎, 按照 1.4 节的方法利用镍柱对重组 PAI 进行纯化, 结果见图 2 由图 2 可知,400 mmol / L 咪唑洗脱样在 SDS -PAGE 凝胶电泳上显示为单一条带, 分子质量约为 48 ku, 与目的蛋白 PAI 大小相符, 纯化的 PAI 比酶活为 μmol / ( min mg) 对比泳道 1 和 2 可以看出,pai 虽成功表达, 但只有少量的可溶重组蛋白存在于上清中 ( 泳道 2), 多数的重组蛋白则以无活性的包涵体形式存在于沉淀中 ( 泳道 1) M. 标准蛋白质分子质量 ;1. 破碎细胞的沉淀物 ; 2. 破碎细胞的上清液 ; mmol / L 咪唑缓冲液液 ; mmol / L 咪唑缓冲液 ; mmol / L 咪唑缓冲液 ; mmol / L 咪唑缓冲液图 2 重组 PAI 蛋白的 SDS-PAGE 分析 Fig.2 SDS-PAGE analyses of recombinant protein PAI 2.4 酶学性质测定最适反应温度和温度稳定性分别在和 50 下测定重组 PAI 酶活 [15], 结果如图 3a 所示, 重组 PAI 在 35 时酶活达到最大, 随着温度的升高, 酶活呈现明显的下降趋势, 到 50 时, 酶活力仅为最高酶活的 35% 左右将适当浓度酶液分别置于和 50 下保温 min, 保温后于 ph = 7.0,35 下测定酶活, 结果如图 3b 所示, 在 35 下重组 PAI 保持较高的温度稳定性, 保温 120 min 后, 该酶的活力依旧能保持 90% 以上在 45 保温 60 min 后残余 52.5% 的酶活由此可看出, 在 45 以下, 该酶能保持着较好的稳定性 Fig.3 图 3 重组 PAI 的最适温度和温度稳定性 The optimum temperature and temperature stability of recombinant PAI 最适 ph 和 ph 稳定性 35 下, 将等量酶液分别于 ph 为的 Na 2 HPO 4 - 柠檬酸缓冲液中测定 PAI 酶活, 结果如图 4a 所示由图可见, 重组 PAI 在 ph 为 7 0 时酶活力最高, 且在 ph 为 6 0 ~ 7 5 的范围内, 相对酶活都能维持在 80% 以上取适当量酶液分别置于上述不同 ph 的缓冲液中保温 1 h, 将保温后的酶液都在 ph 条件下测定酶活, 结果如图 4b 所示由图 4b 可知, 在 ph 为 5 5 ~ 7 5 的环境中重组 PAI

4 108 南京林业大学学报 ( 自然科学版 ) 第 38 卷较为稳定, 能保持 60% 以上的酶活力, 而在过酸过碱条件下, 酶活丧失则较为明显 Fig.4 图 4 重组 PAI 的最适 ph 和 ph 稳定性 The optimum ph and ph stability of recombinant PAI 金属离子对酶活性的影响将 1 mmol / L 的 Cu 2+ Co 2+ Mn 2+ Ba 2+ Zn 2+ Ni 2+ Mg 2+ Ca 2+ Al 3+, 以及 % SDS 0. 25% Tween 20 和 5 mmol / L EDTA 分别加入酶液中, 在 35 保温 1 h 后, 加入底物亚油酸, 于 ph 测定酶活, 结果发现只有 Mn 2+ 和 Zn 2+ 对该酶分别有 22 4% 和 15 8% 的抑制作用, 其他金属离子及化学试剂对重组 PAI 无明显促进或抑制作用 ( 表 1) 表 1 Table 1 金属离子和化学试剂对酶活性的影响 Effects of cations and chemical reagents on activity of recombinant PAI 金属离子及化学试剂 metal cation and chemical reagents 相对酶活 / % relative enzyme activity 空白对照 100 Cu Co Mn Ba Zn Ni Mg Ca Al SDS 94.5 Tween EDTA 重组 PAI 酶的动力学参数在含有适当酶量的反应体系中分别加入终浓度为 ~ mmol / L 的亚油酸, 于 ph 下反应 1 h, 测定重组 PAI 酶活, 以 Lineweaver- Burk 法作图, 求得该重组酶的米氏常数 K m 为 1.13 mmol / L, 催化常数 k cat 为 s -1 [16] Hornung 等测定相同菌种来源的重组亚油酸异构酶以 LA 为底物时的 K m 为 1.4 mmol / L, 这与此次研究结果相 [17] 近而 Deng 等通过从原始菌 Propionibacterium acnesstrain ATCC 6919 分离纯化得到原始 PAI, 测定其对 LA 的 K m 为 17.2 μmol / L, 可能由于大肠杆菌异源表达缺少了对 PAI 正确的修饰加工, 使其 [10] 生物活性有所降低另外, Peng 等和 Park [18] 等研究表明, Clostridium sporogenes 和 Butyrivibrio fibrosolvens 的亚油酸异构酶以 LA 为底物时的 K m 分别为 11.9 μmol / L 和 9.7 μmol / L 由此可见, 此次所得重组 PAI 与 LA 的亲和力相对较低, 可对其进行定向研究改进其性能 3 结论 1) 通过对 pai 基因进行密码子优化,pai 基因的 GC 含量从 60.3% 降到了 51.7%, 密码子适应指数 (CAI) 从优化前的 0.69 提升到了 0.86, 更加适宜在大肠杆菌中表达重组 PAI 分子量为 48 ku, 在大肠杆菌中表达主要以无活性的包涵体形式存在沉淀中, 只有少量重组蛋白以可溶形式存在, 通过镍柱纯化获得少量电泳纯化的重组 PAI, 比酶活为 μmol / (min mg) 2) 纯化的重组 PAI 最适反应温度为 35, 最适 ph 为 7.0, 且在 45 以下和 ph 5.5 ~ 7.5 条件下具有较好的稳定性 Mn 2+ 和 Zn 2+ 对酶活力有一定的抑制作用该酶的动力学常数 K m 和 k cat 分别为 1.13 mmol / L 和 4.67 s -1 结果显示重组 PAI 性质优良, 适合以亚油酸为底物生物催化制备共轭亚油酸参考文献 (References): [ 1 ] 张艳禾, 张兰威. Lactobacillus reuteri PYR8 亚油酸异构酶基因在大肠杆菌中的表达与活性检测 [ J]. 农业生物技术学报, 2007,15(1): Zhang Y H, Zhang L W. Expression of linoleate isomerase gene from Lactobacillus reurei PYR8 in Escherichia coli and assay of its bioactivity [ J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2007, 15 (1):

