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羚韶鱼
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1 微生物学通报 Microbiology China Aug. 20, 2013, 40(8): by Institute of Microbiology, CAS 研究报告马克斯克鲁维酵母羰基还原酶基因的克隆与表达应国清 1 杨岳微 1 梅建凤 1 易喻 1 金志华 (1. 浙江工业大学药学院浙江杭州 ) (2. 浙江大学宁波理工学院生物与化学工程学院浙江宁波 ) 2* 摘要 : 目的研究羰基还原酶基因的克隆表达及其在不对称生物催化中的应用方法对羰基还原酶氨基酸序列进行 BLAST 推导出核苷酸序列, 设计引物, 以马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyce marxianus) CGMCC 全基因组为模板, 通过 PCR 扩增目的片段, 与载体 pet-28a 连接, 转化大肠杆菌获得重组菌 BL21(DE3)-(pET28a-cMCR) 和 Rosetta(DE3)-(pET28a-cMCR) 结果扩增的序列与已报道的 mer 序列有 100% 同源性, 全长 bp, 共编码 345 个氨基酸目的蛋白在 Rosetta(DE3)-(pET28a-cMCR) 得到了高效表达, 大小为 42 kd 该酶最适反应温度为 40 C, 最适反应 ph 是 8, 热稳定性与 ph 稳定性较差 Ca 2+ 对酶活具有明显的激活作用, 且浓度为 0.5 mmol/l 时效果最好重组菌可还原 4- 氯乙酰乙酸乙酯 (COBE) 为 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯 [(S)-CHBE], 光学纯度为 100%, 转化率为 81.0% 重组菌在制备度洛西汀关键中间体(S)- 氮, 氮 - 二甲基 -3- 羟基 -(2- 噻吩 )-l- 丙胺 [(S)-DHTP] 中也得到初步应用结论从菌株马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyce marxianus) CGMCC 中克隆获得了羰基还原酶基因, 在大肠杆菌中成功表达, 并可应用于不对称还原关键词 : 羰基还原酶, 马克斯克鲁维酵母, 不对称还原 * 通讯作者 :Tel: ; : zhking@nit.zju.edu.cn 收稿日期 : ; 接受日期 :

2 1394 微生物学通报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.8 Cloning and expression of Kluyveromyce marxianus gene encoding carbonyl reductase in Escherichia coli YING Guo-Qing 1 YANG Yue-Wei 1 MEI Jian-Feng 1 YI Yu 1 JIN Zhi-Hua 2* (1. College of Phamaceutical Science, Zhejiang Univercity of Technology, Hangzhou, Zhejiang , China) (2. Department of Biological and Chemical Engineering, Ningbo Institute of Technology, Zhejiang University, Ningbo, Zhejiang , China) Abstract: [Objective] The gene encoding carbonyl reductase was cloned and expressed for the synthesis of the chiral drug intermediates. [Methods] Based on the N-terminal amino acid sequence of carbonyl reductase from GenBank, cmcr was cloned from Kluyveromyce marxianus CGMCC and sequenced, an expression vector, pet28a-cmcr containing the full length of cmcr was constructed and introduced into Escherichia coli BL21(DE3) and Rosetta(DE3) to express the enzyme separately. [Results] This gene showing 100% similarity to reported mer contains an open reading frame of bp encoding 345 amino acid residues. CMCR was overexpressed in Rosetta(DE3) with a protein