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枉桑
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1 微生物学通报 Microbiology China May 20, 2018, 45(5): DOI: /j.microbiol.china 研究报告几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质 * 郑家敏梁燕辉朱凡叶秀云林娟 ( 福建省海洋酶工程重点实验室福州大学福建福州 ) 摘要 : 背景几丁质是自然界中储藏量仅次于纤维素的有机物, 几丁质酶能降解几丁质生成几丁寡糖, 实现废弃物的高值化利用, 目前菌株产几丁质酶能力低限制了它的生产应用目的克隆弧菌 (Vibrio sp.) GR52 的几丁质酶基因, 实现其在大肠杆菌中的异源表达, 对分离纯化的重组几丁质酶进行酶学性质研究方法以弧菌 GR52 菌株基因组 DNA 为模板, 克隆得到几丁质酶基因 GR52-1, 构建重组基因工程菌 BL21(DE3)/pET22b-chiGR52-1, 诱导表达的产物通过 Ni-NTA 树脂纯化后进行酶学性质研究结果重组酶的最适反应 ph 为 6.0, 在 ph 范围内 37 C 保温 1 h 仍能保持 85% 以上的相对酶活力, 具有较好的 ph 稳定性 ; 最适反应温度为 50 C, 在 45 C 保温 1 h 其酶活力基本没有损失, 在 50 C 保温 1 h 其残余酶活力仍达 60%; 在 1 mmol/l 浓度下,Cu 2+ Ca 2+ 对该酶具有促进作用,Hg + 对该酶具有明显的抑制作用 ; 在 5 mmol/l 浓度下,Ni + 对该酶具有一定的促进作用,Mn 2+ Co 2+ Li + Fe 2+ Hg + SDS ( 十二烷基硫酸钠 ) 对该酶具有明显的抑制作用以胶体几丁质为底物时, 动力学参数 K m V max k cat 分别为 0.85 mg/ml 0.19 μmol/(ml min) 和 7.02 s 1 底物特异性分析表明该重组酶能特异性降解几丁质结论重组几丁质酶具有良好的酶学性质, 为几丁质酶的开发应用奠定基础关键词 : 几丁质酶, 弧菌, 克隆表达, 酶学性质 Cloning, expression and characterization of the chitinase gene from Vibrio sp. GR52 ZHENG Jia-Min LIANG Yan-Hui ZHU Fan YE Xiu-Yun LIN Juan * (Fujian Key Laboratory of Marine Enzyme Engineering, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian , China) Abstract: [Background] Chitin is the second most abundant natural resource next to cellulose. Chitinase can catalyze chitin into chitosan oligosaccharide which achieved high value utilization of waste. [Objective] The chitinase gene of Vibrio sp. GR52 was cloned and expressed in Escherichia coli, and the properties of recombinase were characterized. [Methods] The chitinase gene chigr52-1 was cloned from the genomic DNA of Vibrio sp. GR52 and the recombinant strain Foundation items: Regional Demonstration Project of Fujian Provincial Oceanic Economy Innovation and Development (2014FJPT02); Foundation of Fujian Provincial Department of Education (JAT160054) *Corresponding author: Tel: ; ljuan@fzu.edu.cn Received: July 22, 2017; Accepted: October 25, 2017; Published online ( November 07, 2017 基金项目 : 福建省海洋经济创新发展区域示范项目 (2014FJPT02); 福建省中青年教师教育科研项目 (JAT160054) * 通信作者 :Tel: ; ljuan@fzu.edu.cn 收稿日期 : ; 接受日期 : ; 网络首发日期 (

