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祭或璩
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1 林业工程学报, 2017,2(4):63-69 Journal of Forestry Engineering doi: / j.issn 耐热木聚糖酶基因的克隆表达及其在酶解玉米芯木聚糖中的应用李琦, 陈明真, 赵林果 ( 南京林业大学化学工程学院 ; 江苏省生物质绿色燃料与化学品重点实验室, 南京 ) 摘要 : 为寻求具有耐热性能的木聚糖酶, 笔者以嗜热网球菌 ( Dictyoglomus thermophilum) DSM3960 的基因组为模板, 克隆得到木聚糖酶基因 xynb DT, 该基因全长 bp, 共编码 361 个氨基酸, 蛋白的理论分子量约为 40 ku 通过 NCBI 数据库比对发现该基因编码的蛋白质属于糖苷水解酶 G11 家族实现大肠杆菌异源表达重组木聚糖酶 XynB DT, 通过 IPTG 诱导, 酶活达到 30.6 U / ml 该重组木聚糖酶的最适温度为 85, 在 60 ~ 80 范围内均有较好温度稳定性, 在 60 条件下保温 2 h, 酶活维持在 90% 以上, 在 90 下保温 2 h, 酶活尚残余约 50%; 最适 ph 为 6 5, 在 ph 为 5 0~ 7 5 范围内保温 24 h 仍可保留约 90% 剩余酶活力该酶以 Beechwood 木聚糖为底物, 米氏常数 (K m ) 和最大反应速率 (V max ) 值分别为 5 63 mg / ml 和 mmol / ( L min -1 ) 以玉米芯木聚糖为底物, 研究 XynB DT 水解玉米芯木聚糖的条件及产物, 结果显示在温度 70 ph 6 0 条件下酶解 12 h, 加酶量为 400 U / g, 最终酶解得率为 44 3%, 玉米芯木聚糖的水解产物主要以木二糖和木三糖为主, 表明该木聚糖酶在低聚木糖制备方面具有较大应用潜能关键词 : 嗜热网球菌 ; 木聚糖酶 ; 克隆 ; 水解中图分类号 :Q819 文献标志码 :A 文章编号 : (2017) Cloning and expression of a thermophile GH11 xylanase gene and its application in xylooligosaccharide production LI Qi, CHEN Mingzhen, ZHAO Linguo ( College of Chemical Engineering, Nanjing Forestry University; Jiangsu Key Laboratory of Biomass Based Green Fuels and Chemicals, Nanjing , China) Abstract:The GH11 endo 1, 4 xylanase gene, xynb DT from Dictyoglomus thermophilum DSM3960 was cloned and expressed in Escherichia coli. The full length gene contained bp, which encoded 361 amino acids. The recombi nant plasmid pet 20b xynb DT was reconstructed and expressed in the E.coli BL21 successfully. In addition, the pure protein was obtained by Ni NTA affinity column, and the molecular weight of protein was approximately 40 ku. The activity of recombinant xylanase was 30.6 U / ml in LB medium by IPTG induction. The properties of XynB DT were analyzed and the results showed that the optimum temperature