molecular weight of 42 kd. The optimal temperature was 40 C and ph 8. The enzyme has low thermal and ph stability. Ca 2+ activates the enzyme activity, especially when its concentration is 0.5 mmol/l. The asymmetric reduction of 4-chloro-3-oxobutanoate ethyl ester to (S)-4-chloro-3-hydroxyl butanoate ethyl ester (CHBE) with Rosetta(pET28a-cMCR) cells, in which cmcr was expressed, as a catalyst was investigated (100% e.e., 81.0% yield). The application of the cells to the asymmetric reduction of N,N-dimethyl-3-keto-3-(2-thienyl)-1-prapanamine(DKTP) to (S)-N,N-dimethyl-3- hydroxy-(2-thienyl)-1-propanamine [(S)-DHTP] was also attempted. [Conclusion] The gene encoding carbonyl reductase was cloned and expressed successfully in E. coli form Kluyveromyce marxianus CGMCC and can be applied to asymmetric reduction. Keywords: Carbonyl reductase, Kluyveromyce marxianus, Asymmetric reduction 羰基还原酶 (EC ) 是一种以 NADPH 或者 NADH 为辅酶, 催化羰基的不对称还原产生光学活性醇的短链脱氢 / 还原酶光学活性醇是合成手性药物的重要中间体 [1 2], 是目前生物催化与生物转化研究的一个重要目标产物由于羰基还原酶在催化不对称还原时具有效率高反应条件温和反应选择性好污染小等优点 [3], 羰基还原酶在手性医药中间体的合成中具有重要价值 [4] 羰基还原酶广泛分布于细菌放线菌酵母和霉菌等多种微生物, 但是不同微生物中的羰基还原酶在催化活性催化选择性等方面存在较大差异, 因此在自然界中筛选催化活性高催化选择性强的羰基还原酶, 并进行酶的高效重组表达, 已成为手性中间体不对称还原研究的一个 [5] 重要内容 Richte 等从 Neurospora crassa 克隆并表达以 DADPH 为辅酶的羰基还原酶, 经优化

3 应国清等 : 马克斯克鲁维酵母羰基还原酶基因的克隆与表达 1395 制备 (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯, 光学纯度达到 [6] 98%, 产率可达 1.8 mmol/l Wada 等从 Exiguobacterium sp. F42 克隆出一种新型的短链脱氢酶基因, 重组菌生物催化 3- 氧代 -3-(2- 噻吩 ) 丙酸乙酯为 (S)-3- 羟基 -3-(2- 噻吩 ) 丙酸乙酯, 产率 [7] 80%, 光学纯度 >98% Nie 等从平滑假丝酵母 (Candida parapsilosis) 克隆并表达羰基还原酶, 应用于不对称还原潜手性酮化合物本文筛选了一株能够催化羰基的不对称还原反应的马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyce marxianus) CGMCC , 并克隆出一个编码 [8] 羰基还原酶的基因 (cmcr), 该基因与 Kataoka 等 2006 年从 Candida macedoniensis AKU4588 克隆出的 mer (GenBank 登录号 : AB183149) 具有 100% 的同源性在进行重组表达时发现, cmcr 在大肠杆菌 BL21(DE3) 中表达水平较低, 其原因可能与稀有密码子的存在有关 ; 而以大肠杆菌 Rosetta(DE3) 为表达宿主时, 可以显著提高该基因的表达水平利用所表达的重组羰基还原酶进行两种手性药物中间体的催化, 获得了较为满意的结果本研究不仅为手性中间体的合成提供了一种高效的催化酶, 也为真核生物的羰基还原酶基因在大肠杆菌中的高效表达提供了指导 1 材料与方法 1.1 材料菌株和质粒 : 马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyce marxianus) CGMCC 购自中国普通微生物菌种保藏中心 ; 大肠杆菌表达质粒 pet-28a 宿主菌 E. coli BL21(DE3) 和 E. coli DH5α 为浙江大学宁波理工学院生物工程研究所保藏 ; E. coli Rosetta(DE3) 感受态细胞购自百泰克生物公司 ; pmd19-t Vector 购自 