2 1028 微生物学通报 Microbiol. China BL21(DE3)/pET22b-chiGR52-1 was constructed. The recombinase rchigr52-1 was purified by Ni-NTA affinity chromatography and the enzymatic properties were studied. [Results] The optimum catalytic ph of rchigr52-1 was 6.0. It was stabled in the ph range of 5.0 to 10.0 and could maintain more than 85% of its relative activity after incubation at 37 C for 1 hour. The optimum catalytic temperature of the enzyme was 50 C and 60% of enzyme activity was remained after incubation at 50 C for 1 hour. At the concentration of 1 mmol/l, Cu 2+ and Ca 2+ had stimulation on rchigr52-1, while Hg + had significant inhibition. At the concentration of 5 mmol/l, Ni + stimulated the chitinase, while Mn 2+, Co 2+, Li +, Fe 2+, Hg + and SDS inhibited the enzyme. The kinetic parameters K m, V max and k cat of rchigr52-1 were 0.85 mg/ml, 0.19 μmol/(ml min) and 7.02 s 1, respectively. Substrate specificity analysis showed that rchigr52-1 could catalyze chitin specifically. [Conclusion] Recombinant chitinase has good enzymatic properties which provide a theoretical foundation for chitinase applications. Keywords: Chitinase, Vibrio sp., Cloning and expression, Characterization 几丁质 (Chitin) 是由 N- 乙酰 -D- 氨基葡萄糖通过 β-l,4- 糖苷键连接而成的线性多糖 [1] 几丁质是自然界中蕴藏量仅次于纤维素的有机物, 主要存在于真菌细胞壁虾壳蟹壳甲壳动物的外壳和肠道中, 全世界每年能合成 100 亿 t 左右几丁质 [2-4] 几丁质物理性质稳定, 难溶于水碱稀酸和一般有机溶剂, 仅能溶于浓盐酸磷酸等无机强酸中并伴随着严重的降解, 因此很难被有效利用 [5] 随着海洋生物资源的不断开发利用和寡糖生理活性研究的深入, 几丁质寡糖的应用价值逐渐被揭示研究表明, 几丁质降解产物及其衍生物具有调节人体 ph 增强免疫降低血糖血脂抗菌消炎抑制肿瘤生长改善土壤微生物诱导植物抗病等生物活性 [6-14] 几丁质酶作为降解几丁质的工具酶, 具有作用条件温和高效环保酶解副反应少产物安全性高等优点, 将逐步取代传统的酸降解法 [15] 因此, 几丁质酶的开发应用引起了国内外研究者的广泛关注几丁质酶来源广泛, 在细菌真菌放线菌病毒和动植物中均被发现 [2], 目前研究最深入的是微生物几丁质酶虽然产几丁质酶的微生物种类丰富, 但应用到工业生产的菌株仅粘质沙雷氏菌 (Serratia marcescens) 链霉菌(Streptomyces) 和木霉 (Trichoderma) 等少数几类微生物目前已报道的产几丁质酶菌株酶活力普遍较低, 同时几丁质酶对虾壳蟹壳污水等废弃物中的金属离子比较敏感不同来源的几丁质酶, 其酶学性质有所差异, 在分子量最适反应 ph 和温度金属离子的作用等方面也各不相同本文采用基因工程方法克隆几丁质酶基因, 构建重组工程菌 BL21(DE3)/pET22bchiGR52-1, 诱导表达重组酶 rchigr52-1 并进行分离纯化和酶学性质研究, 以期为几丁质酶的开发应用奠定基础 1 材料与方法 1.1 材料菌株和质粒弧菌 GR52 菌株从广西北海红树林底泥中筛选获得 ; 基因克隆宿主菌 Escherichia coli Top10 为本实验室保存菌株 ; 表达宿主菌 Escherichia coli BL21(DE3) 购于 Novagen 有限公司 ; 质粒 pet-22b(+) 购自北京全式金 (TRANS) 有限公司主要试剂和仪器及培养基 Pfu DNA polymerase, 北京全式金 (TRANS) 有限公司 ; 质粒提取试剂盒,OMEGA 公司 ; 限制性内切酶 T4 DNA 连接酶蛋白 Marker,Thermo Fisher Scientific 公司 ;IPTG (Isopropyl β-d- Thiogalactoside),Amresco 公司梯度热循环 PCR 仪, 德国 Eppendorf 公司 ; 凝胶成像仪, 上海培清科技有限公司 ; 电泳仪和电泳槽, 日本 ATTO 公司 ; 高压蒸汽灭菌锅,SHENAN

