2013,33(6) 卢婵等 :L 谷氨酸氧化酶的克隆表达纯化及酶学性质研究方法 LGOX 基因的克隆根据 Streptomycessp.X 在 GenBank 中登记的 L 谷氨酸氧化酶基因序列, 设计引物进行 PCR 扩增 : 引物 A:5 CCACAC

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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2013,33(6):38 44 L 谷氨酸氧化酶的克隆表达纯化及酶学性质研究卢婵郑璞孙志浩 ( 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室无锡 ) 摘要为提高微生物产 L 谷氨酸氧化酶水平, 将 Streptomycessp.X 的 L 谷氨酸氧化酶基因 (LGOX) 与表达载体 pet28a 连接, 导入 E.coliBL21(DE3), 实现 LGOX 的高效表达采用 HisTrap TM FF 亲和层析柱对重组 L 谷氨酸氧化酶进行纯化, 并对纯酶的酶学性质进行了研究结果表明 : 在 IPTG 终浓度为 0.4mmol/L 下,30 诱导 6h, 可以获得比酶活为 1.1U/mg 的粗酶液 ; 重组酶的最适反应温度和 ph 分别为 37 和 5.0;K m 值为 2.12mmol/L,V max 为 1.06μmol/min mg, 对 L 谷氨酸具有专一性 ; 具有良好的应用前景关键词 L 谷氨酸氧化酶克隆表达酶学性质中图分类号 Q786 L 谷氨酸氧化酶 (EC ) 是以 FAD 为辅酶的一种黄素酶, 能在不添加外源性辅助因子的条件下氧化 L 谷氨酸脱氨, 生成氨 α 酮戊二酸和过氧化氢 [1] 根据氧气的消耗量或过氧化氢的生成量, 可以用于检测 L 谷氨酸及其相关偶联反应在临床生化检验中,L 谷氨酸氧化酶可用于检测谷丙转氨酶谷草转 [2] [3] 氨酶和 γ 谷氨酰基转移酶活性以及血氨肌酐等含量在生物传感器中, 将 L 谷氨酸氧化酶固定在不同载体上 [4 5], 并结合流体注射分析系统 [6] [7] 微渗析等技术, 使得 L 谷氨酸含量的测定方便快速具有高准确度因而高活力酶学性质稳定的 L 谷氨酸氧化酶是其大规模应用不可缺少的关键因素 [8] 1983 年,Kamei 等在 Streptomycesviolascens 中首次发现了 L 谷氨酸氧化酶, 将其归类于黄素酶类, 并对 [9] 氧化 L 谷氨酸形成的产物进行了证实 Kusakabe 等从 Streptomycessp.X 中获得底物特异性更好的 L [10] 谷氨酸氧化酶 2009 年,Arima 等对来源于 Streptomycessp.X 的 L 谷氨酸氧化酶晶体结构进行了分析, 指出了其与 L 氨基酸氧化酶晶体结构的不 [11] 同之处 2001 年,Chen 等将来源于 Streptomyces platensisntu3304 的 L 谷氨酸氧化酶在 Streptomyces 收稿日期 : 国家 863 计划资助项目 (2006AA ) 通讯作者, 电子信箱 :zhengpu@jiangnan.edu.cn lividans66 中进行了表达, 并根据 N 端氨基酸序列分析 [12] 了前体多肽的亚基顺序 2003 年,Arima 等将 Streptomycessp.X 的 L 谷氨酸氧化酶基因在 E. colijm109 中进行表达, 并采用金属内肽酶对重组酶进行水解使得其酶学性质接近于原始菌株的 L 谷氨酸氧化酶国内华东理工大学徐水清等 [13] 李青山等 [14] [15] 北京农业工程大学的沈群和山东省科学院生物研究 [16] 所李玲等先后从土壤中筛选菌株, 并结合传统选育方法提高菌株产酶能力, 但效果不明显,L 谷氨酸氧化酶活性较低 ( 小于 0.2U/mg 蛋白 ), 分离纯化成本昂贵, 实际应用受到影响本文将 L 谷氨酸氧化酶基因在 E.coli21(DE3) 中进行克隆表达和纯化, 并对重组酶纯酶性质进行了初步研究, 以期实现 L 谷氨酸氧化酶的高效生产 1 材料与方法 1.1 材料菌种和质粒 Streptomycessp.X E.coli JM109 E.coliBL21(DE3) 由本实验室保藏 ; 克隆载体 pmd18 T 购自 TaKaRa 公司 ; 表达载体 pet 28a 购自 Novagen 公司工具酶和试剂限制性内切酶 T4DNA 连接酶购自宝生物工程 ( 大连 ) 有限公司 ;PCR 相关产品购自广州东胜生物科技有限公司 ; 其他试剂为国产分析纯

