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瑾唐
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1 HEREDITAS (Beijing) 2008 年 5 月, 30(5): ISSN 研究报告 DOI: /SP.J 内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及其酶学性质研究陈惠, 胥兵, 廖俊华, 官兴颖, 吴琦四川农业大学生命科学与理学院, 雅安摘要 : 通过 PCR 方法将已克隆的内切葡聚糖酶基因 (GenBank No. DQ782954) 信号肽编码序列去除, 然后与表达载体 phis1525 连接后转化大肠杆菌 DH5α, 筛选出阳性转化子 DH5 α -phis1525-g7 并提取质粒进一步转化巨大芽孢杆菌 WH320 原生质体, 获得基因工程菌 WH320-pHIS1525-G7 刚果红染色和 SDS-PAGE 分析表明该基因在巨大芽孢杆菌中得到了有效表达基因工程菌经优化培养后, 胞外上清液中的酶活力可达 889 U, 是出发菌株 ( 即枯草芽孢杆菌 C-36) 的倍酶学性质研究表明 : 该酶的最适反应温度与 ph 值分别为 65 与 ph 6.0, 在 ph 4.5~10.0 范围内 50 保温 30 min 可保持在最高酶活的 80% 以上关键词 : 巨大芽孢杆菌 ; 内切葡聚糖酶 ; 基因表达 ; 酶学性质 Expression of endoglucanase gene in Bacillus Megaterium and characterization of recombinant enzyme CHEN Hui, XU Bing, LIAO Jun-Hua, GUAN Xing-Ying, WU Qi College of Biology and Science, Sichuan Agricultural University, Ya an , China Abstract: The signal peptide-encoding sequence, which was included in the gene (GenBank No. DQ782954) encoding for endoglucanase, was removed by PCR. The gene without the signal peptide was then ligated with the expression plasmid phis1525. The recombination plasmid phis1525 was transformed into Escherichia coli DH5α and the transformant was designated DH5α phis1525 G7. The plasmid from the recombinant DH5α-pHIS1525-G7 was transformed into the protoplasts of Bacillus megaterium strains WH320, and the genetically engineered bacterium, known as WH320-pHIS1525-G7, was acquired. The effective expression of the gene in the recombinant was confirmed by Congo-red dyeing and SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). WH320-pHIS1525-G7 was cultured in optimum condition. The activity of the endoglucanase was 899U, which was fold higher than that of B.subtilis C-36. The properties of enzyme were determined. The optimum temperature and ph value were 65 and ph 6.0, respectively. The enzyme maintained over 80% of the original enzyme activity between ph 4.5 and ph 10.0 after incubated at 50 for 30 min. Keywords: Bacillus megaterium; endoglucanase; gene expression; enzyme properties 纤维素是世界上最大的可再生资源纤维素通过降解, 可转化为人类急需的能源食物化工原料对于人类社会解决食物短缺和能源危机具有重大现实意义利用微生物产生的纤维素酶 (cellulase) 来分解和转化纤维素则是纤维素利用的有效途径其中, 细菌产生的纤维素酶一般是中性或偏碱性, 这使它在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中有着独特的使用性能和巨大的经济价值葡聚糖内切酶收稿日期 : ; 修回日期 : 作者简介 : 陈惠 (1962 ), 女, 四川人, 博士, 教授, 研究方向 : 微生物酶工程. Tel: ; chenhui@sicau.edu.cn

