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1 第 31 卷第期 2016 年月天津科技大学学报 Journal of Tianjin University of Science & Technology Vol. 31 No DOI: /j.issn 葡萄糖脱氢酶温控表达菌株的构建及其发酵工艺李杨, 张志萌, 董自星, 王正祥, 路福平 ( 工业发酵微生物教育部重点实验室, 工业酶国家工程实验室, 天津市工业微生物重点实验室, 天津科技大学生物工程学院, 天津 ) 摘要 : 膜结合型的吡咯喹啉醌依赖性葡萄糖脱氢酶 (mpqqgdh,ec ) 是一种重要的氧化还原酶, 因其在血糖诊断及葡萄糖传感器中的重要应用而受到广泛的关注. 但是其低表达水平限制了这种酶的大规模工业化生产及应用. 本文利用 λ 噬菌体的温敏型启动子 P L -P R 替换葡萄糖脱氢酶基因的启动子, 构建了重组菌大肠杆菌 (E. coli)b /pgcd::km-p L -P R, 并使重组菌的酶活比原始菌株提高了 21.2%,. 再通过发酵条件的优化, 确定了 mpqqgdh 的最适诱导表达条件为 : 以甘油为碳源诱导温度 42, 诱导时间 4,h 诱导前菌体密度 A 600 =1.6. 最后对该酶的酶学性质进行了分析, 其最适反应温度和 ph 分别为 25, 和 6.0, 所得 mpqqgdh 的热稳定性在 45, 条件下可维持稳定的活性. 这为葡萄糖脱氢酶更广泛的应用及工业化生产奠定了基础. 关键词 : 葡萄糖脱氢酶 ; 温敏型启动子 ; 高效表达 ; 发酵工艺优化中图分类号 :Q93 文献标志码 :A 文章编号 : (2016) Construction of a Recombined Bacterium for the Thermo-regulated Expression of Glucose Dehydrogenase and the Optimization of the Fermentation Process LI Yang,ZHANG Zhimeng,DONG Zixing,WANG Zhengxiang,LU Fuping (Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology,Ministry of Education,National Engineering Laboratory for Industrial Enzymes,Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology,College of Biotechnology, Tianjin University of Science & Technology,Tianjin ,China) Abstract:Membrane-bound pyrroloquinoline quinine-dependent glucose dehydrogenase(mpqqgdh,ec )is a significant kind of oxidoreductase,and has received considerable attention for its wide application in the fields of clinical diagnosis and industrial glucose sensors.however,the low expression level limits its mass industrial production and application scope.in this study,temperature sensitive promoter P L -P R was used to replace the promoter of mpqqgdh,resulting in a recombined bacterium E.coli B /pGCd::Km-P L -P R whose glucose dehydrogenase activity was 21.2%, higher than that of the original strain.subsequently,the fermentation conditions were optimized to determine the suitable carbon source, induction temperature,optical density before induction and the induction time for the expression of mpqqgdh. Finally,by characterizing the enzymatic properties of this enzyme,the temperature and ph optima were determined to be 25, and 6.0,respectively,and this enzyme was stable at 45,.These results can lay a solid foundation for the wider range of application and industrial production of mpqqgdh. Key words:glucose dehydrogenase;temperature sensitive promoter;overexpression;fermentation process optimization 大肠杆菌葡萄糖脱氢酶 (mpqqgdh,ec ) 是一种膜结合型醌蛋白, 位于细胞膜外表面. 在醌式辅酶吡咯喹啉醌 (PQQ) 的存在下能特异性催化葡萄糖生成葡萄糖酸.1975 年,Banauch 等就提出利用上收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 国家高技术研究发展计划 (863 计划 ) 资助项目 (2013AA ) 作者简介 : 李杨 (1988 ), 女, 天津人, 硕士研究生 ; 通信作者 : 路福平, 教授,lfp@tust edu.cn. 数字出版日期 : ; 数字出版网址 :.