2 2013,33(6) 卢婵等 :L 谷氨酸氧化酶的克隆表达纯化及酶学性质研究方法 LGOX 基因的克隆根据 Streptomycessp.X 在 GenBank 中登记的 L 谷氨酸氧化酶基因序列, 设计引物进行 PCR 扩增 : 引物 A:5 CCACACCGGGGCCGAATTCATGAACG AGAT 3 (EcoRⅠ) 引物 B:5 GCGAAGCTTGATCATGACGTCAGTGCT TCCTCTCGCATC 3 (HindⅢ) 将扩增获得的 LGOX 基因片段进行 PCR 产物纯化后, 连接 pmd18 T 载体, 转入 E.coliJM109 中, 将阳性克隆子送生工生物 ( 上海 ) 有限公司进行测序将重组质粒命名为 pmd18t LGOX LGOX 基因表达载体的构建将克隆载体 pmd18t LGOX 和表达载体 pet28a 分别用 EcoRⅠ 和 HindⅢ 双酶切后, 割胶回收 LGOX 基因和 pet28a 载体用 T4 连接酶于 16 下过夜连接, 将连接产物转入 E.coliBL21(DE3) 中, 涂布 LB/Kan 平板 37 培养, 阳性重组子采用菌落 PCR 和质粒双酶切进行鉴定重组质粒命名为 pet28a LGOX 重组 LGOX 在大肠杆菌 BL21 中的诱导表达将含有 pet28a LGOX 的重组菌接入 LB 培养基中 37 培养至 OD 660 约为 0.6 时, 分别加入不同终浓度的 IPTG, 于不同温度下诱导培养不同时间考察 IPTG 终浓度 ( mmol/L) 诱导温度 ( ) 和诱导时间 ( h) 对 LGOX 表达的影响重组蛋白的纯化按照优化后的表达条件培养菌体, 冷冻离心收集菌体, 用 A 液 (20mmol/L 磷酸钠,500mmol/LNaCl,5mmol/L 咪唑,pH8.0) 悬浮, 超声破碎 ( 功率 285W, 超声 1s, 间歇 3s, 共 10min) 收集上清采用 HisTrap TM FF 亲和层析柱纯化重组蛋白, 用 B 液 (20mmol/L 磷酸钠,500mmol/LNaCl,500 mmol/l 咪唑,pH8.0) 梯度洗脱, 收集活性部分纯化后的 LGOX 采用 SDS PAGE 检测蛋白纯度 LGOX 酶活的测定 1ml 反应体系中包括 U/L 辣根过氧化物酶,1.0mmol/L4 氨基安替吡啉,17.5mmol/L 苯酚,10mmol/LL 谷氨酸 0.05mol/ LpH6.0 磷酸缓冲液和适量酶, 于 37 下反应 10min, 测定其在 520nm 下的吸光值变化以吸光值的变化来表示 L 谷氨酸氧化酶的酶活力大小一个酶活力单位定义 :37 下 1min 反应生成 1 μmol 过氧化氢所需的酶量 LGOX 纯酶酶学性质的研究 (1) 最适反应温度和温度稳定性按照酶活测定方法, 将等量的纯酶于下测定酶活, 以所测的不同反应温度下最高酶活为 100%, 考查不同温度对 LGOX 活性的影响按照酶活测定方法, 将等量的纯酶于 4 最适反应温度 50 下保温 min 后测定剩余酶活, 以初始酶活为 100%, 考查其热稳定性 (2) 最适反应 ph 按照酶活测定方法, 将等量的纯酶置于 ph 为 4.0~9.0(pH4.0~ mol/L 的柠檬酸缓冲液 ;ph6.0~ mol/L 的磷酸钠缓冲液 ) 的缓冲液中, 在最适反应温度下测定酶活, 以所测的不同 ph 下最高酶活为 100%, 考查不同 ph 对 LGOX 活性的影响 (3)K m 值的测定在最适反应温度和 ph 下, 分别测定酶液在底物 L 谷氨酸浓度为 5~14mmol/L 下的反应速度 (4) 底物特异性按照酶活测定方法, 将 L 谷氨酸用不同氨基酸溶液替代, 在最适反应温度和 ph 下, 测定 LGOX 的酶活以 L 谷氨酸为底物测定的活性定义为 100%, 得到不同底物的相对活性 2 结果与讨论 2.1 LGOX 基因的克隆及构建序列分析显示扩增获得的 LGOX 基因为 2106bp, 编码 701 个氨基酸, 酶蛋白分子量大小约为 78kDa 其核酸序列与 GenBank 中登记的基因序列相同 ( 登记号为 AB ) 将克隆载体 pmd18t LGOX 与表达载体 pet28a 分别用 EcoRⅠ 和 HindⅢ 进行双酶切, 胶回收 LGOX 和线性化的 pet28a 进行连接酶切重组质粒验证, 获得大小为 5350bp 和 2106bp 的片段, 分别对应于线性化的 pet28a 和 LGOX 的大小, 结果表明重组质粒构建成功, 将其命名为 pet28a LGOX 如图 1 图 2 所示 2.2 LGOX 基因的表达重组菌经诱导培养后, 菌体破碎液的上清液中检测出 L 谷氨酸氧化酶的活性,SDS PAGE 分析在 72~ 95kDa 间有一条明显的条带 ( 图 3) 表明构建的重组质粒 pet28a LGOX 在 E.coliBL21(DE3) 中得到了表达 Streptomycessp.X 的 L 谷氨酸氧化酶是由 3