2 650 HEREDITAS (Beijing) 2008 第 30 卷是纤维素降解酶系中的重要一员, 纤维素的降解首先由葡聚糖内切酶随机切割 β-1, 4 主键, 进而由纤维二糖酶和 β- 葡萄糖苷酶完成彻底降解 [1] 目前, 纤维素酶基因的克隆与表达的研究已经成为纤维素酶分子生物学研究的热点随着纤维素酶分子生物学的研究不断深入, 越来越多的纤维素酶基因被克隆与表达来源于纤维素降解微生物的纤维素酶基因的异源表达, 使用最多的宿主就是大肠杆菌然而, 在安全性生产技术及蛋白分泌等方面, 巨大芽孢杆菌比大肠杆菌更具作为表达宿主的优势目前还未见有关在巨大芽孢杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道, 本实验将已克隆的内切葡聚糖酶基因 (GenBank No. DQ782954) [2] 转入巨大芽孢杆菌 WH320 中, 实现了该基因在芽孢杆菌中的高效表达, 并对表达产物进行了酶学性质的研究 1 材料和方法 1.1 材料菌种与质粒 Escherichia coli JM109 与 E. coli DH5α 为本实验室保存, Bacillus megaterium WH320 与质粒 phis1525 购于 MoBiTec 公司, 质粒 pmd18-t Vector 购于 TaKaRa( 大连 ) 公司, B3 质粒 ( 含已克隆的内切葡聚糖酶基因 ) 为本实验室构建及保存酶和试剂 Taq DNA 聚合酶限制性内切酶 T4 DNA 连接酶购于 TaKaRa 公司 ; 质粒提取试剂盒凝胶回收试剂盒 DNA Marker Ⅲ DNA Marker Ⅶ λdna/hindⅢ 蛋白质 MarkerⅡ 购自天根生化科技有限公司 ; 氨苄青霉素四环素溶菌酶购自上海生工生物工程技术服务有限公司培养基 LB 培养基见参考文献 [3]; AB3 培养基配成 1.75%, 购自 Difco 公司 ; 芽孢杆菌转化培养基 SMMP 液 SMM 液和 CR5 培养基的配置参考 MoBiTec 公司 Bacillus megaterium Protein Expression System 操作手册 ; 发酵培养基使用 LB 培养基, 四环素工作浓度为 10 μg/ml 1.2 方法引物设计根据内切葡聚糖酶基因序列及表达载体 phis1525 酶切位点序列, 结合信号肽预测结果, 应用 Primer premier5.0 软件设计出如下 PCR 引物, 在上游引物 5 端引入一个 BglⅡ 位点和碱基 CA, 在下游引物 5 端引入一个 SphⅠ 位点, 并可通过 PCR 去掉内切葡聚糖酶基因自身信号肽编码序列 : 上游引物 (P1): 5 -AGATCT CAGCAGAGACAA AAACGCCAGT 3 SphⅠ CA 是为了不改变阅读框而引入的碱基下游引物 (P2): 5 -GCATGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAA3 BglⅡ 质粒提取质粒提取和胶回收均按试剂盒操作说明进行目的基因的获得以提取的 B3 质粒为模板, 根据设计的引物进行 PCR, 反应参数为 :94 预变性 2 min, 94 变性 1 min, 65 复性 1 min, 72 延伸 90 s, 30 个循环后, 72 再延伸 10 min 连接与转化将胶回收的 PCR 产物与 pmd18-t Vector 连接后转化大肠杆菌 JM109, 在含有氨苄青霉素 (10 μg/ml) 的 LB 平板上通过菌落 PCR 筛选阳性转化子重组表达质粒的构建提取阳性转化子质粒, 经 BglⅡ SphⅠ 双酶切后胶回收目的条带然后与同样双酶切处理并回收的表达质粒 phis1525 进行连接, 转化大肠杆菌 DH5α 在含有氨苄青霉素的 LB 平板上长出菌落后, 通过菌落 PCR 筛选阳性转化子重组质粒转化巨大芽孢杆菌 WH320 芽孢杆菌 WH320 原生质体的制备参见文献 [4], 略有改动 : OD 600 =1.0; 加溶菌酶终浓度为 0.1 mg/ml, 菌液置 37 水浴保温约 30 min 将构建好的重组表达质粒按 MoBiTec 公司的操作手册进行芽孢杆菌转化, 同时以质粒 phis1525 转化芽孢杆菌作为阳性对照内切葡聚糖酶基因的诱导表达将重组芽孢杆菌接入含四环素的 LB 培养基中 37 培养 12 h, 以 5% 的接种量接种到含相应抗生素的 LB 培养基中继续培养 4 h 后取样作为诱导前样品, 加入终浓度为 0.2% 的木糖, 分别在诱导 2.5 h 6 h 和 9 h 后取样, 4 条件下 r/min 离心 10 min 收集上清液表达产物的分析和鉴定通过刚果红染色和对上清液进行 SDS-PAGE 分析, 检测重组蛋白的表达情况刚果红染色参见文

第 5 期陈惠等 : 内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及其酶学性质研究 651 献 [5], 筛选平板为含有四环素和羧甲基纤维素钠的 LB 平板按照 MoBiTec 公司操作手册操作获得上 [6] 清液蛋白的沉淀, 再进行 SDS-PAGE 电泳检测纤维素酶活力的测定与酶活力的计算参见文献 [7] 酶活单位 (U) 的定义为 : 在 50, ph 6.

