80 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No Polymerase DNAMarker 和蛋白 Marker 均购自 TaKaRa 公司 ; 高纯度质粒小提中量试剂盒购自 TIANGEN 公司 ; 蛋白胨酵母提取物为 Oxoid 公司产品 ;G418

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跪江
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1 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology,2014,34(1):79 85 DOI: /j.cb 人源溶菌酶基因 LYZL4 在毕赤酵母中的重组表达及活性测定李新新陶建军余龙 ( 复旦大学遗传工程国家重点实验室遗传学研究所上海 ) 摘要 LYZL4 是本实验室克隆的一种 c 型人溶菌酶基因, 根据毕赤酵母密码子偏爱性对 LYZL4 基因进行优化设计, 优化后的基因克隆至具有乙醇氧化酶启动子 (AOX1) 的 ppic9k 载体中通过电转化方法整合到甲醇营养型毕赤酵母表达菌株 GS115 基因组上, 再利用不同浓度梯度的 G418 抗性 YPD 固体培养基筛选高拷贝转化子, 经摇瓶发酵后, 其上清液在 SDS PAGE 胶上 14.4kDa 处出现明显的蛋白条带, 该蛋白条带经质谱鉴定证实是人 LYZL4 蛋白以人溶菌酶 (164071U/ mg) 作为标准品, 使用艳红微球菌作为底物, 通过比色法测定重组 LYZL4 溶菌酶蛋白的活性, 结果显示重组人溶菌酶 LYZL4 蛋白具有明显的溶菌活性, 其酶活力可达 38893U/ml 关键词重组人溶菌酶 LYZL4 毕赤酵母溶菌活性中图分类号 Q78 近年来抗生素耐药性成为困扰科学界的重大难题, 如今使用的抗生素药物多为几十年前抗生素物质的衍生物, 由于微生物病毒等所具有的突变性高适应能力强等特点, 导致抗生素始终无法克服耐药性这一问题而人溶菌酶是一类杀菌机制完全不同于抗生素的溶菌蛋白, 其抗菌机制是水解肽聚糖中 N 乙酰胞壁酸和 N 乙酰葡萄糖胺中的 β l,4 糖苷键 [1], 在渗透压作用下导致细菌细胞壁破裂而发生溶菌作用人溶菌酶在人体天然免疫系统中是一种重要的防御物质 [2], 广泛分布于人体各个组织和体液中, 如 : 肝关节软骨血液唾液眼泪等研究发现人溶菌酶有多种生物活性, 如抗菌防御趋药性防止 HIV 病毒感染以及抗肿瘤等作用 [3 7] 人源 LYZL4 溶菌酶是一种在人体附睾中特异表达的免疫活性蛋白, 原位杂交方法显示仅在人体附睾上皮细胞中检测到了其 mrna 分布, 并且集中于附睾头部 [8], 人体附睾具有成熟储存和保护精子的生理功收稿日期 : 修回日期 : 国家重大新药创制科技重大专项项目资助 (2011ZX ) 通讯作者, 电子信箱 :longyu@fudan.edu.cn 能 [9], 这表明 LYZL4 溶菌酶在男性生殖中有着重要的生理学意义关于重组表达人源 LYZL4 溶菌酶的报道很少, 且选择大肠杆菌作为宿主菌, 通过原核系统进行重组表达, 蛋白表达量低, 活性现象不明显 [10] 本文利用真核表达系统毕赤酵母重组表达 LYZL4 蛋白, 毕赤酵母表达系统具有高效表达准确加工转化子遗传稳定的特点, 可以在非选择压力下实现稳定传代, 与原核表达系统大肠杆菌相比, 该体系可直接表达具有生物活性的人溶菌酶蛋白 [11] 根据毕赤酵母密码子偏爱 [12] 性设计人溶菌酶 LYZL4 基因, 构建毕赤酵母真核表达系统, 成功表达具有抗菌活性的 LYZL4 溶菌酶, 为进一步研究其抗菌机制和功能奠定了基础 1 材料与方法 1.1 材料菌种和质粒感受态 E.coliDH5α 和艳红微球菌由本实验室保存,GS115 菌株以及 ppic9k ppic9 载体购自 Invitrogen 公司, 人溶菌酶标准品购自 Sigma 公司工具酶和试剂盒 DNA 限制性内切酶 XhoΙ NotΙ BamH Ι SalΙ T4DNA 连接酶 PyrobestDNA