2 2 天津科技大学学报第 31 卷第期述反应, 采用动态法或终点法分析测定人体体液中的葡萄糖浓度 [1]. 近年来, 以葡萄糖脱氢酶特异性反应为基础制成的血糖检测仪和生物芯片已广泛应用于医疗诊断和人体保健检测等领域 [2 3]. 启动子是基因表达调控的一种重要顺式作用元件, 它一般具有序列特异性位置特异性种属特异性方向性等几个明显的特征 [4].tac 启动子能够以乳糖或 IPTG 作为诱导剂诱导重组蛋白表达, 成本较高, 不适用于大规模工业化生产. 而噬菌体启动子 P L 和 P R 能够通过改变培养温度快速有效地开启或关闭重组蛋白的表达 [5]. 而且已被用于多种目的产物的表达, 具有显著优势 [6]. 此外, 噬菌体启动子还具有作为代谢调控基因开关的潜在应用价值 [7]. 本实验室通过引入温度开关 ( 噬菌体启动子 ) 改变原有菌株代谢途径, 使发酵前期获得足够的菌体量, 再通过温度调节转入后续发酵, 将代谢产物 D 乳酸的产量提高了 66%, [8 9]. 因此, 本研究通过将大肠杆菌葡萄糖脱氢酶基因 (gcd) 的启动子替换为噬菌体启动子 P L -P R, 引入温度诱导型转录系统, 改变了酶合成表达的诱导方式 ; 找出在此表达系统下菌株的最适生长温度及葡萄糖脱氢酶的最适表达温度. 通过摇瓶发酵实验, 优化了相应的发酵条件, 为后续生物法发酵生产葡萄糖脱氢酶提供相关实验数据支持. 1 材料与方法 1.1 菌株与质粒本实验所使用的菌株与质粒见表 1. 表 1 菌株和质粒 Tab. 1 Strains and plasmids used in this study 菌株和质粒 E.coli K12 E.coli JM109 E.coli CICIM B0013 E.coli CICIM B ppl-km pmd 19-T 遗传特性野生菌株 Amp r 野生菌株 B0013,Δack-pta,Δpps,ΔpflB,Δdld,ΔpoxB, ΔadhE,ΔfrdA,ΔldhA Kan r, 含启动子 P L -P R Amp r, 克隆载体注 :pmd19-t 购自 TaKaRa 公司 ; 其他来自本实验室. 1.2 引物列表本实验所使用的引物见表 2, 序列中的下划线部分为酶切位点. 表 2 引物序列 Tab. 2 Primer sequences 引物名称引物序列 (5-3 ) Gcd-1 Gcd-2 Gcd-3f Gcd-4r ppl3 ppl4 D-gcd1 D-gcd2 ACGACGGGACGGTTTATCCA CAGCCAGATGCCGAAGAAGA CTGGTATACTGCGTGTCTTGCG GCGGAATTCATGGCAATTA ACAATA- CAGGCTCGC(EcoR Ⅰ) TAAGATATCCCATGAT- TACGAATTGCCGGC(EcoR Ⅴ) TAAGAATTCAGTTAACCTCCTTAG- GATCCCAATGCTT(EcoR Ⅰ) TCAATGCCGTAACCCACCAC CTAATCAGCAGTGCGACCAC 1.3 试剂与培养基限制性内切酶 (Pst Ⅰ BamH Ⅰ EcoR Ⅰ Xho Ⅰ) T4,DNA 连接酶 DNA 聚合酶和 dntps 均购自 TaKaRa 公司 ; 其他药品和试剂均为分析纯. LB 培养基 (g/l): 酵母浸出物 5, 胰蛋白胨 10, NaCl 10, 用去离子水溶解并定容 , Pa 灭菌 20,min. 固体培养基加入 2%, 琼脂. M9 培养基 (g/l) :Na 2 HPO 4 12H 2 O , KH 2 PO 4 3,NH 4, Cl 1,NaCl 1, 用去离子水溶解并定容. 每升 M9 液体培养基补加 1,mL 1,mol/L MgSO 4 和 1,mL 微量元素母液. 微量元素母液成分 (g/l): FeCl 3 6H 2 O 2.400,CoCl 2 6H 2 O 0.300,CuCl 2 2H 2 O 0.150,ZnCl ,Na 2 MoO 4 2H 2 O 0.300,H 3 BO ,MnCl 2 4H 2 O 葡萄糖脱氢酶基因 gcd 的扩增根据 GenBank 中大肠杆菌 (E.coli)K12 的 gcd 基因序列设计两条特异性引物 :Gcd-1 与 Gcd-2. 