TaKaRa Biotech 公司培养基 : PYD 培养基 (1% 酵母膏, 2% 蛋白胨, 1% 葡萄糖 ) 用于培养马克斯克鲁维酵母细胞 ; LB 培养基 (1% 胰蛋白胨, 1% NaCl, 5% 酵母提取物, ph 7.0) 用于培养大肠杆菌以上培养基均在 Pa 灭菌 20 min 工具酶及其他试剂 : 酵母基因组提取试剂盒, Taq DNA Polymerase, Protein Marker, IPTG, X-Gal, 氨苄青霉素, 氯霉素和卡那霉素均购自上海生工公司 ; T4 DNA Ligase, EcoRⅠ, BamHⅠ 限制性内切酶, DNA Marker 和 dntps 购于大连 TaKaRa 公司 ; 4- 氯乙酰乙酸乙酯 (COBE), (S)-4- 氯 -3- 羟基丁酸乙酯 [(S)-CHBE] 和 (R)-CHBE 购自 Sigma 公司 ; N,N- 二甲基 -3- 氧基 -(2- 噻吩 )-l- 丙胺盐酸盐 (DKTP), (S)-N,N- 二甲基 -3- 羟基 -(2- 噻吩 )-l- 丙胺 ((S)-DHTP) 和 (R)-DHTP 购自湖州恒源生物化学技术有限公司 ; 其余试剂均为国产分析纯 1.2 方法 cmcr 的克隆 : 按照酵母基因组提取试剂盒的说明书提取马克斯克鲁维酵母的全基因组, 根据已经报道的马克斯克鲁维酵母羰基还原酶基因设计引物, 在设计上下游引物时, 分别在正义链反义链引入 EcoRⅠ BamHⅠ 酶切位点及保护碱基序列, 引物序列如下 : 正义链 : 5 -cggggatccatgacatttacagtggtgac-3 ; 反义链 : 5 -cgggaattcttacccacggtacgcgcccac-3 PCR 反应条件 : 94 C 4 min; 94 C 1 min, 52 C 40 s, 72 C 2 min, 共 30 个循环 ; 72 C 10 min 克隆质粒 pmd19-cmcr 的构建 : PCR 产物的纯化和连接按照 pmd19-t Vector 使用说明书进行, 连接产物转化到 E. coli DH5α 感受态细胞, 蓝白斑筛选得阳性克隆, 采用 M13-F 和 M13-R 通用引物由上海生工公司完成测序表达载体 pet28a-cmcr 的构建 : 对 DH5α-(pMD19-cMCR) 菌株提取的质粒和载体

4 1396 微生物学通报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.8 pet28a 进行 EcoRⅠ 和 BamHⅠ 双酶切, 纯化回收目的片段后用 T4 DNA Ligase 进行连接 (16 C 过夜 ) cmcr 重组蛋白的诱导表达 : 分别将重组质粒 pet28a-cmcr 利用 CaCl 2 法转化至 BL21(DE3) 和 Rosetta(DE3) 感受态细胞中, 得到两个重组表达菌株 BL21(pET28a-cMCR) 和 Rosetta(pET28a- cmcr) 分别在仅含有 30 mg/l 卡那霉素和同时含有 30 mg/l 卡那霉素与 28 mg/l 氯霉素的两种平板上涂布这两个菌株, 过夜培养后挑取单菌落提取质粒并进行双酶切, 以筛选出含有目的载体的转化子将转化子转接到含对应抗生素的 LB 培养基中, 37 C 振荡培养过夜, 再以 1% 的接种量接到新鲜的 LB 培养基中, 37 C 振荡培养 3 h, 加入 IPTG 至终浓度为 0.3 mmol/l, 32 C 继续培养 9 h r/min 离心 15 min, 收集菌体用生理盐水淋洗 2 次, 加入原体积 1/10 的破胞液 (50 mmol/l 磷酸盐缓冲液, 1 mmol/l PMSF, 300 mmol/l NaCl, 10 mmol/l 咪唑, ph 8.0) 重悬菌体, 反复冻融后进行超声破胞, 离心后分别收集上清液及菌体用于 SDS-PAGE 电泳检测两种重组菌粗酶活的比较 : 酶活测定参照文献 [9] 的方法羰基还原酶辅酶的专一性及底物特异性 : 反应体系中分别选用 NADPH 和 NADH 作为辅酶以考察酶的辅酶选择性, 并测定酶对不同底物 (5 μmol/l) 的催化活力酶反应最适温度及温度稳定性 : 反应体系不变, 选择不同温度进行反应, 以确定最适温度然后, 分别在不同温度对酶进行孵育 1 h, 在最适温度下测定酶的催化活力, 以考察酶的温度稳定性酶反应最适 ph 及 ph 的稳定性 : 反应体系不变, 在最适温度下, 改变反应体系的 ph, 测定酶的最适 ph 然后将重组酶在不同 ph 的缓冲液中进行孵育 24 h, 在最适条件下测定酶的催化活力, 以考察酶的 ph 稳定性金属离子及浓度对酶催化活力的影响 : 在反应体系中加入 0.5 mmol/l 的不同金属离子, 以最适条件下测定酶的催化活力, 以了解金属离子对酶催化活力的影响然后考察在反应体系中添加不同浓度的 Ca 2+ 对重组表达酶催化活力的影响重组菌全细胞催化不对称还原反应性能考察 : 取诱导表达羰基还原酶的重组菌 ( 菌体量为 4 g DCW/L) 进行 COBE (4.0 g/l) 的不对称还原反应条件为 : 30 C 200 r/min 振荡反应 24 h 反应结束后, 用乙酸乙酯萃取产物, 在萃取产物中加入二甲基亚砜作为内标物, 