8 下, 使酶在 30~90 范围内, 每隔 5 保温 30 min, 再测定相对酶活以酶活最高为 100%, 其余酶活与之相比计算相对酶活 2 结果和分析 2.

3 第 5 期陈惠等 : 内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及其酶学性质研究 651 献 [5], 筛选平板为含有四环素和羧甲基纤维素钠的 LB 平板按照 MoBiTec 公司操作手册操作获得上 [6] 清液蛋白的沉淀, 再进行 SDS-PAGE 电泳检测纤维素酶活力的测定与酶活力的计算参见文献 [7] 酶活单位 (U) 的定义为 : 在 50, ph 6.8, 1 ml 酶液每分钟产生相当于 1 μg 葡萄糖所需的酶量酶学性质测定重组内切葡聚糖酶的最适作用 ph 和 ph 稳定性在不同 ph 范围测定酶活力 ; 将原酶液置于不同 ph 值的缓冲液于 50 保温 30 min, 测定残余酶活力以酶活最高为 100%, 其余酶活与之相比计算相对酶活重组内切葡聚糖酶的最适反应温度和热稳定性在 30~90 范围内, 每隔 5, 与底物反应 30 min 分别测定酶活 ; 在相对稳定的 ph6.8 下, 使酶在 30~90 范围内, 每隔 5 保温 30 min, 再测定相对酶活以酶活最高为 100%, 其余酶活与之相比计算相对酶活 2 结果和分析 2.1 目的基因的获得 PCR 结果表明 ( 图 1): 产物大小与目的基因大小 (1 500 bp) 接近, 说明通过扩增后获得了目的条带性转化子, 菌落 PCR 结果如图 2 所示从电泳结果可以看出, 在挑取的 9 个转化子中, 除了 9 号转化子, 其余 8 个转化子通过其菌落 PCR 后均得到与目的基因的大小相一致的产物, 说明 1~8 号是阳性转化子图 2 E.coli JM109 转化子的菌落 PCR M: DNA markerⅢ; 1~8: 菌落 PCR Fig. 2 The colony PCR of recombinant E. coli JM109 M: DNA markerⅢ; 1 8: Colony PCR. 2.3 重组表达质粒的构建及转化将去掉自身信号肽编码序列的内切葡聚糖酶基因插入到质粒 phis1525 的 BglⅡ SphⅠ 酶切位点之间, 获得重组表达质粒 phis1525-g7, 如图 3 所示将重组质粒 phis1525-g7 以原生质体法转化巨大芽孢杆菌 WH320, 获得含有重组质粒的重组菌株 WH320-pHIS1525-G7, 按同样的转化方法获得了不含目的基因的阳性对照菌株 WH320-pHIS 重组内切葡聚糖酶基因的表达鉴定图 1 PCR 扩增结果 1: DNA marker Ⅲ; 2~3: PCR 产物 Fig. 1 The results of PCR 1: DNA marker Ⅲ; 2 3: PCR product. 2.2 目的基因的克隆将胶回收后的目的基因与克隆载体 pmd18-t Vector 进行连接后转化 E.coli JM109 感受态细胞, 长出菌落后挑取大小均匀的菌落进行菌落 PCR 检测阳将两株重组菌 WH320-pHIS1525-G7 转接到含有 10 μg/ml 四环素和 0.5%(M/V) 羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 的 LB 平板中, 培养 2 天后采用刚果红染色法观察水解圈情况, 结果如图 4 所示刚果红染色表明, 重组菌株 WH320-pHIS1525-G7 能够产生水解圈, 而阳性对照菌株 WH320-pHIS1525 未见水解圈, 说明目的基因在巨大芽孢杆菌中得到了表达, 且产物具有内切葡聚糖酶活性通过测定上清液酶活证明了基因表达产物主要分泌到胞外, 在胞外上清液中的酶活力可达 889 U, 是出发菌株 ( 即枯草芽孢杆菌 C-36) 的倍同时, 对两株重组菌进行诱导表达后, 收集不同诱导时间的上清液进行 SDS-PAGE 分析, 结果见图 5 SDS-PAGE 结果显示, 诱导培养 2.5 h 后, 有内切葡聚糖酶表达, 其含量也随诱导时间的增加而