提取 E.coli K12 的基因组 DNA 作为扩增模板, 扩增葡萄糖脱氢酶基因序列.PCR 反应体系 (50,μL): 基因组 DNA 1,μL,10 buffer 5,μL,25,mmol/L dntp 4,μL,LA Taq DNA 聚合酶 0.5,μL,10,mmol/L 上下游特异性引物各 2,μL,ddH 2 O 37.5,μL. 反应条件 : 94, 5,min;94, 45,s,58, 45,s,72, 1,min,30 个循环 ;72, 10,min. 将 PCR 产物进行回收纯化, 与线性化的 pmd19-t 载体连接, 转化 E.coli JM109 感受态, 涂布于含有氨苄青霉素的 LB 平板上, 提取质粒酶切验证. 1.5 重组菌株的构建用引物 ppl3 和 ppl4, 并以质粒 ppl-km 为模板, 按照上述 PCR 体系与条件扩增得 P L -P R 启动子, 回收纯化 PCR 产物并用 EcoR I 和 EcoR V 双酶切得到酶切产物 (2.4,kbp). 以重组质粒 pmd19-t-gcd 为

3 2016 年月李杨, 等 : 葡萄糖脱氢酶温控表达菌株的构建及其发酵工艺 3 模板, 设计引物 Gcd-3f 和 Gcd-4r, 进行反向 PCR, PCR 产物为 3.5,kbp, 并用 T4 多聚核苷酸激酶对其产物平末端磷酸化. 将 P L -P R 启动子序列与反向 PCR 产物进行连接构建重组质粒 pgcd::km-p L -P R, 转化 E.coli JM109, 涂布于含有卡那霉素的 LB 平板上, 提取质粒并用 Pst Ⅰ 酶切验证得到 5.2,kbp 和 0.7,kbp 两条条带. 用重组质粒 pgcd::km-p L -P R 的质粒 DNA 作为模板, 以 Gcd-1 和 Gcd-2 为引物, 利用上述反应体系和条件 (1.4 部分 ) 进行 PCR 扩增, 扩增出 pgcd:: Km-P L -P R 基因片段. 电击转化 (1,800,V,5,ms) 含有辅助质粒 pkd 46 并经 2,mmol/L L 阿拉伯糖诱导的目的菌株 B C, 在卡那霉素抗性平板筛选转化子. 挑取阳性转化子, 以 D-gcd1 和 D-gcd2 为引物, 进行菌落 PCR 验证. 1.6 重组菌株的诱导表达分别挑取菌株 B /pKD46 以及重组菌株 B /pGCd:Km-P L -P R 的单菌落于 50,mL LB 培养基中,30, 200,r/min 培养过夜. 以 2%, 的接种量接种于 50,mL 含有 5,g/L 葡萄糖的 M9 液体培养基中, 以 30, 200,r/min 培养 2,h 后, 以 42, 200,r/min 诱导培养 4,h.8,000,r/min 离心 10,min, 去除上清液, 制成粗酶液, 测定葡萄糖脱氢酶酶活. [10] 1.7 葡萄糖脱氢酶酶活测定 D-Glucose+ox-PMS D-glucono-5-lactone+ re-pms re-pms+ox-dcip ox-pms+re-dcip 氧化态的 2,6 二氯靛酚 (DCIP) 溶液为蓝色, 在 600,nm 处有吸光度, 而还原态的 DCIP 溶液为无色. 因此当反应进行时, 蓝色会慢慢褪去, 相应的 A 600 值会逐渐减小, 通过 A 600 值的变化对酶活进行测定计算. 酶活单位 (U):25, 条件下, 在 1,min 内能够使 1,μmol 的葡萄糖氧化 ( 或 1,μmol DCIP 还原 ) 的酶量. 酶活测定 :50,mmol/L Tris-HCl(pH 8.0), 20,mmol/L 葡萄糖,0.75,mmol/L PMS,0.75,mmol/L DCIP 和 10,μL 适当稀释的酶液. 