采用气相色谱检测产物浓度以计算产率 ; 为测定产物的光学纯度, 取乙酸乙酯萃取液, 经旋蒸去除乙酸乙酯, 然后用无水乙醇溶解固体产物, 采用正相液相色谱检测产物中 S 型和 R 型产物的含量, 并计算产物的光学纯度 (e.e 值 ) 重组菌对 3.3 g/l DKTP 进行生物催化, 干菌体密度值为 4 g/l 反应条件与生物催化 COBE 相同, 反应 48 h 后, 调节 ph 至 12 左右, 用乙酸乙酯萃取, 旋蒸去除溶剂后用异丙醇溶解产物, 采用液相色谱测定产物中 S 型和 R 型产物的含量 CHBE 气相色谱法检测条件 : 采用 1970F 气相色谱仪, 毛细管柱 SE-30; 载气为氮气 ; 1 μl 进样量 ; 氢离子火焰检测器内标物出峰时间为 min, 产物出峰时间为 min 标准曲线制作 : 配置不同浓度的 CHBE, 加 5 μl 二甲基亚砜内标物, 根据两物质峰面积和含量比值做标准曲线, 曲线函数为 y= x , R 2 = 其中 y 代表产物与内标物含量比值, x 代表产物与内标物峰面积比值 DKTP 转化率的液相色谱法检测条件 : 采用 SinoChrom ODS-BP (200 mm 4.6 mm, 5 μm, 大

应国清等 : 马克斯克鲁维酵母羰基还原酶基因的克隆与表达 1397 连依利特 ) 色谱柱 ; 检测波长 254 nm; 流动相为乙腈 :ph 2.5 KH 2 PO 4 : 三乙胺 =40:60:0.1 (V/V/V); 流速 : 1.0 ml/min; 柱温 : 25 C; 进样 20 μl DKTP 的保留时间为 5.554 min, DHTP 的保留时间为 4.

5 应国清等 : 马克斯克鲁维酵母羰基还原酶基因的克隆与表达 1397 连依利特 ) 色谱柱 ; 检测波长 254 nm; 流动相为乙腈 :ph 2.5 KH 2 PO 4 : 三乙胺 =40:60:0.1 (V/V/V); 流速 : 1.0 ml/min; 柱温 : 25 C; 进样 20 μl DKTP 的保留时间为 min, DHTP 的保留时间为 min CHBE 与 DHTP 光学纯度的液相色谱法检测条件 : 采用 Sino-Chiral OD0B03013-C (200 mm 4.6 mm, 5 μm, 大连依利特 ) 色谱柱, 流速 : 1.0 ml/min, 柱温 : 40 C, 进样 5 μl CHBE 检测条件 : 检测波长 217 nm; 流动相为正己烷 : 异丙醇 : 三氟乙酸 =90:10:0.1 (V/V/V), S 型保留时间为 min, R 型保留时间为 min; DHTP 光学纯度检测条件 : 检测波长 203 nm, 流动相为正己烷 : 乙醇 : 三氟乙酸 =95:5:0.1 (V/V/V), S 型保留时间为 min, R 型保留时间为 min 2 结果与分析 2.1 cmcr 的克隆采用所设计的引物, 以 K. marxianus CGMCC 基因组为模板, 按照设计的条件进行 PCR, 获得了长度为 bp 左右的特异性条带 ( 图 1) 由于该扩增片段长度与 cmcr 的大小相符, 因此推测扩增获得的片段很可能就是目的基因通过 TA 克隆方法, 将该扩增片段和 pmd19-t 相连接, 获得了 pmd19-cmcr 重组载体, 并转化 E. coli DH5α, 挑取阳性克隆 2.2 cmcr 全基因序列的测定结果从挑取的阳性克隆中提取质粒, 并分别以 M13-F 和 M13-R 通用引物对进行序列测定结果发现, 所导入的 PCR 扩增片段是一个全长为 bp 的开放阅读框, 并且其序列与 GenBank 数据库中登录号为 AB 的羰基还原酶基因具有 100% 的同源性该基因序列翻译得到的多肽有 345 个氨基酸残基, 文献报道该酶分子量大小为 42 kd [8] 2.3 表达载体的构建为了表达 cmcr, 利用 pet28a 构建了重组表达质粒 pet28a-cmcr, 如图 2 所示, 重组质粒大小为 bp 然后将重组质粒分别转化 E. coli BL21 和 E. coli Rosetta 获得阳性克隆 BL21(pET28a-cMCR) 和 Rosetta(pET28a-cMCR) 2.4 重组菌 BL21(pET28a-cMCR) 和 Rosetta (pet28a-cmcr) 蛋白的诱导表达分别从 BL21(pET28a-cMCR) 和 Rosetta (pet28a-cmcr) 中提取质粒, 并用 EcoRⅠ 和 BamHⅠ 进行双酶切鉴定结果表明, 酶切产物的大小为 bp ( 图 3), 说明所构建的两个重组表达菌株中含有携带目的基因的重组质粒图 1 PCR 产物电泳结果 Fig. 1 Agrose electrophoresis of PCR fragment 注 : 1, 2: cmcr PCR 电泳结果. Note: 1, 2: Agrose electrophoresis of cmcr PCR fragment. 图 2 表达载体 pet28a-cmcr 构建图谱 Fig. 2 Construction of pet28a-cmcr

1398 微生物学通报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.