40 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No.62013 图 1 重组质粒 pet28a LGOX 双酶切 Fig.

3 40 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 图 1 重组质粒 pet28a LGOX 双酶切 Fig.1Doubledigestionofrecombinant plasmidpet28a LGOX M:DNAmarker;1:DoubledigestionofpET28a LGOX 图 3 SDS PAGE 分析 L 谷氨酸氧化酶在载体中的表达 Fig.3 SDS PAGEanalysisofrecombinant expresionoflgox M:Proteinstandardmarker;1:Supernatantofsonicatedsolution beforeinducted;2:supernatantofsonicatedsolution;3:precipitation ofsonicatedsolution,4:supernatantofthecel freeextract 图 2 重组质粒示意图 Fig.2 Recombinantplasmid h, 结果如图 5 所示, 诱导时间为 6h 时酶活最佳再以此条件为基础, 将诱导温度变为 , 结果如图 6 所示, 诱导温度为 30 时酶活最佳最终确定诱导条件为 IPTG 终浓度为 0.4mmol/L, 诱导时间 6h, 诱导温度 30, 此条件下获得比酶活为 1.1U/mg 的粗酶液个亚基构成的 α 2 β 2 γ 2 结构, 分子量大小为 140kDa [17] 而 Arima [12] 将 Streptomycessp.X 的 L 谷氨酸氧化酶进行重组后获得的酶为二聚体, 分子量大小为 75 kda 但该酶经过来自 Streptomycesgriseus 的金属内肽酶水解后, 恢复了 α 2 β 2 γ 2 结构本研究重组的 L 谷氨酸氧化酶大小在 72~95kDa 之间, 很可能也是因为表达体系中缺少金属内肽酶, 使得 L 谷氨酸氧化酶的结构发生了变化此外, 由图 3 中的第 3 第 4 泳道可以看出, 诱导后菌体破碎沉淀中含有部分 L 谷氨酸氧化酶, 但以包涵体的形式存在 ; 诱导后发酵液上清中基本检测不到 L 谷氨酸氧化酶的存在故该系统表达的 L 谷氨酸氧化酶基本全分泌在细胞内 2.3 表达条件的优化按照节所述方法培养 E.coliBL21(DE3)/ pet28a LGOX, 加入终浓度为 mmol/liptg, 于 30 下诱导培养 4h 后测定酶活, 结果如图 4 所示, 在 IPTG 终浓度为 0.4mmol/L 时诱导效果最佳故以此条件为基础, 将诱导时间变为图 4 IPTG 浓度对 LGOX 表达的影响 Fig.4 EfectofIPTG concentrationonlgoxactivity 图 5 诱导时间对 LGOX 表达的影响 Fig.5 EfectofinducingtimeonLGOXactivity

2013,33(6) 卢婵等 :L 谷氨酸氧化酶的克隆表达纯化及酶学性质研究 41 图 6 诱导温度对 LGOX 表达的影响 Fig.6 EfectofinducingtemperatureonLGOXactivity 图 8 温度对 LGOX 活性的影响 Fig.8 EfectoftemperatureofLGOX 2.

4 2013,33(6) 卢婵等 :L 谷氨酸氧化酶的克隆表达纯化及酶学性质研究 41 图 6 诱导温度对 LGOX 表达的影响 Fig.6 EfectofinducingtemperatureonLGOXactivity 图 8 温度对 LGOX 活性的影响 Fig.8 EfectoftemperatureofLGOX 2.4 LGOX 的纯化由于 pet28a 载体自身带有 His 标签, 采用 HisTrap TM FF 亲和层析柱对重组 LGOX 蛋白进行纯化可以达到方便迅速的目的如图 7 所示, 粗酶液经亲和层析一步纯化后获得单一的蛋白条带, 纯化后 LGOX 比酶活为 2.1U/mg, 蛋白纯化倍数为 1.9 倍图 9LGOX 在不同温度下的稳定性 Fig.9 ThermalstabilityofLGOX 图 7 SDS