3 郑家敏等 : 几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质 1029 公司 ; 超净工作台, 苏州安泰空气技术有限公司 ; 隔水式恒温培养箱, 上海一恒科技有限公司 ; 可见分光光度计, 上海精密科学仪器有限公司 ; 高速冷冻离心机, 日本 HITACHI 公司 LB 培养基参照文献 [3] 配制 1.2 实验方法基因克隆设计引物 chigr52-1-f (5 -CATGGATCCGGCA CCTTCAGCTCCGTCAATCGATC-3 ) 和 chigr52-1-r (5 -TCGAAGCTTAGGCGTCTGGCACTCGGC CG-3 ), 以弧菌 GR52 菌株 DNA 为模板,PCR 扩增 chigr52-1 基因 PCR 反应体系 (50 µl):2 Pfu PCR Master 25 µl,chigr52-1-f (20 µmol/l) 1.5 µl, chigr52-1-r (20 µmol/l) 1.5 µl, 基因组 DNA (20 ng/µl) 3 µl,ddh 2 O 19 µl PCR 反应条件 :94 C 5 min;94 C 30 s,58.5 C 30 s,72 C 2.5 min, 30 个循环 ;72 C 10 min;10 C 保存将 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳验证, 回收目的片段表达载体构建将 chigr52-1 基因和质粒 pet-22b(+) 用 BamHⅠ 和 Hind Ⅲ 双酶切, 回收的目的基因片段和酶切质粒用 T4 DNA 连接酶连接, 构建重组表达质粒 pet-22b-chigr52-1, 转化至感受态细胞 Escherichia coli Top10, 挑选阳性克隆子送至 Invitrogen 公司测序, 将序列正确的重组质粒转化至感受态细胞 Escherichia coli BL21(DE3) 序列分析采用 Expasy 中 ProtParam ( org/cgi-bin/protparam/protparam) 预测几丁质酶 chigr52-1 基因的蛋白质分子量以及等电点等 ; 采用 SignalP 4.1 ( 预测蛋白质信号肽以及剪切位点, 为目的蛋白表达提供一定基础条件 ; 利用 SWISS-MODEL ( 在线对几丁质酶进行同源建模重组酶 rchigr52-1 的诱导表达将构建的大肠杆菌工程菌接种到 LB 液体培养基 ( 含 100 mg/l Amp) 中,37 C 200 r/min 振荡培养菌液 OD 600 达到时, 加入 IPTG ( 终浓度为 1 mmol/l) 进行诱导, 以未添加 IPTG 诱导作为对照组将菌液 4 C r/min 离心 5 min, 收集上清液并测定几丁质酶活力重组酶 rchigr52-1 的酶活力检测采用 DNS (3,5- 二硝基水杨酸 ) 法测定还原糖含量 [16] 取 0.1 ml 酶液与 0.9 ml 的 0.5% 胶体几丁质底物, 于 50 C 水浴反应 30 min 后, 加入 1.5 ml DNS 并煮沸 5 min 显色 ; 同时以灭活酶液组作为空白对照 r/min 离心 5 min, 取上清液于 540 nm 测定吸光值, 根据 N- 乙酰 -D- 氨基葡萄糖标准曲线计算还原糖含量酶活力单位定义为 : 在该反应条件下,1 min 催化底物产生 1 μmol N- 乙酰 -D- 氨基葡萄糖所需的酶量定义为 1 个酶活力单位 (U) 重组酶 rchigr52-1 的分离纯化利用中空纤维柱对诱导上清液进行初步浓缩 ; 通过 Ni-NTA 亲和层析对重组酶 rchigr52-1 进行分离纯化,SDS-PAGE 检测纯度重组酶 rchigr52-1 的比活力测定采用考马斯亮蓝染色 (Bradford) 法测定纯化重组酶的蛋白含量 [17-18] ; 在最适反应条件下测定重组酶活力, 计算比活力 ( 酶活力 / 蛋白含量 ) 重组酶 rchigr52-1 的酶学性质研究 (1) 最适反应 ph 和 ph 稳定性研究 : 在 50 C 条件下, 分别测定在不同 ph 缓冲溶液配制的胶体几丁质底物中的重组酶 rchigr52-1 酶活力, 以测得的最高酶活力值为 100% 计算相对酶活力, 确定最适反应 ph; 将重组酶 rchigr52-1 置于不同 ph 缓冲液中 37 C 条件下保温 1 h, 在最适 ph 和温度下测定酶活力, 以未处理组的酶活力为 100% 计算各 ph 下几丁质酶的残余酶活百分比 (2) 最适反应温度和热稳定性研究 : 在最适 ph 条件下, 分别测定在不同温度 ( C) 下的重组酶 rchigr52-1 酶活力, 以测得的最高酶活力为 100% 计算相对酶活力, 确定最适反应温度 ; 将重组酶 rchigr52-1 分别置于不同温度中保温不