但后续工作中验证了 BL21(pET28a-MCR) 重组蛋白也有活性图 3 表达载体酶切电泳图 Fig. 3 Expression vector digested by restrict enzymes Note: 1: BL21(pET28a-cMCR); 2: Rosetta(pET28a-cMCR).

1) 而 Rosetta(DE3) 中恰好补充了大肠杆菌缺乏的 6 种稀有密码子 (AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA) 对应的 trna, 可以有效解决稀有密码子对蛋白质表达的影响, 使得 cmcr 这种克隆自真核生物的基因得以在大肠杆菌中有效表达 2.

6 1398 微生物学通报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.8 将两种重组菌破胞后取上清液和沉淀分别与 4 样品缓冲液混合煮沸 10 min, 做 SDS-PAGE 电泳分析, 如图 4 和图 5 所示发现与不加 IPTG 诱导的两种重组菌比较, 诱导后的 Rosetta (pet28a-cmcr) 重组菌蛋白表达量明显高于 BL21(pET28a-cMCR), 而诱导的 BL21(pET28acMCR) 与未诱导的重组菌相比, 蛋白表达不是很明显, 但后续工作中验证了 BL21(pET28a-MCR) 重组蛋白也有活性图 3 表达载体酶切电泳图 Fig. 3 Expression vector digested by restrict enzymes Note: 1: BL21(pET28a-cMCR); 2: Rosetta(pET28a-cMCR). cmcr 在 Rosetta 中的表达水平显著高于 BL21 的原因可能与该基因中存在大肠杆菌的稀有密码子有关我们用 DNA 2.0 软件分析了 cmcr 中稀有密码子存在情况, 发现该基因中存在多个大肠杆菌的稀有密码子 ( 图 6, 下划线的 3 种密码子在大肠杆菌中丰度小于 0.1) 而 Rosetta(DE3) 中恰好补充了大肠杆菌缺乏的 6 种稀有密码子 (AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA) 对应的 trna, 可以有效解决稀有密码子对蛋白质表达的影响, 使得 cmcr 这种克隆自真核生物的基因得以在大肠杆菌中有效表达 2.5 重组羰基还原酶的专一性和底物的特异性在羰基还原酶催化还原反应中, 还原型辅酶作为氢的供体当体系中加入 NADPH 或者 NADH 均能检测到酶的活性, 以 NADPH 作为辅酶测得酶活设为 100%, 以 NADH 作为辅酶测得相对酶活只有 48% 表明该酶对两种还原型的辅酶虽然均有依赖性, 但是更倾向以 NADPH 作为辅酶图 4 BL21(pET28a-cMCR) 重组蛋白 SDS-PAGE 结果 Fig. 4 SDS-PAGE of the expression of recombinant protein 注 : 1: 未诱导的可溶蛋白 ; 2: IPTG 诱导的胞内可溶蛋白 ; 3: IPTG 诱导的胞内不溶蛋白. Note: 1: Soluble protein without induction; 2: Intracellular soluble protein after IPTG induction; 3: Intracellular insoluble protein after IPTG induction. 图 5 Rosetta(pET28a-cMCR) 重组蛋白 SDS-PAGE 结果 Fig. 5 SDS-PAGE of the expression of recombinant protein 注 : 1: 未诱导的胞内的可溶蛋白 ; 2: 诱导的胞内的可溶蛋白 ; 3: 诱导的胞内的不溶蛋白. Note: 1: Intracellular soluble protein without induction; 2: Intracellular soluble protein after IPTG induction; 3: Intracellular insoluble protein after IPTG induction.