652 HEREDITAS (Beijing) 2008 第 30 卷增加, 而阳性对照菌株 WH320-pHIS1525 未见目的条带的产生, 说明目的基因成功地转入了芽孢杆菌 WH320 中并实现分泌表达, 表达产物的分子量约为 55.

5 重组内切葡聚糖酶的性质研究 2.5.1 内切葡聚糖酶最适反应 ph 以不同 ph 值的缓冲液配置浓度为 1% 的底物 (CMC-Na), 取 1 ml 不同 ph 值的底物与 100 μl 适当稀释的酶液 50 条件下反应 30 min,

0 范围内酶活可达最高酶活的 80% 以上图 4 重组菌株的刚果红染色分析 1: 阳性对照菌株 WH320-pHIS1525; 2: 重组菌株 WH320- phis1525-g7 Fig.

6 The optimal ph of recombinant endoglucanase 2.5.

0) 易发生变性, 其酶活力不到最高酶活的 40%, 在 ph 4.5~10.0 之间能保持在最高酶活力的 80% 以上图 5 重组内切葡聚糖酶的 SDS-PAGE 分析 1: 诱导之前 ; 2~4: 诱导 2.

4 652 HEREDITAS (Beijing) 2008 第 30 卷增加, 而阳性对照菌株 WH320-pHIS1525 未见目的条带的产生, 说明目的基因成功地转入了芽孢杆菌 WH320 中并实现分泌表达, 表达产物的分子量约为 kda, 与预测的目的基因表达产物分子量 ( 约 55 kda) 相符合图 3 Fig. 3 重组质粒 phis1525-g7 图谱 The map of recombinant plasmid phis1525-g7 2.5 重组内切葡聚糖酶的性质研究内切葡聚糖酶最适反应 ph 以不同 ph 值的缓冲液配置浓度为 1% 的底物 (CMC-Na), 取 1 ml 不同 ph 值的底物与 100 μl 适当稀释的酶液 50 条件下反应 30 min, 测得不同 ph 值下的酶活力见图 6 结果表明: 该酶最适反应 ph 值为 ph 6.0, 在 ph 4.5~7.0 范围内酶活可达最高酶活的 80% 以上图 4 重组菌株的刚果红染色分析 1: 阳性对照菌株 WH320-pHIS1525; 2: 重组菌株 WH320- phis1525-g7 Fig. 4 Analysis of recombinant by Congo-red dyeing 1:WH320-pHIS1525; 2: WH320-pHIS1525-G7. 图 6 内切葡聚糖酶的最适反应 ph Fig. 6 The optimal ph of recombinant endoglucanase 内切葡聚糖酶 ph 稳定性将原酶液置于不同 ph 值的缓冲液于 50 保温 30 min, 测定残余酶活力, 以最高酶活作为 100%, 结果见图 7 从表中可以看出, 内切葡聚糖酶在酸性环境下 (<ph 4.0) 易发生变性, 其酶活力不到最高酶活的 40%, 在 ph 4.5~10.0 之间能保持在最高酶活力的 80% 以上图 5 重组内切葡聚糖酶的 SDS-PAGE 分析 1: 诱导之前 ; 2~4: 诱导 2.5 h 6 h 9 h 后 ; 5: 阳性对照 ; 6: 标准蛋白分子量 ; 箭头指示 : 内切葡聚糖酶 Fig. 5 Analysis of recombinant endoglucanase by SDS-PAGE 1: Just before inducement; 2 4: 2.5 h, 6 h and 9 h after inducement; 5: Positive control (protoplasts transformed with phis1525); 6: Standard protein molecular weight; arrow: Endoglucanase. 图 7 ph 对酶稳定性的影响 Fig. 7 Effect of ph on the stability of enzyme