of this recombinant enzyme was 85, and the relative enzyme activity was higher than 90% under 60 in 120 min and more than 50% under 90 in 120 min. Correspond ingly, the optimum ph was 6 5, and it preserved enzyme activity lower than 90% in the range of for ph. The K m and V max for beechwood xylan was 5 63 mg / ml and mmol / ( L min -1 ), respectively. Then, taking the corncobs xylan as the substrate, this study was focused on the hydrolyzing conditions and the hydrolysis products identified by ion chromatography, and the results showed that after 12 h, under 70, ph 6 0 with the enzyme dosage of 400 U / g, the final hydrolysis yield was 44 3%. As the major hydrolytic products, xylobiose and xylotriose were excised from corncob xylan by XynB DT and only a little of amount of xylose was detected during the hydrolysis. All the results made XynB DT be attractive for potential application in xylooligosaccharides production. Keywords:D. thermophilum; xylanase; gene cloning; hydrolysis 木聚糖酶是一类可将木聚糖降解为低聚木糖和木糖的酶的总称, 主要分为内切 β 1,4 木聚糖收稿日期 : 修回日期 : 基金项目 : 江苏省高校自然科学研究重大项目 (13KJA220004); 江苏省 333 高层次人才培养工程专项资助项目 ( BRA ); 江苏省六大人才高峰资助项目 (2014-JY-011); 江苏省优势学科建设工程资助项目 (PAPD) 作者简介 : 李琦, 女, 实验师, 研究方向为微生物发酵及酶工程通信作者 : 赵林果, 男, 教授 E mail:lgzhao@ njfu.edu.cn

2 64 林业工程学报第 2 卷酶外切 β 1,4 木聚糖酶以及 β D 木糖苷酶 [1-3] 内切 β 1,4 木聚糖酶, 以内切方式水解木聚糖主链中的 β 1,4 糖苷键, 生成木二糖和木三糖等寡糖, 是降解木聚糖最主要的酶, 在造纸纸浆工业食品和饲料工业中有广泛应用前景 [4-6] 我国作为农业大国, 全国年粮食总产量达到 6 亿 t, 但大量秸秆玉米芯等农副产物却只能被焚烧, 既造成环境污染又浪费生物资源玉米芯内木聚糖含量高达 35%, 木聚糖经木聚糖酶水解后可获得具有应用价值的低聚木糖低聚木糖作为一种新型功能性食品添加剂, 在提高食物质量方面具有较大潜能 [7] 然而, 在食品加工工业中, 需要利用较高温度以提升底物的溶解性并防止杂菌污染耐高温木聚糖酶具有较大应用价值及广阔市场前景目前, 木聚糖酶已经从细菌真菌植物和各种无脊椎动物中分离, 其中, 微生物来源的木聚糖酶最为广泛 [8], 通常细菌来源的木聚糖酶比真菌来源的木聚糖酶耐热根据酶蛋白催化区的氨基酸同源性以及疏水簇分析, 大多数木聚糖酶属于糖苷水解酶家族 F / 10 和 G / 11 族一般情况下,F / 10 族木聚糖酶分子量大, 热稳定性好, 大部分含有多个结构域, 作用底物广泛, 且水解产物中单糖成分含量较多与 F / 10 族木聚糖酶相比,G / 11 族木聚糖酶同源性在 40% ~ 90% 范围内, 