7 应国清等 : 马克斯克鲁维酵母羰基还原酶基因的克隆与表达 1399 ATGACATTTACAGTGGTGACAGGCGCAAATGGCTACATTGCCAAGCACATTCTTAAATCGTTA TTAGAAGATGGTCATCGCGTAATTGGGACCGTGAGAAACAGCAAGAAGGCCGAGGAATTGA AAAGGACTGTCAATGATGAGAATTTGATAGTGGAGTTGGTTCCCGACATGTTAGTGGAAAAC GCATTTGACGAGTTGTTCAAGAAGTACAACACCCAAATCAAGTATGTGTTCCACACTGCGTC CCCGGTTCTCGAGACGTCAAAGGACTATGAGAAAAGCTTGATCGAGCCCGCGATTACCGGTG CGAAGTCAATGGTGGAAGCTATCAGGAAGTACTCATTGACATCGGTCGAGCACATTGTGTATA CGTCATCGATTGCTGCCAGCTCGCTGGAATCTGAGTTTACCGATCCAACGCTCGTTGTCAGCG AGGATAGTTGGAACCCACAAGGTTTGGAAGAGGCAAAGACGGAGTTTTTCACCGCTTACTC GTACTCGAAGAAAATCGCCGAGAAGACGATGTGGGATTTTGTTGAGGAATACAAGGGGACT GAGCACGAAATAAAGCTCACTACGGTCAACCCATGCTTCAACATTGGGCCCCAGGCGTACGA GGCGGACGTTACCGAGACTATGAACTTCACGGCGGAGTTGATCAACCACGTTGTGGAAAGC AAAGTGGGCGATCCGCTTCCTCCAACGAGAATTGTGCCATACGTCGATGTCAGGGACACTGC GAGAGCGCATGTCGATGCGTTGAAGAACGAGAAGCTGGCATTCCAAAGACTGTTGGTGGTG GGGCCCTTTTTGTCGAGCCAGCAGATCTACGATATTGTGAACGAGCGCTTCCCGCAATTGCGG GGCAAGATCGCGCGGGGCGAGCCTGGCAGCGACAAGCTGGACCCTGCGAAGCTGGCCAAGT TCGACCACGCCCGGACCACGCAAGCTCTCGGGTGGGAGTTCACGCCTATCGAGAAGGCTATA GCTGACGAGGTGGCCCAGATCCTCCGTGTGGGCGCGTACCGTGGGTAA 图 6 cmcr 稀有密码子分析 Fig. 6 Rare codons analysis of cmcr 羰基还原酶的催化还原反应属于亲核反应, 其反应时受底物位阻及周围电荷诱导的影响本实验以苯乙酮 4- 氯乙酰乙酸乙酯 N,N- 二甲基 -3- 氧基 -(2- 噻吩 )-l- 丙胺盐酸盐作为底物时测得酶活, 结果见表 1, 以 4- 氯乙酰乙酸乙酯为底物时测得酶活最高, 从底物空间位阻分析, 苯乙酮和 N,N- 二甲基 -3- 氧基 -(2- 噻吩 )-l- 丙胺盐酸盐作为底物, 分子结构中分别含有苯环和噻吩基, 极大阻碍了底物和酶的结构域结合, 说明位阻效应是影响生物催化的一个关键因素 2.6 重组羰基还原酶的最适反应温度及其温度稳定性温度是影响酶活一个关键因素, 如图 7 所示, 所表达的重组羰基还原酶的最适反应温度为 40 C 酶在不同温度下的稳定性不同, 以 4 C 的酶测得酶活为 100%, 从图 8 可以看出, 随着温度的上升, 酶的活力在下降, 当温度为 40 C 时, 酶的活力可以保持原有的 71%, 当温度再升高, 蛋白酶由于变性活力迅速下降, 当在 60 C 中保温 24 h 后酶活只有原酶活的 19.1% 2.7 重组羰基还原酶的最适 ph 及其 ph 稳定性在不同 ph 条件下测得酶的催化活力, 结果如图 9 所示, 随着 ph 的逐渐升高, 酶的活力逐渐增大 ; 最适反应 ph 是 8 如图 10 所示, ph 对酶的稳定性有比较显著的影响, 酶在 ph 7 时比较稳定, 而且 ph 稳定性的范围较窄, 在偏酸或偏碱的环境都会降低酶的活力表 1 重组羰基还原酶底物的特异性 Table 1 The substrate specificity of the carbonyl reductase 底物相对酶活 Substrate Relative activity (%) Acetyl benzene Chloro-3-oxobutanoate ethyl ester 100 N,N-dimethyl-3-keto-3- (2-thienyl)-1-prapanamine 60.0 图 7 温度对重组羰基还原酶催化活力的影响 Fig. 7 Effect of temperature on enzyme activity