将反应试剂母液依次加入到 1,cm 比色皿中混合均匀, 在 25, 下进行反应, 开始计时, 通过 UV 9100 型分光光度计读取记录下第 1,min 和 3,min 的 A 600. 空白对照 :50,mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),20,mmol/L 葡萄糖,0.75,mmol/L 吩嗪硫酸甲酯 (PMS),0.75,mmol/L DCIP 和 10,μL 去离子水. 将反应试剂母液依次加入到 1,cm 比色皿中混合均匀, 在 25, 下进行反应, 开始计时, 通过 UV 9100 型分光光度计读取记录下第 0,min 和 3,min 的 A 600. 酶活按照式 (1) 进行计算. A测定 A空白酶活 (U/mL) df (1) Vt V t min 式中 :A 测定和 A 空白分别为 600,nm 下酶活测定和空白对照的吸光度 ;V t 为体系体积,2,mL;t min 为反应时间,3,min;V s 为加入的酶液体积,0.02,mL;d f 为酶液稀释倍数. 1.8 诱导条件对重组葡萄糖脱氢酶表达的影响培养基碳源对重组葡萄糖脱氢酶表达的影响本文选用甘油和葡萄糖两种常用碳源进行对比分析, 分别挑取菌株 B /pKD46 以及转化子 B /pGCd::Km-P L -P R 的单菌落于 50,mL LB 液体培养基中,30, 200,r/min 培养过夜. 以 2%, 的接种量接种于 50,mL 分别以甘油 ( 终质量浓度为 5,g/L) 和葡萄糖 ( 终质量浓度为 5,g/L) 为唯一碳源的 M9 液体培养基中,30, 200,r/min 培养 2,h 后, 以 42, 200,r/min 诱导培养 4,h.8,000,r/min 离心 10,min 收集菌体, 测定葡萄糖脱氢酶酶活诱导温度对葡萄糖脱氢酶表达的影响分别将菌株 B /pKD46 以及重组菌株 B /pGCd::Km-P L -P R 按照的培养方式进行过夜培养. 以 2%, 的接种量接种于含有上述最佳碳源的 50,mL M9 液体培养基中,30, 200,r/min 培养至菌体密度为 A 600 =1.0 时, 添加 0.5%, 酵母膏, 分别在 , 以及 200,r/min 诱导 4,h 后测定酶活诱导前菌体密度对葡萄糖脱氢酶表达的影响分别将菌株 B /pKD46 以及重组菌株 B /pGCd::Km-P L -P R 按照的培养方式培养至菌体密度分别为 A 600 = 时, 添加 0.5%, 的酵母膏于最佳诱导温度下诱导 4,h. 收集菌体, 用 ddh 2 O 清洗菌体后, 收集 30,mL 菌体, 添加约 1,mL ddh 2 O( 使每管菌体菌体密度一致 ) 混匀并添加终浓度 5,μmol/L PQQ 和终浓度为 1,mmol/L 的 Mg 2+,25, 孵育 30,min, 测定酶活诱导时间对葡萄糖脱氢酶表达的影响按上述最佳培养条件, 分别将菌株 B /pKD46 以及重组菌株 B /pGCd::Km- P L -P R 培养至最佳菌体密度, 添加 0.5%, 的酵母膏, 分别在最佳诱导温度下诱导 ,h. 收集菌体, 用 s

4 天津科技大学学报第 31 卷第期 ddh 2 O 清洗菌体后, 收集 30,mL 菌体, 添加约 1,mL ddh 2 O( 使每管菌体菌体密度一致 ) 混匀并添加 5,μmol/L PQQ 和终浓度为 1,mmol/L 的 Mg 2+,25, 孵育 30,min. 测定酶活. 1.9

测定酶活. 1.9.3 葡萄糖脱氢酶的最适反应 ph 制备粗酶液并添加 5,μmol/L PQQ 和终浓度为 1,mmol/L 的 Mg 2+, 于 25, 孵育 30,min. 分别在 ph 为 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 的缓冲体系 (0.2,mol/L 磷酸二氢钠和 0.3,mol/L 磷酸氢二钠缓冲液 ) 中测定酶活, 分析其最适反应 ph.