且分子量低, 催化效率高, 最适 ph 为 2 0 ~ 9 0, 最适温度为 35 ~ 80, 热稳定性低以及单一催化结构域等特点, 对木聚糖有较高的特异性 [9-11] 嗜热网球菌 (Dictyo glomus thermophilum) 作为一种极耐热菌, 其分泌的木聚糖酶归属于 G / 11 家族, 通过研究其酶学特性, 能够使其较好应用于半纤维素资源生产食品药品保健品等笔者通过基因克隆方法, 从 D. thermophilum 中获得耐高温的木聚糖酶 XynB DT, 再利用该酶酶解玉米芯木聚糖, 最终利用离子色谱法分析水解后的低聚木糖产物对该类具有应用价值的低聚木糖进行开发和研究, 不仅可充分利用资源, 也能够创造较高经济价值 1 材料与方法 1.1 菌株质粒和培养基表达载体 pet 20b 购于 TaKaRa 公司 ; 目的基因来源菌株 D. thermophilum DSM3960 购于 DSM ( 宿主菌大肠杆菌 (Escherichia coli) Top 10F 和 BL21 由南京林业大学化学工程学院微生物技术研究室保藏 LB 培养基 : 胰蛋白胨 1 g, 酵母提取物 0.5 g, NaCl 1 g( ph 控制在中性 ), 加入 100 ml 蒸馏水, 121 灭菌 20 min, 培养基温度降至 60 时加入相应抗生素 1.2 主要试剂 dntp Ex Taq DNA 聚合酶 T4 DNA 连接酶 DL5000 DNA Marker 限制性内切酶 EcoRI NotI 等购于 TaKaRa 公司 ; 胰蛋白胨酵母提取物购于 Oxoid 公司 ; 榉木木聚糖 ( Beechwood) 标准品购于 Sigma 公司 ; 凝胶回收试剂盒质粒小提试剂盒氨苄青霉素核酸染料等购自于南京天为公司 ; 引物合成及测序由南京思普金公司完成 1.3 主要仪器上海智城 ZHWY 2102C 摇床, 日本 TOMY SX 500 自动蒸气灭菌锅, 德国 Eppendorf 公司台式高速冷冻离心机 5415R, 德国 Eppendorf 公司梯度 PCR 仪, 美国 Bio rad 公司凝胶成像系统, 美国 Mo lecular Devices 公司全波长酶标仪 SpectraMax 试验方法引物设计根据 NCBI 上公布的 D. thermophilum DSM3960 的 xynb DT 基因序列设计引物如下 : xynb DT f1 ( CCGGAATTCATGTTTCTTAAAAAACT TA ) 和 xynb DT r1 ( TTGCGGCCGCTTACTGTAT CAAC) 下划线部分分别为 EcoRI 和 NotI 酶切位点木聚糖酶基因的克隆将合成的引物用 TE buffer 稀释成 10 μmol / L 工作液, 以 D. thermophilum DSM3960 基因组 DNA 为模板, 用引物对 xynb DT 进行 PCR 扩增 PCR 体系为 :D. thermophilum DSM3960 基因组 DNA 1 0 μl, 上下游引物 (10 μmol / L) 各 2 0 μl,dntp Mix ture 4 0 μl,10 Ex Taq buffer( Mg 2+ free) 5 0 μl, MgCl μl,ex Taq 酶 (5 U / μl)0 5 μl,ddh 2 O 31 5 μl pet 20b xynb DT 表达载体的构建及表达割胶回收基因片段 xynb DT, 用限制性内切酶 EcoRI 和 NotI 分别对目的基因片段和大肠杆菌表达载体 pet 20b 进行双酶切后连接, 构建表达载体 pet 20b xynb DT 将表达载体转化到大肠杆菌 E. coli Top 10F 和 E. coli BL21 感受态细胞中, 将重组菌接入到含有氨苄青霉素的 LB 培养平板中 37 过夜培养, 筛选出阳性重组菌挑选阳性单菌落至 5 ml 含有氨苄青霉素的 LB 培养基中, 在 37,180 r / min 条件下恒温过夜培养, 至 OD 600 达到 0 6 ~ 0 8 时, 加入终浓度为 0 1 mmol / L 的异丙