5 第 6 期李迅, 等 : 痤疮丙酸杆菌亚油酸异构酶的克隆表达及酶学性质研究 109 [ 2 ] 曹健, 魏明, 曾实, 等. 一株嗜酸乳杆菌突变株亚油酸异构酶的纯化及性质 [J]. 食品与发酵工业,2004,30(2): Cao J, Wei M, Zeng S, et al.purification and characterization of linoleate isomerase from Lactobacillus acidophilus [ J]. Food and Fermentation Industries, 2004, 30(2): [ 3 ] 王中太, 曹健, 尹艳丽, 等. 共轭亚油酸的生物合成及相关酶基因的克隆与表达 [ J]. 化学与生物工程,2008,25( 4):7-11. Wang Z T, Cao J, Yin Y L, et al.biosynthesis of conjugated lino leic acid and cloning and expression of gene of related enzyme [J]. Chemistry & Bioengineering, 2008, 25(4): [ 4 ] Ha Y L, Crimm N K, Priza M W, et al. Newly recognized anti carcnogenic fatty acid: identification and qualification in nature and processed cheeses [ J ]. Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1998, 37: [ 5 ] Lasa A, Simón E, Churruca I, et al. Effects of trans 10,cis 12 CLA on liver size and fatty acid oxidation under energy restriction conditions in hamsters [ J]. Nutrition, 2010(1):3-10. [ 6 ] Jun Ogawa, Matsumura K, Kishino S. et al. Conjugated linoleic acid accumulation via 10 hydroxy 12 octadecaenoic acid during microaerobic transformation of linoleic acid by lactobacillus aci dophilus [ J]. Applied and Enviromental Microbiology, 2001, 67: [ 7 ] 张艳禾, 张兰威, 胡森, 等. Lactobacillus reuteri PYR8 亚油酸异构酶基因在毕赤酵母中的表达 [ J]. 浙江大学学报 : 农业与生命科学版,2006,32(5): Zhang Y H, Zhang L W, Hu S, et al. Expression of linoleate isomerase gene from Lactobacillus reuteri PYR8 in Pichia pastoris [ J]. Journal of Zhejiang University:Agriculture & Life Science, 2006, 32(5): [ 8 ] Zhang B X, Rong C C, Chen H Q, et al. De novo synthesis of trans 10, cis 12 conjugated linoleic acid in oleaginous yeast Yar rowia lipolytica [ J]. Microbial Cell Factories, 2012, 11:51. [ 9 ] Cody E R, Johnson M C, Fitzgerald G F. Heterologous expression of linoleic acid isomerase from Propionibacterium acnes and anti proliferative activity of recombinant trans-10, cis-12 conjugated linoleic acid [ J]. Microbiology, 2007, 153: [ 10] Peng S S, Deng M D, Grund A D, et al. Purification and charac terization of a membrane bound linoleic acid isomerase from Clos tridium sporogenes [ J ]. Enzyme and Microbial Technology, 2007, 40: [11] Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T. Molecular Cloning: A La boratory Manual [M] 3 rd ed. New York: Cold Spring Harbor La boratory Press, [12] Nakamura Y, Gojobori T, Ikemura T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000 [J]. Nucleic Acid Research, 2000, 28(1):292. [13] Barrett E, Ross R P, Fitzgerald G F, et al. Rapid screening method for analyzing the conjugated linoleic acid production capa bilities of bacterial cultures [ J]. Applied and Environmental Mi crobiology, 2007, 73(7): [14] Bradford M M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein dye binding [ J]. Analytical Biochemistry, 1976, 72(1): [15] 张冰, 向冰冰, 崔岱宗, 等. 枯草芽孢杆菌 WD-23 β- 甘露聚糖酶的纯化及其酶学性质 [ J]. 南京林业大学学报 : 自然科学版,2014,38(3): Zhang B, Xiang B B, Cui D Z, et al. Investigation on the purifi cation methods of b mannase from Bacillus subtilis WD - 23 and studies on enzymatic properties [ J]. Journal of Nanjing Forestry University:Natural Sciences Edition, 2014, 38(3): [16] Hornung E, Krueger C, Pernstich C, et al. Production of (10E, 12Z) conjugated linoleic acid in yeast and tobacco seeds [ J]. Biochimica et Biophysica Acta, 2005, 1738(1-3): [17] Deng M D, Grund A D, Schneider K J, et al. Linoleic acid isomerase from Propionibacterium acnes: purification, character ization, molecular cloning, and heterologous expression [ J]. Ap plied Biochemistry and Biotechnology, 2007, 143(3): [18] Park S J, Park K A, Park C W, et al. Purification and amino acid sequence of the linoleate isomerase produced from Butyrivibrio fibrisolvens A - 38 [ J]. Food Science & Nutrition 1996, 1: ( 责任编辑刘昌来 )

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