将该片段电转至菌株 B0013-120/pKD46 的感受态细胞中, 从而得到重组菌株 B0013-120/pGCd::Km-P L -P R. 提取该菌株的染色体, 以引物 D-gcd1 和 Gcd-2 进行 PCR 验证, 结果得到 3.2,kbp 的目的条带, 如图 2 所示. 2 结果与分析 2.1 重组菌株的构建按照 1.3 1.

4 4 天津科技大学学报第 31 卷第期 ddh 2 O 清洗菌体后, 收集 30,mL 菌体, 添加约 1,mL ddh 2 O( 使每管菌体菌体密度一致 ) 混匀并添加 5,μmol/L PQQ 和终浓度为 1,mmol/L 的 Mg 2+,25, 孵育 30,min. 测定酶活. 1.9 葡萄糖脱氢酶酶学性质分析葡萄糖脱氢酶的最适反应温度制备粗酶液并添加 5,μmol/L PQQ 和终浓度为 1,mmol/L 的 Mg 2+, 分别于 , 孵育 30,min. 测定酶活, 确定其最适反应温度葡萄糖脱氢酶的热稳定性将粗酶液分别于 , 水浴锅中进行孵育, 每 10,min 取样 1 次, 立即置于冰上 2,min, 室温恢复 30,min. 测定酶活葡萄糖脱氢酶的最适反应 ph 制备粗酶液并添加 5,μmol/L PQQ 和终浓度为 1,mmol/L 的 Mg 2+, 于 25, 孵育 30,min. 分别在 ph 为的缓冲体系 (0.2,mol/L 磷酸二氢钠和 0.3,mol/L 磷酸氢二钠缓冲液 ) 中测定酶活, 分析其最适反应 ph. 扩增出 P L -P R 启动子与卡那霉素抗性基因的序列经电泳检测, 在约 3.5,kbp 有明显条带, 大小相符. 将两段序列进行连接转化至大肠杆菌感受态中, 获得含有卡那霉素抗性序列的重组质粒 pgcd:: Km-P L -P R,PstⅠ 酶切条带为 0.7,kbp 和 5.2,kbp. 以该重组质粒为模板, 扩增出大小为 3.2,kbp 的 pgcd:: Km-P L -P R 基因片段. 将该片段电转至菌株 B /pKD46 的感受态细胞中, 从而得到重组菌株 B /pGCd::Km-P L -P R. 提取该菌株的染色体, 以引物 D-gcd1 和 Gcd-2 进行 PCR 验证, 结果得到 3.2,kbp 的目的条带, 如图 2 所示. 2 结果与分析 2.1 重组菌株的构建按照的方法扩增出完整的 gcd 基因序列, 经过凝胶电泳检测在 0.9,kbp 左右有明显条带 ( 图 1), 与 gcd 序列大小一致. 图 2 重组菌株 B /pGCd::Km-P L -P R 的 PCR 验证 Fig. 2 PCR verification of the recombined vector B /pGCd::Km-P L -P R 2.2 重组菌的诱导表达按照 1.5 的诱导方法, 将得到的重组菌株 B /pGCd::Km-P L -P R 与原始菌株 B / pkd46 转接摇瓶中进行诱导后, 分别测定其酶活, 发现对照菌和重组菌的酶活分别为 (52±2)U/mL (63±6)U/mL( 图 3). 1. gene gcd;m.1,000,bp DNA ladder 图 1 gcd 基因的 PCR 产物 Fig. 1 Products of gene gcd after PCR Fig. 3 图 3 重组菌的葡萄糖脱氢酶酶活 Assay of the enzymatic activity of the engineered strains

2016 年月李杨, 等 : 葡萄糖脱氢酶温控表达菌株的构建及其发酵工艺 5 在相同条件下, 重组菌酶活力高于原始菌酶活力.