3 第 4 期李琦, 等 : 耐热木聚糖酶基因的克隆表达及其在酶解玉米芯木聚糖中的应用 65 基 β D 硫代吡喃半乳糖苷 ( IPTG),28 诱导培养 4 h 后, 离心收集菌体, 用 50 mmol / L ph 为 7 0 的柠檬酸磷酸氢二钠缓冲液重悬后, 超声破碎至菌液澄清, 在 4 条件下 r / min 离心 5 min, 收集上清液即为胞内酶液重组木聚糖酶的表达条件优化挑取单菌至 5 ml LB 培养基中, 在 37,180 r / min 条件下恒温培养 12 h 转接于 50 ml LB 培养基中 37 培养至 OD 600 为 0 8, 加入终浓度分别为 0 005, 0 01, 0 02, 0 05 和 0 1 mmol / L 的 IPTG,28 下诱导 4 h, 以不添加 IPTG 为对照 ; 选定 IPTG 浓度为 0 01 mmol / L, 在 28 条件下分别诱导 2,4,6 和 8 h, 以 0 h 为对照 ; 选定 IPTG 浓度为 0 01 mmol / L, 诱导时间为 4 h, 改变诱导温度 20,24,28,32 和重组木聚糖酶的纯化酶活测定及 SDS PAGE 分析重组蛋白用镍亲和试剂盒纯化 Ni 柱平衡后, 将粗酶液以 1 ml / min 速率上样, 然后使用平衡缓冲液以同样速率洗去未吸附的蛋白质和杂质, 使用 200 mmol / L 咪唑缓冲液进行洗脱, 并收集蛋白将收集的酶液透析除盐后进行酶活测定和 SDS PAGE 分析以 Beechwood 木聚糖为底物, 采用 3,5 二硝基 [12] 水杨酸 (DNS) 法测定纯化后的木聚糖酶 XynB DT 的活性反应体系为 :100 μl 柠檬酸柠檬酸三钠缓冲液 (ph 6 5, 50 mmol / L),50 μl 1% 底物在 85 下预热 5 min, 加入 50 μl 酶液,85 下反应 30 min 后加入 300 μl DNS 混匀, 煮沸计时 5 min 后混匀, 于 540 nm 波长处测定其吸光度以有底无酶作为对照 SDS PAGE 试验方法参照分子生物学实验指南进行 [13] 取 500 μl 酶液, 加入 500 μl 的 2 蛋白电泳缓冲液, 煮沸计时 5 min 后离心取 15 μl 上清液进行 SDS PAGE 电泳重组木聚糖酶酶学性质分析最适反应温度及温度稳定性测定 : 在 60,65, 70,75,80,85 和 90 温度下, 分别测定木聚糖酶酶活, 以测定的酶活最高为 100% 计算相对酶活 ; 在最适 ph 条件下, 于 60,70,80 和 90 条件下分别保温 20,40,60,80,100 和 120 min, 以未育温的木聚糖酶活力为相对 100% 最适反应 ph 及 ph 稳定性测定 : 在最适温度条件下, 分别测定 ph 5 0 ~ 7 5 条件下的酶活力, 以测定的最高酶活力为相对 100%, 根据各 ph 条件下酶活力大小确定重组木聚糖酶的最适反应 ph; 在不含底物条件下, 将重组木聚糖酶置于不同 ph(5 0 ~ 7 5) 的柠檬酸柠檬酸三钠缓冲液中, 于 4 保存 24 h, 在最适温度及 ph 条件下测定其残余酶活力, 以未经过 ph 处理酶的酶活力为相对 100% 重组木聚糖酶水解玉米芯木聚糖条件优化玉米芯木聚糖提取方法 [14] : 风干玉米芯粉碎至 40 ~ 60 目 (420 ~ 250 μm), 加入 10% 的 NaOH 溶液至固液比为 1 10, 在 121 条件下抽提 1 h 后抽滤, 用适量水洗涤抽滤渣 1 ~ 2 遍合并所有液体, 使用盐酸中和至 ph 为 7 0, 离心后沉淀物用蒸馏水洗至乳白色, 烘干粉碎后即为玉米芯木聚糖样品用 4% 硫酸水解, 混匀后在 121 下水解 1 h, 调节 ph 至中性, 离心取上清液测定总还原糖, 将所测还原糖质量浓度乘以木聚糖聚合系数 0 88, 即得到木聚糖质量重组木聚糖酶酶解玉米芯木聚糖条件优化 : 玉米芯木聚糖底物质量浓度为 1 25 mg / ml, 以纯化后的 XynB DT 为酶解用酶, 以还原糖质量浓度为评价指标, 研究温度 (30,40,50,60,70 和 80 ) ph(5 0,5 5,6 0,6 5,7 0 和 7 5) 加酶量 ( 50, 100,200,400,800 和 U / g) 和时间 (2,4,6,8, 10,12,14 和 16 h) 对酶解的影响, 优化酶解条件, 所有条件均设置 3 组平行试验酶解率和低聚木糖得率根据以下公式计算 : 酶解率 = ( 还原糖 0 