5 第 5 期陈惠等 : 内切葡聚糖酶基因在巨大芽孢杆菌中的表达及其酶学性质研究内切葡聚糖酶最适反应温度在最适反应 ph 6.0 下, 将适当稀释的酶液分别在和 90 条件下与底物反应 30 min 后测定各反应酶活力结果表明, 该酶的最适反应温度为 65 ( 图 8) 图 8 内切葡聚糖酶的最适反应温度 Fig. 8 The optimal temperature of recombinant endoglucanase 内切葡聚糖酶热稳定性在 ph 6.8 条件下, 将适当稀释的酶液分别在和 90 条件下保温 30 min, 再在 50 测定残余酶活力结果表明, 在 30 ~65 范围内相对稳定, 可保持在最高酶活的 70% 以上 ( 图 9) 图 9 温度对酶稳定性的影响 Fig. 9 Effect of temperature on the stability of enzyme 3 讨论作为外源重组蛋白的表达与分泌系统, 革兰氏阳性菌巨大芽孢杆菌比其它细菌宿主系统更具优势 [8] 与大肠杆菌相比, 它具有高的蛋白分泌能力且不产内毒素, 与枯草芽孢杆菌相比, 它的质粒稳定且很少或不产生胞外蛋白酶, 使外源蛋白分泌后不会被降解 [9] 从上清液 SDS-PAGE 可以看出, 胞外蛋白除了目的基因产物外, 其余杂蛋白含量相当低, 有利于表达产物的分离纯化近年来, 以巨大芽孢杆菌作为外源蛋白表达系统的研究越来越多, 如葡聚糖蔗糖酶 [8], 葡聚糖酶 [10], Clostridium difficile 毒素 A [11] 均在巨大芽孢杆菌中得到了表达最近还优化了一系列表达载体 ( 如 phis1525 pstrep1525 pstrephis1525 等 ), 使具有亲和标记的重组蛋白利于分离纯化, 并成功的实现了外源蛋白的表达与纯化, 如葡聚糖蔗糖酶 [8] 果聚糖蔗糖酶 [12] 青霉素 [13] 酰胺酶等其独特的优越性是本研究采用巨大芽孢杆菌作为宿主选用 phis1525 作为表达载体的原因信号肽对外源基因分泌表达至关重要, 同一种蛋白酶在不同信号肽的作用下, 即使都能分泌表达, [13] 其分泌效率也会相差甚远 Yang 等研究表明 : 当使用巨大芽孢杆菌的胞外脂酶的信号肽代替来自自身的信号肽时, 可提高青霉素酰胺酶 G 表达量 1.7 倍 ; Nagarajan 选择了枯草杆菌蛋白酶中性蛋白酶芽孢杆菌 RNA 酶和果聚糖蔗糖酶等四种酶的信号肽, 以芽孢杆菌 BE1510 为宿主菌, 分别研究它们对重组链霉抗生素蛋白分泌效果的影响结果表明, 携带四种融合基因的菌株都能有效分泌四聚体链霉抗生素蛋白, 但以用中性蛋白酶信号肽时效率最高 [14] 为提高内切葡聚糖酶分泌量, 本研究选用 phis1525 载体上游的一段自身信号肽与内切葡聚糖酶基因进行融合表达基因工程菌 WH320-pHIS1525-G7 表达的内切葡聚糖酶在 ph 4.5~10.0 范围内相对稳定, 使得它在某些领域有着独特的应用前景近年来碱性纤维素酶在洗涤剂工业上的应用改变了传统的去污机制, 它可以选择性的吸附在棉纤维的非结晶区, 使棉纤维蓬松, 水合纤维素分解, 胶状污垢脱落而利用纤维素酶对纤维素织物进行生物处理后, 可使纺织物蓬松柔软表面光滑, 羽毛棉结明显清除, 织物光泽和色泽鲜艳程度明显改善研究发现, 当使用中性纤维素酶时可以大大降低砂洗过程中出现的回染现象, 因而在纺织业和洗衣业中, 常采用低剂量的内切葡聚糖酶进行各种表面处理随着中性纤维素酶和碱性纤维素酶在棉织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中的成功应用, 基因工程菌 WH320- phis1525-g7 表达的内切葡聚糖酶显示出良好的使