8 1400 微生物学通报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.8 图 8 温度对重组羰基还原酶稳定性的影响 Fig. 8 Effect of temperature on the stabilities of enzyme activity 很明显的激活作用其中, 效果最突出的是 Ca 2+, 0.5 mmol/l 的 Ca 2+ 可以使酶的催化活力提高 1.12 倍 ( 图 11) 2.9 重组菌催化的不对称还原反应重组菌全细胞转化 COBE, 结果见表 3, BL21-pET28a 菌株自身也存在与重组蛋白 cmcr 有类似作用的酶类, 但以此菌的菌液作为模板, 以正反义链作为引物 PCR, 未出现条带, 可见 E. coli BL21 菌株自带的酶与 cmcr 编码的酶只是同工酶重组菌 Rosetta(pET28a-cMCR) 的催化转化率是 BL21(pET28a-cMCR) 的 2.5 倍, 但后者单位体积发酵液的酶活力仅是前者的 19.3%, 这可能是由于细胞对底物毒性耐受性及细胞内辅酶图 9 ph 对重组羰基还原酶催化活力的影响 Fig. 9 Effect of ph on enzyme activity 表 2 金属离子对重组羰基还原酶酶活的影响 Table 2 Effect of various metal ions on enzyme activity 金属离子相对酶活 Metal ions Relative activity (%) Blank 100 Fe Na + 60 Ca Cu Zn Mg Mn 图 10 ph 对重组羰基还原酶稳定性的影响 Fig. 10 Effect of ph on the stability of enzyme 2.8 金属离子及浓度对重组羰基还原酶催化活力的影响如表 2 所示, Fe 2+ Na + Zn 2+ Cu 2+ 对酶有不同程度的抑制作用, 而 Mn 2+ Mg 2+ Ca 2+ 对酶有图 11 Ca 2+ 浓度对重组羰基还原酶活的影响 Fig. 11 Effect of Ca 2+ concentration on enzyme activity

9 应国清等 : 马克斯克鲁维酵母羰基还原酶基因的克隆与表达 1401 Table 3 菌株 Bacterial strains 表 3 重组菌生物合成 (S)-CHBE Bioconversion of COBE to (S)-CHBE with E. coli cells harboring pet28a-cmcr 转化率 Conversion ratio (%) 构型 Configuration 对映体过量值 Enanatiomeric excess (e.e., %) BL21-pET28a 1.6 S 100 BL21(pET28a-cMCR) 32.8 S 100 Rosetta(pET28a-cMCR) 81.0 S 100 不同等因素, 使两种细胞生物催化结果和粗酶活测定结果并不成正比例当底物为 4.0 g/l 菌体生物量 ( 干重 ) 为 4.0 g/l 时, Rosetta(pET28acMCR) 重组菌转化 COBE, 结果见图 12, 产物为 S 型, 光学纯度为 100% e.e, 转化率为 81.0% 以 3.3 g/l DKTP 为底物, 10 g/l 的葡萄糖作为共底物, Rosetta(pET28a-cMCR) 菌体生物量 ( 干重 ) 4.0 g/l, 转化 48 h 后, 液相检测结果如图 13 所示, 产物为 S 型, 光学纯度为 97.5% e.e, 转化率为 41.7% 重组菌对两种底物催化结果与酶对底物专一性的结果成正相关, 说明位阻效应是影响生物催化的一个关键因素图 13 Rosetta(pET28a-cMCR) 生物合成 (S)-DHTP 的液相色谱图 Fig. 13 Bioconversation of DKTP by whole cells of Rosetta(pET28a-cMCR) 注 : A: DKTP 转化率的液相色谱图 ; B: (S)-DHTP 构型及对映体过量值的液相色谱图. Note: A: Conversion ratio of DKTP determined by HPLC; B: Configuration and enantiomeric excess of (S)-DHTP determined by HLPC. 3 讨论图 12 Rosetta(pET28a-cMCR) 生物合成 (S)-CHBE 的色谱图 Fig. 12 Bioconversation of COBE by whole cells of Rosetta(pET28a-cMCR) 注 : A: CHBE 产率的气相色谱图 ; B: (S)-CHBE 构型及对映体过量值的液相色谱图. Note: A: Yield of CHBE determined by GC; B: Configuration and enantiomeric excess of (S)-CHBE determined by HLPC. 从马克斯克鲁维酵母 (Kluyveromyce marxianus) CGMCC 克隆得到了以 NADPH 为辅酶的羰基还原酶基因 (cmcr) 该基因在大肠杆菌 BL21 中的表达水平较低, 且表达水平受温度 IPTG 浓度和诱导时间长短的影响 ; 而换用 Rosetta(DE3) 作为宿主后, 该基因的表达水平得到了显著提高导致两种宿主的表达水平存在显著差异的原因可能是 cmcr 基因中存在多个大肠杆菌的稀有密码子, 影响了该基因在大肠杆菌中的翻译效率, 降低了表达水平解决稀有密码子的一个常规方法是进行密码子优化但由于该基因中存在多个稀有密码子, 采用密码子优化方法