3 诱导条件对重组葡萄糖脱氢酶表达的影响培养基中丰富的营养供给对细胞生长极为有利, 使诱导前细胞密度达到一个较高值, 可为温度诱导目标蛋白的高水平表达奠定良好的基础. 此外, mpqqgdh 作为一种膜蛋白, 其表达量在一定程度上与菌体密度成正相关, 因此提高菌体密度有利于膜蛋白产量的提高.M9 培养基作为 mpqqgdh 的表达培养基, 其氮源和微量元素非常丰富, 但需要外源添加碳源.

其原因可能是菌体密度达到一定程度时膜蛋白表达较高, 但菌体密度过高的情况下, 菌体老化等原因可能会对细胞有一定的毒害作用. 因此, 选取菌体密度为 A 600 =1.6 时进行诱导. Fig. 5 图 5 诱导温度对酶活的影响 Influence of induction temperature on the enzymatic activity Fig.

5 2016 年月李杨, 等 : 葡萄糖脱氢酶温控表达菌株的构建及其发酵工艺 5 在相同条件下, 重组菌酶活力高于原始菌酶活力. 这是因为重组菌株 B /pGCd::Km-P L -P R 使用温控开关替换了原始启动子,pPL451 具有 λ 噬菌体启动子 P L 和 P R, 在低温 (28~30, ) 下生长时, ci ts 857 基因表达的 λ 抑制物可以抑制该启动子的转录, 当细胞生长至适宜菌体浓度时, 进行 42, 培养可使 λ 抑制物快速失活. 从而启动子恢复转录功能, 进而表达蛋白. 2.3 诱导条件对重组葡萄糖脱氢酶表达的影响培养基中丰富的营养供给对细胞生长极为有利, 使诱导前细胞密度达到一个较高值, 可为温度诱导目标蛋白的高水平表达奠定良好的基础. 此外, mpqqgdh 作为一种膜蛋白, 其表达量在一定程度上与菌体密度成正相关, 因此提高菌体密度有利于膜蛋白产量的提高.M9 培养基作为 mpqqgdh 的表达培养基, 其氮源和微量元素非常丰富, 但需要外源添加碳源. 分别以 10%, 甘油和葡萄糖作为碳源, 它们对重组菌内葡萄糖脱氢酶表达的影响如图 4 所示. 从图 4 可以看出, 重组菌株在以甘油为碳源的培养基中葡萄糖脱氢酶的表达量较葡萄糖为碳源的培养基的高 17,U/mL, 表明甘油更适合作为重组菌表达的培养基碳源. 下进行诱导后, 分别测定其酶活, 结果如图 6 所示. 由图 6 可知, 在菌体密度为 A 600 =1.6 时, 蛋白表达量最高. 其原因可能是菌体密度达到一定程度时膜蛋白表达较高, 但菌体密度过高的情况下, 菌体老化等原因可能会对细胞有一定的毒害作用. 因此, 选取菌体密度为 A 600 =1.6 时进行诱导. Fig. 5 图 5 诱导温度对酶活的影响 Influence of induction temperature on the enzymatic activity Fig. 6 图 6 诱导前菌体密度对酶活的影响 Influence of optical density before induction on the enzymatic activity 图 4 碳源对葡萄糖脱氢酶酶活的影响 Fig. 4 Influence of carbon sources on the enzymatic activity 以 10%, 甘油作为碳源, 分别在 , 的条件下对重组菌和原始菌进行诱导, 比较诱导温度对葡萄糖脱氢酶表达的影响, 结果如图 5 所示.30, 诱导时, 重组菌的酶活反而低于原始菌,37, 诱导时, 重组菌与原始菌的酶活差别不大, 而 42, 诱导时, 重组菌酶活为 60,U/mL 大于原始菌的酶活 47,U/mL. 这说明 42, 是重组菌的最适诱导温度. 分别将原始菌和重组菌转接摇瓶培养至菌体密度分别达到 A 600 = 时, 在 42, 条件分别将原始菌和重组菌转接摇瓶培养至菌体密度分别达到 A 600 =1.6 时, 在 42, 条件下诱导 ,h 后, 测定其酶活, 其结果如图 7 所示. 诱导时间为 4,h 时, 酶活力最高. 因此, 选取诱导时间为 4,h, 以得到最高产酶量. 图 7 诱导时间对酶活的影响 Fig. 7 Influence of induction time on the enzymatic activity