6 654 HEREDITAS (Beijing) 2008 第 30 卷用性能和巨大的经济价值工程菌大罐发酵的菌体密度高, 可提高蛋白 [15] 的发酵产率贾晓娟等已对具有较高苯丙氨酸脱氨酶活性的菌株巨大芽孢杆菌 AS1.127 NJU10 的发酵条件进行研究, 使其酶活最高可达 1070U 本研究中基因工程菌经优化培养后, 胞外上清液中的酶活力可达 889 U, 是出发菌株枯草芽孢杆菌 C-36 的倍因此, 下一步通过发酵条件摸索有望提高内切葡聚糖酶产量, 为其工业化生产奠定基础参考文献 (References): [1] Glazer AN, Nikaido H. Microbial Biotechnology. New York: W.H. Freeman and Company, [2] GAO Feng-Ju, CHEN Hui, WU Qi, LIANG Ru-Yu, HAN Xue-Yi, GUAN Xing-Ying. Selection and identification of cellulase-producing Bacillus C-36. Journal of Sichuan Agricultural University, 2006, 24(2): , 213. 高凤菊, 陈惠, 吴琦, 梁如玉, 韩学易, 官兴颖. 产纤维素酶芽孢杆菌 C-36 的分离筛选及其鉴定. 四川农业大学学报, 2006, 24(2): , 213. [3] Ausubel F, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, Smith JA, Struhl K. Shot Protocols in Molecular Biology, translated by YAN Zi-Ying and WANG Hai-Lin. Beijing: Science Press, 1998, 奥斯伯, 布伦特, 金斯顿, 摩尔, 瑟德曼, 史密斯, 斯楚轭. 精编分子生物学实验指南. 颜子颖, 王海林译. 第二版, 北京 : 科学出版社, 1998, [4] Puyet A, Sandoval H, Lopez P, Aguilar A, Martin JF,Espinosa M. A simple medium for rapid regeneration of Bacillus subtilis protoplasts transformed with plasmid DNA. FEMS Microbiol Lett, 1987, 40(1): 1 5. [DOI] [5] SHEN Xue-Liang, XIA Li-Ming. Studies on screening of cellulase producing bacteria and enzymatic characteristics thereof. Chem Ind Forest Prod, 2002, 22(1): 沈雪亮, 夏黎明. 产纤维素酶细菌的筛选及酶学特性研究. 林产化学与工业, 2002, 22(1): [6] WANG Xiao-Li, GOU Lin. Biochemistry. Sichuan Publishing Group. Sichuan Science & Technology Press, 2005, 王晓丽, 苟琳. 生物化学实验教程. 第一版, 四川出版集团. 四川科学技术出版社, 2005, [7] HAN Xue-Yi, CHEN Hui, WU Qi, LIANG Ru-Yu, GAO Feng-Ju, XU Bing. Optmization of conditions for submerged fermentation of cellulase from Bacillus subtilis C-36. J Sichuan Agri Univ, 2006, 24(2): 韩学易, 陈惠, 吴琦, 梁如玉, 高凤菊, 胥兵. 产纤维素酶枯草芽孢杆菌 C-36 的产酶条件研究. 四川农业大学学报, 2006, 24(2): [8] Malten M, Hollmann R, Deckwer WD, Jahn D. Production and secretion of recombinant Leuconostoc mesenteroides dextransucrase DsrS in Bacillus megaterium. Biotechnol Bioeng, 2005, 89(2): [DOI] [9] Vary PS. Prime time for Bacillus megaterium. Microbiology, 1994, 140(5): [10] Kim JY. Overproduction and secretion of Bacillus circulans endo-beta-1, 3-1, 4-glucanase gene (bglbc1) in B. subtilis and B. megaterium. Biotchnol Lett, 2003, 25(17): [DOI] [11] Burger S, Tatge H, Hofmann F, Genth H, Just I, Gerhard R. Expression of recombinant clostridium difficile toxin A using the Bacillus megaterium system. Bionchem Biophys Res Commun, 2003, 307(3): [DOI] [12] Malten M, Biedendiedk R, Gamer M, Drews AC, Stammen S, Buchholz K, Dijkhuizen L, Jahn D. A Bacillus megaterium plasmid system for the production, export, and one-step purification of affinity-tagged heterologous levansucrase from growth medium. Appl Environ Microbiol, 2006, 72(2): [DOI] [13] Yang Y, Biedendieck R, Wang W, Gamer M, Malten M, Jahn D and Deckwer WD. High yield recombinant penicillin G amidase production and export into the growth medium using Bacillus megaterium. Microb Cell Fact, 2006, 5: 36. [DOI] [14] Nagarajan V, Ramaley R, Albertson H, Chen M. Secretion of the streptavidin from Bacillus subtilis. Appl Environ Microbiol, 1993, 59(11): [15] JIA Xiao-Juan, GUO Li-Yun, LIU Yi, JIAO Qing-Cai. Study of fermentation and properties of phenylalanine deaminase. Fine Chemicals, 2005, 22(11): 贾晓娟, 郭丽芸, 刘毅, 焦庆才. 苯丙氨酸脱氨酶发酵工艺及其酶学性质研究. 精细化工, 2005, 22(11):

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