10 1402 微生物学通报 Microbiol. China 2013, Vol.40, No.8 需要进行多个碱基位点的突变, 操作较为复杂, 工作量大, 周期长本研究采用 Rosetta(DE3) 作为宿主, 利用该菌株具有编码多个稀有密码子对应 trna 的特点, 简单却有效地提高了目的基因的表达水平这不仅证明了影响马克斯克鲁维酵母的羰基还原酶基因在大肠杆菌中进行重组表达时的确存在稀有密码子的问题, 而且也为其他真核基因在大肠杆菌中高效表达提供了一种可参考的方法此外, 该羰基还原酶基因在大肠杆菌中的有效表达, 也为利用羰基还原酶进行手性醇的工业化生产奠定了基础参考文献 [1] Xu GF, Du YX, Chen B, et al. Investigation of the enantioseparation of basic drugs with erythromycin lactobionate as a chiral selector in CE[J]. Chromatographia, 2010, 72(3/4): [2] Perrone MG, Santandrea E, Scilimati A, et al. Diastereo- and enantioselective bioreduction of ethyl-2-(4-chlorophenoxy)-3-oxobutanoate clofibrate analogues by Kluyveromyce marxianus and other whole cell biocatalysts[j]. Asymmetry, 2004, 15(22): [3] Huisman GW, Liang J, Krebber A. Practical chiral alcohol manufacture using ketoreductases[j]. Current Opinion in Chemical Biology, 2010, 14(2): [4] 张玉彬. 生物催化的手性合成 [M]. 北京 : 化学工业出版社, 2002: 10. [5] Richter N, Hummel W. Biochemical characterisation of a NADPH-dependent carbonyl reductase from Neurospora crassa reducing α-and β-keto esters[j]. Enzyme and Microbial Technology, 2011, 48(6/7): [6] Wada M, Yoshizumi A, Furukawa Y, et al. Cloning and overexpression of the Exiguobacterium sp. F42 gene encoding a new short chain dehydrogenase, which catalyzes the stereoselective reduction of ethyl 3-oxo-3-(2-thienyl)propanoate to ethyl (S)-3- hydroxy-3-(2-thienyl)propanoate[j]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, 2004, 68(7): [7] Nie Y, Xiao R, Xu Y, et al. Novel anti-prelog stereospecific carbonyl reductases from Candida parapsilosis for asymmetric reduction of prochiral ketones[j]. Organic & Biomolecular Chemistry, 2011, 9(11): [8] Kataoka M, Hoshino-Hasegawa A, Thiwthong R, et al. Gene cloning of an NADPH-dependent menadione reductase from Candida macedoniensis, and its application to chiral alcohol production[j]. Enzyme and Microbial Technology, 2006, 38(7): [9] 解晴, 吴坚平, 林立, 等. 拟热带假丝酵母中羰基还原酶的纯化及其酶学性质研究 [J]. 高校化学工程学报, 2009, 23(1):

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