PAGE 分析重组 L 谷氨酸氧化酶 HisTrap TM FF 亲和层析 Fig.7 TheSDS PAGEanalysisofLGOXfrom HisTrap TM FFafinitychromatography M:DNAmarker;1:Beforepurification;2:Afterpurification [17] 为 9.0 时, 酶活基本丧失 Kusakabe 等报道的 Streptomycessp.X 的 L 谷氨酸氧化酶的最适 ph 为 7.0~8.0, 在 ph 为 5.0 下, 酶活仅保留 60% 本重组酶的最适 ph 向低 ph 偏移在谷氨酸发酵和提取的过程中, 溶液均呈酸性 L 谷氨酸氧化酶的耐酸性更利于发酵过程中检测 L 谷氨酸的含量 2.5 LGOX 纯酶酶学性质最适反应温度和温度稳定性由图 8 可以看出, 在 20~37 下随温度的升高, 酶活也逐渐升高 ; 当温度高于 37 后, 酶活开始下降, 故最适反应温度为 37 此外, 将该酶在下保温, 如图 9 所示, 该酶在 37 下保温 2h, 能维持其 70% 以上的酶活 ; 在 50 下保温 10min, 酶活只为原来的 15% 左右, 保温 30min 后, 酶活基本丧失最适反应 ph 由图 10 可知, 在最适反应温度下,LGOX 活性随 ph 的升高而升高,pH 为 5.0 时酶活最高, 为最适反应 ph;ph 大于 5.0, 酶活逐渐降低,pH 图 10 ph 对 LGOX 活性的影响 Fig.10 EfectofpH onlgox K m 值的测定根据结果分别计算 1/V 和 1/[S], 并按照 Lineweaver Burk 双倒数法作图 ( 图 11), 得到 LGOX 的 K m 值为 2.12 mmol/l,v max 为 1.06 μmol/min mg 底物特异性由表 1 可知,LGOX 除对 L 谷氨酸作用, 对谷氨酰胺有微弱作用外, 对其它测试的氨基酸没

5 42 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No 表 1 LGOX 底物特异性分析 Table1 ThesubstratespecificityofLGOX 图 11 重组 L 谷氨酸氧化酶的 Lineweaver Burk 曲线 Fig.11 Lineweaver BurkplotofLGOX 有反应而 Streptomycessp.X 的 L 谷氨酸氧化酶除作用于 L 谷氨酸外, 对天冬氨酸有微弱反应 Utsumi [18] 等的研究表明, 酶蛋白的 Arg305 位点跟酶与底物侧链相互作用有关重组酶结构的改变也可能使得 Arg305 位点的空间结构发生变化, 影响其对底物的特异性 Aminoacid Relative activity% Aminoacid Relative activity% 100 L glutamine 0.27 Methionine 0 Asparagine 0 Alanine 0 Phenylalanine 0 Lysine 0 Arginine 0 Cysteine 0 Cystine 0 Tyrosine 0 Glycine 0 Histidine 0 Ornithine 0 Serine 0 Tryptophan 不同来源的 L 谷氨酸氧化酶的比较由表 2 可知 : 来源于野生菌株的 L 谷氨酸氧化酶酶活力普遍偏低, 重组菌其酶活力明显有大幅度的增加, 其最适温度和 ph 出现漂移通过对其晶体结构的改造可进一步提高其酶活性及稳定性表 2 不同来源的 L 谷氨酸氧化酶的结构与性质 Table2 StructureandpropertiesoftheLGOXfrom diferentsources Strains Crude enzyme activity (U/mg) Protein mas (kda) Substrate specificity Optimum ph Optimum temperature K m (mmol/l) References Streptomycesviolascens Streptomycessp.X EscherichiacoliJM Escherichiacoli BL21(DE3) Streptomycessp.p Streptomyces endus Streptomycessp.18G Streptomycessp.Z L glutamine L asparagine L asparagine L glutamine L glutamic acid L glutamic acid D glutamicacid L