6 6 天津科技大学学报第 31 卷第期诱导温度以及诱导时间对重组蛋白的大量表达也有很大的影响. 在升温诱导的后期, 重组蛋白的大量表达和高温诱导条件下的热诱导会产生热休克蛋白 (37, 条件即可产生 ) [11]. 而这些热休克蛋白中含有许多蛋白水解酶 [12], 会降解部分重组蛋白, 从而使得升温诱导一段时间后 mpqqgdh 的活性下降. 持续的高温诱导和重组蛋白的大量表达除了促进包涵体形成之外, 也会引起大肠杆菌的应急反应 (SOS response). 这种应急反应会诱导宿主菌表达 Rec-A 蛋白 [13], 它会和温度起到协同作用共同裂解 ci ts 857 阻遏蛋白, 进一步促使 P L -P R 启动子的高效转录. 经实验证明, 在 42, 的温度条件下诱导 4,h, 能得到酶活较高的 mpqqgdh. 标绘制曲线, 结果如图 10 所示, 葡萄糖脱氢酶的最适测定 ph 为 6.0. 图 9 酶的热稳定性 Fig. 9 Thermal stability of the enzyme 2.4 葡萄糖脱氢酶酶学性质分析葡萄糖脱氢酶的最适孵育温度在不同的温度 ( , ) 下测定酶活, 以温度为横坐标, 相对酶活为纵坐标绘制曲线, 结果如图 8 所示. 结果表明 : 葡萄糖脱氢酶的最适反应温度为 25,. 图 10 ph 对相对酶活的影响 Fig. 10 Influence of ph on the relative enzymatic activity 3 结语图 8 孵育温度对相对酶活的影响 Fig. 8 Influence of incubation temperature on the relative enzymatic activity 葡萄糖脱氢酶的热稳定性热稳定性的研究表明 ( 图 9),mPQQGDH 在 45, 条件下比较稳定, 而在 55, 条件下半衰期为 20,min, 在 65, 20,min 酶活力仅为 6,U/mL, 而 75, 可直接导致酶的失活. 与吡咯喹啉醌型水溶性葡萄糖脱氢酶 (spqqgdh) 一样, 具有热稳定性差的特点. 后续研究中可以采用定点突变等方法提高其热 [14] 稳定性. 比如,Sode 等利用 linker 将 PQQGDH-B 的两个亚基连起来, 使该酶在 55, 孵育 20,min 后残留的酶活提高了 1 倍, 达到 40%, 以上葡萄糖脱氢酶的最适测定 ph 将葡萄糖脱氢酶粗酶液分别在不同 ph 的缓冲体系中测定酶活, 以 ph 为横坐标, 相对酶活为纵坐由于大肠杆菌具有遗传背景清楚表达体系稳定以及大规模发酵经济等优点, 常用作外源基因表达的高效宿主, 也是获得外源基因稳定高效表达的较好选择.IPTG 是 tac 启动子常用的诱导物, 但其具有毒性且价格昂贵, 不适用于工业化生产. 本文利用温敏型启动子 P L -P R 替换葡萄糖脱氢酶原有的启动子, 通过温度的变化对其进行诱导控制, 节省了添加诱导剂的成本及步骤, 使发酵过程更简便. 此外, 优化了摇瓶发酵条件并研究了葡萄糖脱氢酶的酶学性质, 这为其工业化生产及更广泛的应用奠定了基础. 参考文献 : [1] Duine J A,Frank J,Van der Meet R. Different forms of quinoprotein aldose-(glucose-)dehydrogenase in Acinetobacter calcoaceticus[j]. Archives of Microbiology, 1982,131(1): [2] Bilen H,Kilicaslan A,Akcay G,et al. Performance of glucose dehydrogenase(gdh)based and glucose oxi-