4 1030 微生物学通报 Microbiol. China 同时间 ( min), 并在最适 ph 和温度下测定酶活力, 以未处理组的酶活力为 100%, 计算各温度条件下几丁质酶的残余酶活百分比 (3) 不同金属离子及化学试剂对酶活力的影响 : 在最适反应条件下, 比较浓度为 1 mmol/l 和 5 mmol/l 的 16 种金属离子 (Na + K + Li + Ag + Mn 2+ Ca 2+ Co 2+ Cu 2+ Mg 2+ Ni 2+ Fe 2+ Hg 2+ Zn 2+ Pb 2+ Cr 3+ Fe 3+ ) 和 3 种化学试剂 [EDTA ( 乙二胺四乙酸 ) SDS ( 十二烷基硫酸钠 ) β- 巯基乙醇 ] 对重组酶 rchigr52-1 酶活力的影响, 以相同条件下未加金属离子和化学试剂的酶促反应为对照 (4) 重组酶 rchigr52-1 的 K m 值和 V max 值测定 : 配制不同浓度 ( g/l) 的胶体几丁质底物, 在最适反应条件下测定酶活力, 重复 3 次, 计算酶促反应速度, 利用双倒数法求得 K m 值和 V max 值 [19] (5) 酶底物特异性研究 : 分别配制 0.5% ( 质量体积比 ) 的胶体几丁质细粉几丁质虾壳粉壳聚糖羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 底物, 在最适条件下测定重组酶 rchigr52-1 酶活力, 确定该重组酶对不同底物的作用特异性 2 结果与分析 2.1 几丁质酶全长基因调取及序列分析以弧菌 GR52 菌株基因组 DNA 为模板, 设计全长特异性引物进行 PCR 扩增得到一条 bp 左右的片段 ( 图 1) 将该片段测序获得的序列利用 Vector NTⅠ 进行分析, 寻找开放阅读框, 在 NCBI 数据库中进行蛋白序列比对, 确认该序列为完整的几丁质酶全长基因, 记为 chigr52-1 几丁质酶基因 chigr52-1 全长 bp, 编码 850 个氨基酸和 1 个终止密码子, 经预测, 等电点为 4.39, 分子量为 kd 将核酸序列翻译成氨基酸序列, 采用 NCBI 中的 BLASTp 功能, 与数据库中的蛋白序列进行比对在数据库中, 最相似的蛋白是 Chitinase [Vibrio fluvialis] WP 和 WP , 一致性均只有 80%, 因此, 图 1 几丁质酶基因 chigr52-1 的 PCR 扩增电泳图 Figure 1 PCR products of chitinase gene chigr52-1 注 :M:5 000 bp DNA Marker;1:PCR 扩增产物. Note: M: bp DNA Marker; 1: PCR products. chigr52-1 蛋白是一个比较新颖的蛋白 SignalP4.1 在线预测结果表明该蛋白有强信号肽, 信号肽切割位点在第 26 和 27 个氨基酸之间 SWISS-MODEL 在线对几丁质酶 chigr52-1 进行同源模建, 以 3arr.1 作为模型, 对全长 850 个氨基酸的几丁质酶 chigr52-1 第个氨基酸进行结构模拟, 得到一个蛋白质结构 ( 图 2A), 一致性为 79.79% 一般来说, 当 2 个蛋白质序列一致性大于 50%, 其结构上的相似性能够达到 90%; 当 2 个蛋白质序列一致性低于 30% 时, 二者结构上的相似性就较低 [20] 通过 Saves 服务器 ( 和 ProSA [21] (https//prosa.services.came.sbg.ac.at/prosa. php) 对模拟的结构进行了多种参数的检验,ERRAT ProSA Verify-3D 值分别为 %, 表明该蛋白结构是合理的通过 Pymol 软件分析蛋白的静电势分布情况 ( 图 2B), 图中红色部分表示负电, 蓝色部分表示正电