glutamic acid (pH5.0) 3.3(pH6.8) [8] (pH7.4) [10] (pH6.0) 0.23(pH6.0) 35(pH7.4) 5.0(pH7.4) [12] (pH5.0) Thisstudy (pH6.0) [14] (pH7.0) [19] [20] (pH7.4) [21] EscherichiacoliJM109 和 BL21(DE3) 为含 Streptomycessp.X 119 6LGOX 的重组菌 3 结论本研究成功地将 L 谷氨酸氧化酶基因在 E.coli BL21(DE3) 中进行了表达在 IPTG 终浓度为 0.4 mmol/l 下,30 诱导 6h, 可以获得比酶活为 1.1U/mg 的粗酶液通过对克隆过程表达条件和酶学性质的研究, 重组 L 谷氨酸氧化酶性质与源于 Streptomycessp. X 的天然酶性质基本一致, 且重组菌产酶活性有大幅度的提高, 反映了良好的应用前景参考文献 [1] 毕春元, 李玲, 李敬龙.L 谷氨酸氧化酶的研究进展. 生命科学,2012,24(2):

6 2013,33(6) 卢婵等 :L 谷氨酸氧化酶的克隆表达纯化及酶学性质研究 43 BiCY,LiL,LiJL.ResearchprogresonL glutamateoxidase. ChineseBuletinofLifeSciences,2012,24(2): [2] KameiT, AsanoK, NakamuraS. Determination ofserum glutamate oxaloacetate transaminase and glutamate pyruvate transaminasebyl glutamateoxidase.chemical&pharmaceutical Buletin,1986,34(1): [3] 郑强, 严卫民, 徐东, 等.L 谷氨酸氧化酶的来源和特性及其在生化检验中的应用. 检验医学教育,2003,10(2): ZhengQ,YanW M,XuD,etal.Sourcesandcharacteristicsof the L glutamate oxidase and its application in biochemical detection.chinesejournaloflaboratorymedicine,2003,10 (2): [4]RahmanM M.Fabricationofalow detectionglutamatebiosensor K 3 Fe(CN) 6 mediatedonglutamateoxidaseusingsmart Chips. JournalofMaterialsScienceandEngineeringB,2012,2(1): [5]YuYY,LiuXQ,JiangDW,etal.[C 3 (OH) 2 mim][bf 4 ] Au/Ptbiosensorforglutamatesensinginvivointegratedwithon linemicrodialysissystem.biosensorsandbioelectronics,2011, 26(7): [6] RuiC S,SonomotoK,OgawaH I,etal.A flow injection biosensorsystemfortheamperometricdeterminationofcreatinine: simultaneouscompensationofendogenousinterferents.analytical Biochemistry,1993,210(1): [7] 李陈鑫, 张芬芬, 万巧, 等. 中性红掺杂 SiO 2 纳米粒子修饰的 L 谷氨酸生物传感器在 Ⅰ 型糖尿病模型大鼠脑渗析液分析中的应用. 研究化学传感器,2004,24(4): LiCX,ZhangFF,WanQ,etal.Amperometricsensorbased onneutralred dopedsilica(nrds) nanoparticlesaselectron transfermediatorforthedeterminationofl glutamateinthebrain ofitypediabeticrat.chemicalsensors,2004,24(4): [8]KameiT,AsanoK,SuzukiH,etal.L glutamateoxidasefrom Streptomycesviolascens.