88) / 玉米芯木聚糖质量浓度 100% 低聚木糖得率 = (x 2 +x 3 +x 4 +x 5 +x 6 ) / 玉米芯木聚糖质量浓度 100% 式中,x 2 x 3 x 4 x 5 和 x 6 分别为木二糖木三糖木四糖木五糖和木六糖的质量浓度,mg / ml 2 结果与分析 2.1 木聚糖酶基因的克隆及表达载体构建根据 NCBI 网站公布的来源于 D. thermophilum DSM3960 的 xynb DT 基因序列设计特异性引物 (Genbank:CP ), 扩增出 xynb DT 基因片段, 全长 bp, 该基因编码 361 个氨基酸该基因与来源于 Caldicellulosiruptor sp. F32 和 Paeni bacillus curdlanolyticus 的木聚糖酶基因分别具有 80% 和 56% 的同源性将 xynb DT 基因片段连接到大肠杆菌表达质粒 pet 20b 中, 构建重组质粒 pet 20b xynb DT( 图 1), 载体转化大肠杆菌 E. coli Top 10F 中, 筛选阳性克隆

66 林业工程学报第 2 卷对重组质粒进行 EcoRI 和 NotI 双酶切验证 ( 图 1), 一条在 3 000 bp 左右, 为切去 xynb DT 基因的 pet 20b 片段 ; 另一条在 1 000 bp 左右的条带为 xynb DT 基因的片段, 说明此细菌木聚糖酶的基因已插入到 pet 20b 载体上 Lane1:DL5000 Marker;Lane2:

4 66 林业工程学报第 2 卷对重组质粒进行 EcoRI 和 NotI 双酶切验证 ( 图 1), 一条在 bp 左右, 为切去 xynb DT 基因的 pet 20b 片段 ; 另一条在 bp 左右的条带为 xynb DT 基因的片段, 说明此细菌木聚糖酶的基因已插入到 pet 20b 载体上 Lane1:DL5000 Marker;Lane2: 重组质粒双酶切产物图 1 表达载体 pet 20b xynb DT 的构建及双酶切验证图 Fig. 1 Construction and double enzyme digestion of expression vector pet 20b xynb DT 2.2 重组木聚糖酶表达条件优化在不同的诱导剂 IPTG 浓度诱导时间和诱导导表达的最佳条件分别为 : 在 32 条件下, 添加 0 02 mmol / L 的 IPTG, 诱导 6 h 后所测木聚糖酶酶温度条件下, 测定重组木聚糖酶酶活力, 以最高酶活力为 100%, 结果如图 2 所示重组木聚糖酶诱活最高, 达到 30 6 U / ml, 表达量在木聚糖酶大肠杆菌表达水平下位居前列 [15-16] Fig. 2 图 2 重组木聚糖酶表达条件优化 Condition optimization of expression of recombinant xylanase 2.3 目的蛋白纯化及重组木聚糖酶的酶学性质诱导 6 h 后的菌液离心收集, 并超声破碎后, 经过镍亲和柱纯化得到电泳纯的木聚糖酶 XynB DT( 表 1) 结果显示, 经镍亲和柱纯化后, 最终的酶得率为 73% 透析除盐后进行 SDS PAGE 分析 ( 图 3) 和木聚糖酶酶学性质测定 SDS PAGE 分析的结果表明, 诱导的重组菌具有明显蛋白条带, 经 85 热处理后, 已有较大部分杂蛋白被去除, 说明该细菌木聚糖酶蛋白纯化手段简单经镍柱纯化后得到一条清晰单一的 XynB DT 蛋白条带, 且目的蛋白条带在 40 ~ 55 ku 范围内, 与理论蛋白分子量接近, 由此可知, 重组木聚糖酶基因已在大肠杆菌中成功表达表 1 Table 1 重组木聚糖酶 XynB DT 的纯化 Purification of recombinant XynB DT 步骤总蛋白 / mg 总酶活 / U 比酶活 / (U mg -1 ) 得率 / % 粗酶热处理 Ni NTA 利用纯化后的重组木聚糖酶进行酶学性质分析, 结果如图 4 以 1% Beechwood xylan 为底物, 在 ph 5 0 条件下, 测定温度 60 ~ 90 下的酶活性由图 4a 可知, 重组木聚糖酶的最适反应温度为 85, 在 70 ~ 90 内均能保持 80% 以上相对酶活力 ; 而由图 4b 可见, 该重组木聚糖酶在 60 ~ 80 下具有较好稳定性, 保温 120 min 后酶活基本未变化