郑家敏等 : 几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质 1031 将诱导和未经诱导的发酵上清液经过中空纤维柱初步浓缩镍柱纯化后得到单一条带 ( 图

33 U/mg 2.3 重组酶 rchigr52-1 的性质分析 2.3.1 最适反应 ph 和 ph 稳定性将 rchigr52-1

0 时, 酶活力基本为 0 ( 图 4A) 将 rchigr52-1 置于不同 ph 缓冲液中 37 C 保温 1 h 并测定残余酶活力,

0 范围内稳定性较好, 能保持 86% 以上的相对酶活图 2 几丁质酶 chigr52-1 蛋白三维结构图 (A) 和表面电势图 (B)

rchigr52-1 诱导结束后, 离心收集上清液测定几丁质酶活力并进行 SDS- PAGE 检测 ( 图 3) 结果发现经过 IPTG

22 kd) 一致, 说明重组几丁质酶基因 chigr52-1 在大肠杆菌中诱导表达成功图 3 SDS-PAGE 分析纯化重组酶

rchigr52-1 注 :M:Protein marker;1: 纯化重组酶 ;2: 经 IPTG 诱导发酵上清液 ;3: 未经 IPTG

5 郑家敏等 : 几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质 1031 将诱导和未经诱导的发酵上清液经过中空纤维柱初步浓缩镍柱纯化后得到单一条带 ( 图 3 泳道 1), 表明重组酶 rchigr52-1 已获得纯化在最适反应条件下测定重组酶 rchigr52-1 比活力为 4.33 U/mg 2.3 重组酶 rchigr52-1 的性质分析最适反应 ph 和 ph 稳定性将 rchigr52-1 置于不同 ph 缓冲液中测定酶活力, 结果表明该重组酶的最适反应 ph 为 6.0; 当 ph<3.0 或 ph>11.0 时, 酶活力基本为 0 ( 图 4A) 将 rchigr52-1 置于不同 ph 缓冲液中 37 C 保温 1 h 并测定残余酶活力, 结果表明该酶在 ph 范围内稳定性较好, 能保持 86% 以上的相对酶活图 2 几丁质酶 chigr52-1 蛋白三维结构图 (A) 和表面电势图 (B) Figure 2 Three-dimensional structure (A) and surface (B) of chigr52-1 力 ; 在 ph 低于 4.0 条件下该酶完全失活 ( 图 4B) 2.2 重组酶 rchigr52-1 的表达与纯化重组工程菌 BL21(DE3)/pET22b-chiGR52-1 经 IPTG 诱导分泌重组酶 rchigr52-1 诱导结束后, 离心收集上清液测定几丁质酶活力并进行 SDS- PAGE 检测 ( 图 3) 结果发现经过 IPTG 诱导的发酵上清液在 90 kd 处出现一条明显的蛋白条带, 与预测的理论分子量大小 (87.22 kd) 一致, 说明重组几丁质酶基因 chigr52-1 在大肠杆菌中诱导表达成功图 3 SDS-PAGE 分析纯化重组酶 rchigr52-1 Figure 3 SDS-PAGE analysis of purified recombinant rchigr52-1 注 :M:Protein marker;1: 纯化重组酶 ;2: 经 IPTG 诱导发酵上清液 ;3: 未经 IPTG 诱导发酵上清液. Note: M: Protein marker; 1: The purified rchigr52-1; 2: Fermentation with IPTG; 3: Fermentation without IPTG. 图 4 重组酶 rchigr52-1 最适反应 ph (A) 和 ph 稳定性 (B) Figure 4 Effect of ph on activity (A) and stability (B) of rchigr52-1