Ⅰ. Production, isolation and some properties.chemicaland PharmaceuticalBuletin,1983,31 (4): [9]KusakabeH,MidorikawaY,KuninakaK,etal.Aoccurenceof anewenzyme,l glutamateoxidaseinawheatbrancultureextract ofstreptomycessp.x AgriculturalBiologyandChemistry, 1983,47(1): [10] Arima J, Sasaki C, Sakaguchi C, et al. Structural characterizationofl glutamateoxidasefrom Streptomycessp.X TheFEBSJournal,2009,276(14): [11]ChenCY,WuW T,HuangCJ,etal.Acommonprecursorfor thethreesubunitsofl glutamateoxidaseencodedbygoxgene from Streptomyces platensis NTU3304. Canadian Journal of Microbiology,2001,47(3): [12] Arima J, Tamura T, Kusakabe H, etal. Recombinant expresion,biochemicalcharacterizationandstabilizationthrough proteolysisofanl glutamateoxidasefromstreptomycessp.x TheJournalofBiochemistry,2003,134(6): [13] 徐水清, 李友荣.L 谷氨酸氧化酶产生菌的筛选与产酶条件. 微生物学报,1993,33(4): XuSQ,LiYR.ScreeningofL glutamateoxidaseformingstrains and conditions for enzyme production. Acta Microbiologica Sinica,1993,33(4): [14] 李青山, 李友荣, 闵简书.L 谷氨酸氧化酶高产菌株的快速筛选及诱变育种. 华东化工学院学报,1993,19(2): LiQ S,LiY R,MinJS.BreedingofL glutamateoxidase producingstrainswithmutagenesisandarapidscreeningmethod. JournalofEastChinaInstituteofChemicalIndustry,1993,19 (2): [15] 沈群. 链霉菌 L 谷氨酸氧化酶的发酵条件纯化及其性质的研究. 北京 : 北京农业工程大学,1995. Shen Q. Fermentation conditions, purification and some propertiesofl glutamateoxidasefrom Streptomycessp Beijing:BeijingAgriculturalEngineeringUniversity,1995. [16] 李玲, 毕春元, 李敬龙.L 谷氨酸氧化酶的分离纯化及酶学性质的研究. 中国酿造,2012,1: LiL,BiCY,LiJL.Isolation,purificationandcharacterization ofl glutamateoxidasefrom Streptomycessp. ChinaBrewing, 2012,1: [17]KusakabeH,MidorikawaY,FujishimaT,etal.Purificationand properties of a new enzyme, L glutamate oxidase, from Streptomycessp.X grown on wheatbran. Agricultural BiologyandChemistry,1983,47(6): [18]UtsumiT,ArimaJ,SakaguchiC,etal.Arg305ofStreptomyces L glutamateoxidaseplaysacrucialroleforsubstraterecognition. BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2012, 417(3): [19]BǒhmerA,MülerA,PasargeM,etal.A novell glutamate oxidase from Streptomycesenduspurification