7 2016 年月李杨, 等 : 葡萄糖脱氢酶温控表达菌株的构建及其发酵工艺 7 dase(gox)based blood glucose meter systems at moderately high altitude[j]. Journal of Medical Engineering and Technology,2007,31(2): [3] Zhang M,Mullens C,Gorski W. Coimmobilization of dehydrogenases and their cofactors in electrochemical biosensors[j]. Analytical Chemistry,2007,79(6) : [4] 夏江东, 程在全, 季鹏章, 等. 高等植物启动子功能和结构研究进展 [J]. 云南农业大学学报,2006,21(1):7-14. [5] Love C A,Lilley P E,Dixon N E. Stable high-copynumber bacteriophage λ promoter vectors for overproduction of proteins in Escherichia coli[j]. Gene,1996, 176(1): [6] Makrides S C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli[j]. Microbiological Reviews,1996,60(3): [7] Ptashne M. A genetic switch:phage [lambda] and higher organisms[m]. 2nd ed. Cambridge:Cell Press,1992:11. [8] Tian K M,Chen X Z,Shen W,et al. High-efficiency conversion of glycerol to D-lactic acid with metabolically engineered Escherichia coli[j]. African Journal of Biotechnology,2012,11(21): [9] Zhou L,Tian K M,Niu D D,et al. Improvement of D- lactate productivity in recombinant Escherichia coli by coupling production with growth[j]. Biotechnology Letters,2012,34(6): [10]Koji S,Hiroyuki S. Glu742 substitution to Lys enhances the EDTA tolerance of Escherichia coli PQQ glucose dehydrogenase[j]. Biotechnology Letters,1994,16(5): [11]Guisbert E,Yura T,Rhodius VA,et al. Convergence of molecular,modeling,and systems approaches for an understanding of the Escherichia coli heat shock response [J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2008,72(3): [12]Rosen R,Ron E Z. Proteome analysis in the study of the bacterial heat-shock response[j]. Mass Spectrometry Reviews,2002,21(4): [13]Liveris D,Mulay V,Schwartz I. Functional properties of Borrelia burgdorferi reca[j]. Bacteriology,2004, 186(8): [14]Sode K,Shirahane M,Yoshida H. Construction and characterization of a linked-dimeric pyrroloquinoline quinone glucose dehydrogenase[j]. Biotechnology Letters,1999, 21(8): 责任编辑 : 郎婧

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材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