6 1032 微生物学通报 Microbiol. China 最适反应温度和热稳定性将 rchigr52-1 置于不同温度中测定酶活力, 结果表明该重组酶的最适反应温度为 50 C ( 图 5A) 将 rchigr52-1 置于不同温度中保温 1 h 并在最适反应条件下测定残余酶活力, 结果表明该酶在 45 C 以下稳定性较好, 在 50 C 保温 1 h 能保持 60% 以上的相对酶活力, 超过 50 C 酶快速失活 ( 图 5B) 不同金属离子及化学试剂对重组酶 rchigr52-1 的影响测定 16 种不同金属离子及化学试剂在 1 mmol/l 和 5 mmol/l 浓度下对重组酶 rchigr52-1 酶活力的影响 ( 表 1) 结果表明 : 在 1 mmol/l 浓度下,Mn 2+ Co 2+ Li + Hg 2+ Ag + SDS 对该酶具有不同程度的抑制作用, 其中 Hg 2+ 对该酶有强烈的抑制作用, 残余酶活只有 1.2%,Cu 2+ 和 Ca 2+ 对该酶则有 27.8% 和 31.5% 的促进作用 ; 在 5 mmol/l 浓度下,Mn 2+ Co 2+ Li + SDS Fe 2+ Ag + Hg 2+ 对该酶有明显的抑制作用, 其中 Hg 2+ 对该酶的抑制作用为 100%, Ni 2+ 对该酶具有一定的促进作用, 其他离子和化学试剂对该酶没有明显的影响图 5 重组酶 rchigr52-1 最适反应温度 (A) 和热稳定性 (B) Figure 5 Effect of temperature on activity (A) and stability (B) of rchigr52-1 表 1 不同金属离子和化学试剂对重组酶 rchigr52-1 酶活力的影响 Table 1 Effects of different factors on rchigr52-1 activity 试剂 Additives 浓度 Concentration (mmol/l) 相对酶活 Relative activity (%) 浓度 Concentration (mmol/l) 相对酶活 Relative activity (%) Control 100.0± ±0.0 Na ± ±1.0 Mn ± ±5.1 Cu ± ±1.0 Ni ± ±3.4 Mg ± ±4.2 Gr ± ±0.2 Co ± ±3.4 Li ± ±5.0 Ca ± ±2.2 Fe ± ±6.5 Fe ± ±7.6 Hg ± ±0.0 Ag ± ±6.7 Zn ± ±4.6 K ± ±4.0 Pb ± ±3.5 SDS ± ±4.0 EDTA ± ±4.7 β- 巯基乙醇 ± ±1.4 β-mercaptoethanol Note: : Without treatment.