5 第 4 期李琦, 等 : 耐热木聚糖酶基因的克隆表达及其在酶解玉米芯木聚糖中的应用 67 M: 蛋白上样 Marker;1: 带有空载质粒 pet 20b 的大肠杆菌 ; 2: 细胞破碎后粗酶液 ;3:85 热变性 60 min 蛋白 ; 4: 镍柱纯化后蛋白图 3 重组木聚糖酶的 SDS PAGE 图 Fig. 3 The SDS PAGE of recombinant xylanase 在 90 下保温 60 min 仍能保持 50% 以上相对酶活力在温度 85 下, 测定 ph 5 0 ~ 7 5 条件下的酶活性由图 4c 可知, 该木聚糖酶在 ph 5 5 ~ 7 0 范围内均能维持 80% 以上活性, 当 ph 高于 7 0 后, 活性下降趋势明显该重组木聚糖酶在 ph 5 0 ~ 7 5 缓冲液中 4 下放置 24 h 后, 仍能保持 90% 以上活性 ( 图 4c) 以不同浓度的木聚糖为底物测定重组酶的酶活, 采用双倒数法计算该酶的米氏常数 K m 1 / s 为横坐标 ( 底物浓度的倒数 ),1 / v 为纵坐标 ( 酶促反应速度的倒数 ), 该直线在 x 轴上的截距为 1 / K m 值,y 轴上的截距为 1 / V max 值, 结果如图 4d 所示重组木聚糖酶的 K m 和 V max 分别为 5 63 mg / ml 和 mmol / (L min -1 ) a) 最适温度 ;b) 温度稳定性 ;c) 最适 ph 和 ph 稳定性 ;d) 反应动力学方程图 4 重组木聚糖酶的酶学性质 Fig. 4 Enzyme characterization of recombinant xylanase 2.4 玉米芯木聚糖的制备及酶解条件研究玉米芯中除含有高达 35% 的木聚糖外, 还含有大量纤维素木质素脂肪蛋白质等物质, 它们通过共价键氢键等作用力紧密结合, 需通过物理化学等手段进行预处理, 手段一般包括高温蒸煮浸提酸法提取碱法提取等 [17] 本试验通过碱法提取玉米芯木聚糖, 从 50 g 玉米芯中得到木聚糖提取物 10 g 温度和 ph 对酶的酶解有较大影响一定温度范围内, 随温度升高, 酶底物中间体分解转化为产物的速度加快当温度过高则会降低酶的稳定性, 使其失活, 从而影响酶的反应速率参考本文木聚糖酶的酶学性质, 选取 30,40,50,60,70 和 80 测定其酶解的最适温度 ( 底物质量浓度为 1 25 mg / ml, 酶用量为 200 U / g,ph 为 6 5, 酶解 12 h), 结果如图 5a 所示温度对酶解率影响较大, 最适酶解温度为 70, 当温度过低时不利于酶解反应发生, 高于 70 后, 酶解率开始下降最适酶解温度条件下, 选取 ph 为 5 0,5 5,6 0,6 5, 7 0 和 7 5 测定其酶解的最适 ph( 底物质量浓度为 1 25 mg / ml, 酶用量为 200 U / g, 酶解 12 h) 由图 5b 可知, 在 ph 为 5 0 ~ 6 5 范围内, 其酶解率

6 68 林业工程学报第 2 卷维持在 35% 以上, 而当 ph 逐渐升高为弱碱性时, 其酶解率下降, 当 ph 为 6 0 时, 酶解效率最高 Fig. 5 a) 最适温度 ;b) 最适 ph;c) 最适酶用量 ;d) 最适酶解时间图 5 重组木聚糖酶酶解玉米芯木聚糖的条件优化 Condition optimization of degradation of corncob xylan by recombinant xylanase 加酶量对酶解率也有显著影响, 当加酶量不足时, 底物酶解不充分, 而加酶量过大则导致生产成本增加, 因此应选择合适的加酶量选取酶用量为 50,100,200,400,800 和 U / g( 底物质量浓度为 1 25 mg / ml, 温度为 70,pH 为 6 0, 酶解 12 h), 结果如图 5c 所示随酶用量增加, 酶解率逐渐升高, 但当酶用量高于 400 U / g 时, 酶解率增加趋势平缓这可能是因为半纤维素分子与木聚糖酶的结合位点数量有限, 当结合位点全部被占据后, 过多用量反而增加了酶与底物的无效吸附, 从而降低了酶解率因此, 从降低生产成本方面考虑, 酶用量选择 400 U / g 较为合适酶解反应时间对酶解效果具有一定影响, 酶解时间过短, 则底物酶解不充分, 但受酶稳定性的限制, 在 70 条件下经过一定反应周期后酶逐渐失活, 不利于低聚木糖产生, 因此应选择合适的酶解时间当底物质量浓度 1 25 mg / ml 温度 70 ph 6 0 和加酶量 400 U / g 的条件下酶解 2,4,6,8, 10,12,14 和 16 h 后分别取样, 结果如图 5d 所示, 酶解率随酶解时间的延长而升高, 超过 12 h 后, 酶解率变化不大因此, 最佳的反应时间为 12 h 目前, 聚合度在 2 ~ 4 范围内的功能性低聚木糖在食品中应用较为广泛, 它们能够促进肠道内有益菌增殖, 改善肠道功能, 因此作为新一代生物制品具有较大应用潜力 [18] 在最适条件下, 重组木聚糖酶对玉米芯木聚糖的水解产物用离子色谱进行分析, 结果如图 6 所示酶解 12 h 后, 酶解产物以低聚木糖为主, 其中木二糖和木三糖质量浓度分别达到和 mg / L, 占总糖的 90% 以上, 且只有少量木糖被检出, 而在 G10 族木聚糖酶的酶解产物中木糖含量则偏高 [19] 最终的酶解得率为 44 3%, 与文献报道结果相近 [20-21] 本研究中得到的重组木聚糖酶具有较好的热稳定性和 ph 稳定性, 且酶解产物中木糖含量少, 说明其在生物转化木质纤维原料生产低聚木糖方面具有较大应用前景 x 1 : 木糖 ;x 2 : 木二糖 ;x 3 : 木三糖 ;x 4 : 木四糖图 6 重组木聚糖酶水解玉米芯木聚糖产物的离子色谱分析图 Fig. 6 Ion chromatography analysis diagram of degradation products of corncob xylan

7 第 4 期李琦, 等 : 耐热木聚糖酶基因的克隆表达及其在酶解玉米芯木聚糖中的应用 69 3 结论本研究以来源于 D. thermophilum DSM3960 的基因组为模板, 对木聚糖酶 XynB DT 进行克隆表达研究, 结论如下 : 1)D. thermophilum 来源的木聚糖酶基因全长 bp, 共编码 361 个氨基酸, 该基因编码蛋白质属糖苷水解酶 G11 家族成功构建大肠杆菌表达质粒 pet 20b xynb DT, 优化其表达条件 :32 条件下, 添加 0 02 mmol / L 的 IPTG 诱导 6 h 后产酶量达到 30 6 U / ml 2) 经镍亲和柱纯化后得到电泳纯的重组木聚糖酶, 该酶的最适反应温度为 85, 最适反应 ph 为 6 5, 在 ph 为 5 0 ~ 7 5 范围内具有较好稳定性, 在 90 条件下保温 120 min, 剩余酶活达 50% 以上, 该酶的 K m 和 V max 分别为 5 63 mg / ml 和 mmol / (L min -1 ) 3) 利用重组木聚糖酶对玉米芯木聚糖进行酶解, 获得最佳酶解条件为 : 温度 70,pH 6 0, 加酶量 400 U / g, 酶解 12 h 利用 HPLC 对酶解产物进行分析, 产物中含有较多木二糖和木三糖, 分别占水解产物总量的 49 4% 和 48 7% 因此, 该重组木聚糖酶不但具有优良的酶学性质, 且在水解玉米芯木聚糖的产物中以低聚木糖为主, 木糖含量少, 较利于低聚木糖的纯化, 显示了其在制备低聚木糖方面具有较大应用潜力本研究可为 XynB DT 木聚糖酶工业化生产低聚木糖提供一定的理论基础, 促进其工业化应用参考文献 (References): [ 1 ] 万红贵, 王涛, 蔡恒, 等. 木聚糖酶的特性及应用研究 [ J]. 食品与发酵工业, 2008, 34(3): WAN H G, WANG T, CAI H, et al. Research advances on char acteristics and application of xylanases[j]. Food and Fermentation Industries, 2008, 34(3): [ 2 ] KHANDEPARKER R, NUMAN M T. 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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