and properties. EuropeanJournalofBiochemistry,1989,182(2): [20]WachiratianchaiS.Isolation,purification,andcharacterizationof L glutamateoxidasefromstreptomycessp.18g.electronicjournal ofbiotechnology,2004,7(3): [21]SukhachevaM V,NetrusovA I.Streptomycessp.Z 11 6,a novelproducerofextracelularl glutamateoxidase.microbiology, 2000,69(1):13 16.

7 44 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.33No Cloning,Expresion,PurificationandCharacterizationof L glutamateoxidase LUChan ZHENGPu SUNZhi hao (TheKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology,MinistryofEducation,SchoolofBiotechnology,JiangnanUniversity,Wuxi ,China) Abstract InordertoimprovemicrobialproductionofL glutamateoxidase,thel glutamateoxidasegene (LGOX)fromStreptomycessp.X 119 6wassuccesfulyexpresedbyconnectedtotheexpresionvectorpET28a andthentransformedintoe.colibl21(de3).thehistrap TM FFafinitychromatographycolumnwasusedforthe purificationoflgox.enzymaticpropertiesoftherecombinantlgoxwerealsoinvestigated.resultsshowedthat therecombinantlgox activitycouldreach1.1u/mgattheiptg concentrationof0.4mmol/lat30 for induction6h.theoptimumreactiontemperatureandphwere37 and5.0,respectively.thek m was2.12 mmol/landv max was1.06μmol/min mg.thelgox hadhighsubstratespecificityofwith applicationprospect. Keywords L glutamateoxidase Cloning Expresing Enzymaticproperties 檪檪姜老师信箱檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪蛋白质研讨班学员问 : 姜老师, 您好! 我是您第 9 和 16 期蛋白质分离纯化技术专题研讨班的学员, 想向您请教几个问题在我的实验中, 双水相处理之后, 蛋白质在上相, 其中可能混有 PEG 和盐, 体积也较大 ( 大于上柱体积 ) 请问在上柱之前用什么方法浓缩好呢? 因为 PEG 存在时超滤浓缩很难进行, 是用透析和超滤, 还是进一步用 (NH4) SO4 盐析, 再过分子筛或离子柱呢? 谢谢! 姜老师答 : 学员你好, 高兴收到你的反馈双水相处理后的步骤, 一般需要脱盐, 然后可以通过离子交换来彻底去除 PEG 大分子还可以加入更多的盐, 形成新的双水相来浓缩蛋白质为下相, 甚至可以将蛋白质浓缩为中间相然后再运用前面说的, 脱盐离子交换祝实验顺利!

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

2013,33(6) 卢婵等 :L 谷氨酸氧化酶的克隆表达 纯化及酶学性质研究 方法 LGOX 基因的克隆根据 Streptomycessp.X 在 GenBank 中登记的 L 谷氨酸氧化酶基因序列, 设计引物进行 PCR 扩增 : 引物 A:5 CCACAC

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