7 郑家敏等 : 几丁质酶基因的克隆表达及酶学性质酶促反应动力学参数测定采用 Linewaeaver-Burk 作图法, 测得重组酶 rchigr52-1 的 V max 为 0.19 μmol/(ml min),k m 为 0.85 mg/ml,k cat 为 7.02 s 1 ( 表 2) 重组酶 rchigr52-1 的底物特异性以 0.5% ( 质量体积比 ) 胶体几丁质细粉几丁质虾壳粉壳聚糖羧甲基纤维素钠 (CMC-Na) 为底物, 测定重组酶在不同底物下的酶活力, 以底物为胶体几丁质的酶活力为 100% 计算其他底物的相对酶活力结果如表 3 所示, 重组酶 rchigr52-1 对胶体几丁质有很高的酶活力, 对细粉几丁质只有 10.9% 的酶活力, 对虾壳粉有微弱的酶活力, 对壳聚糖和羧甲基纤维素钠没有酶活力可见, 重组几丁质酶 rchigr52-1 只能特异性地降解几丁质, 不能降解壳聚糖纤维素等几丁质结构类似物推测其底物作用方法与纤维素酶不同, 只能特异地与几丁质结合 3 讨论与结论以弧菌 GR52 基因组 DNA 为模板, 克隆几丁质表 2 酶促反应动力学参数 Table 2 Kinetic parameters of enzymatic reaction 几丁质酶 Chitinase V max (μmol/(ml min)) K m (mg/ml) K cat (s 1 ) rchigr LICHI18A [4] 表 3 重组酶 rchigr52-1 的底物特异性 Table 3 Substrate specificity of rchigr52-1 底物相对酶活力 Substrate Relative activity (%) 胶体几丁质 Colloidal chitin 100.0±2.6 细粉几丁质 Powdery chitin 10.9±0.2 虾壳粉 Shrimp shell meal 3.8±1.4 壳聚糖 Chitosan 羧甲基纤维素钠 CMC-Na No detected No detected 酶基因 chigr52-1 全长, 构建工程菌大肠杆菌 BL21(DE3)/pET22b(+)-chiGR52-1 进行诱导表达, 对重组酶 rchigr52-1 进行分离纯化和酶学性质研究重组酶的最适反应 ph 为 6.0, 最适反应温度为 50 C, 在 ph C 以下稳定性较好 ; 低浓度 (1 mmol/l) 下 Cu 2+ Ca 2+ 对该酶具有一定促进的作用, 而高浓度 (5 mmol/l) 下 Ni 2+ 则具有促进作用 ; 在 1 mmol/l 和 5 mmol/l 浓度下,Mn 2+ Co 2+ Li + Hg + Ag + 和 SDS 对该酶都具有抑制作用, 其中 Hg + 对该酶的抑制作用为 100% 酶促反应参数 K m V max k cat 分别为 0.85 mg/ml 0.19 μmol/(ml min) 和 7.02 s 1, 底物特异性分析表明该重组酶能特异性 [4] 降解几丁质吕梦圆等采用重组大肠杆菌表达几丁质酶 LICHI18A, 以胶体几丁质作为底物的催化动力学参数 K m V max 分别为 mg/ml μmol/(min mg),k cat 为 s 1 ( 表 2) 相比之下, 本文构建表达的重组几丁质酶 rchigr52-1 具有较好的底物亲和力和较高的催化效率 [3] [22] 陶勇和 Konagaya 等的研究结果表明革兰氏阴性细菌来源几丁质酶的最适反应温度为 C, 最适反应 ph 分别为 4.6 和 5.0, 在 ph 范围内较为稳定 ; 革兰氏阳性细菌来源几丁质酶的最适反应温度为 40 C, 最适反应 ph 为 5.0, [14] 在 ph 范围内较为稳定吕梦圆等研究表明, 重组几丁质酶在大肠杆菌中表达的最适反应温度和 ph 分别为 37 C 和 3.8, 在 35 C 以下热稳定 [23] 性较好 Huo 等从 Aeromonas veronii B565 中克隆到一条产几丁质酶基因并成功表达, 重组酶的最适反应温度和 ph 分别为 40 C 和 6.0, 在 50 C 下保温 1 h 剩余酶活力仅为 20%, 在 ph 范围内稳定性较好相比之下, 本文构建表达的重组几丁质酶 rchigr52-1, 具有较高的最适反应温度 (50 C) 和良好的热稳定性 ( 在 50 C 下保温 1 h 仍能保持 60% 以上的相对酶活力 ), 并具有宽广的 ph 作用范围 (ph ), 而且专一性强, 这可能与蛋白表面电势有关, 为拓宽几丁质酶的应用奠定了良

8 1034 微生物学通报 Microbiol. China [24] 好的基础 Hao 等研究表明, 几丁质酶 CHI Ⅰ 和 CHI Ⅱ 蛋白结构稳定, 表面具有较多的碱性氨基酸, 可以吸收负电荷, 对其稳定性起到了重要的作用 REFERENCES [1] Hao ZK, Cai YJ, Liao XR, et al. Optimization of nutrition factors on chitinase production from a newly isolated Chitiolyticbacter meiyuanensis SYBC-H1[J]. Brazilian Journal of Microbiology, 2012, 43(1): [2] Wang ZW, Liu ZM. Advance in study and application on chitinase produced by microbes[j]. Letters in Biotechnology, 2006, 17(3): (in Chinese) 王治伟, 刘志敏. 微生物几丁质酶研究进展 [J]. 生物技术通讯, 2006, 17(3): [3] Tao Y. Identification of a chitinase-producing bacterial strain, characterization, gene cloning and expression of the chitinase[d]. Chengdu: Doctoral Dissertation of Sichuan University, 2006 (in Chinese) 陶勇. 一株产几丁质酶细菌的鉴定酶的性质及其基因的克隆与表达 [D]. 成都 : 四川大学博士学位论文, 2006 [4] Lv MY, Shi JX, Xia X, et al. Enzymatic properties of chitinase from recombinant Escherichia coli with different substrates and analysis of hydrolysates[j]. 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