2 80 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No Polymerase DNAMarker 和蛋白 Marker 均购自 TaKaRa 公司 ; 高纯度质粒小提中量试剂盒购自 TIANGEN 公司 ; 蛋白胨酵母提取物为 Oxoid 公司产品 ;G418 购自上海 Sangon 公司 ;YNB 购自 BD 公司 ;PCR 引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成 ; 其它试剂均为分析纯培养基 LB,YPD,MM,MD,BMGY,BMMY 培养基参考分子克隆实验指南, 其中 BMGY 和 BMMY 培养基中缓冲液 ph 值为方法 LYZL4 基因序列的设计与合成为了获得重组 LYZL4 基因的高效表达, 我们根据毕赤酵母密码子偏好性, 设计和优化了 LYZL4 基因序列, 将部分低频密码子替换成毕赤酵母偏好的高频密码子根据优化后的基因序列, 采用全基因合成的方法进行人工合成, 并克隆至 pgh 载体中作为后续克隆的模板引物设计根据优化后的 LYZL4 基因序列及载体构建策略, 我们设计了如下 3 条引物, 以便将 LYZL4 基因克隆至 ppic9k 载体的 XhoΙ 和 NotΙ 位点 3 条引物序列分别是 :LYZL4 F1:5 GAGGCTGAAGCTT ACATCTTAGGTAGATGTACTGTCG3 ;LYZL4 F2:5 CCG CTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACATC3 ( 下划线为 XhoΙ 酶切位点 );LYZL4 R:5 ATTTGCGGCCGCTT AAAGCTTACATCCGTCTAGCC3 ( 下划线为 NotΙ 酶切位点 ) 重组质粒 ppic9k LYZL4 的构建为了使重组质粒表达出天然的 LYZL4 蛋白序列, 我们设计将 LYZL4 基因序列与 ppic9k 载体中的 Ste13 蛋白酶切识别位点融合以质粒 pgh LYZL4 为模板, 通过 LYZL4 F1 和 LYZL4 R 引物对扩增获得人工合成的 LYZL4 序列以此片段为模板, 通过 LYZL4 F2 和 LYZL4 R 引物对, 将 ppic9k 载体中包含 XhoΙ 酶切位点以及 Kex2 和 Ste13 蛋白酶识别序列引入人工合成的 LYZL4 基因的 5 端由于 ppic9k 载体含有两个 XhoΙ 酶切位点, 无法将 LYZL4 基因直接克隆至该载体的 XhoΙ 和 NotΙ 多克隆位点之间因此, 先将 LYZL4 F2 和 LYZL4 R 引物扩增获得的片段经 XhoΙ 和 NotΙ 双酶切后克隆至 ppic9 载体中, 然后以 ppic9 LYZL4 质粒为模板, 用 5 AOX1 和 3 AOX1 通用引物扩增 5 AOX1 和 3 AOX1 引物之间的片段, 经 BamHΙ 和 NotΙ 双酶切后亚克隆至 ppic9k 载体中, 从而获得 ppic9k LYZL4 质粒 ( 图 1), 并进一步经测序验证插入序列的正确性酵母菌的转化筛选及 PCR 验证取 10μg 经测图 1 ppic9k LYZL4 构建示意图 Fig.1 Theschematicdiagram of PPIC9K LYZL4structure LYZL4:LYZL4gene;pGH LYZL4:cloningtemplatecomposedby pghvectorandlyzl4gene;ppic9 LYZL4:subcloningcomposed byppic9 vectorand LYZL4 gene; ppic9k LYZL4: expresion plasmidcomposedbyppic9kvectorandlyzl4gene 序验证序列正确的 ppic9k LYZL4 质粒, 用 SalΙ 酶线性化回收后, 采用电转化法转化至感受态毕赤酵母 GS115 中, 转化产物涂布在组氨酸缺陷型 MD 固体培养基上,29 培养至长出单克隆转化子挑取单菌落分别对应点在 MD 和 MM 培养基上, 观察比较生长情况挑选 Mut + 表型的克隆再经含 G418(0.25~4.0mg/ ml) 的 YPD 固体培养基筛选出高拷贝转化子挑取较高抗性的 G418 YPD 平板上长势良好的菌落于 4mlYPD 液体培养基中,29 250r/min 摇床培养过夜, 取 1ml 培养液于 1.5ml 离心管中,12000r/min 离心 3min, 弃上清, 置于微波炉中高温 1min, 于 -20 冰箱放置 5min, 重复操作 2 次, 加入 20μl 冰冷的去离子水, 混匀后 12000r/min 离心 3min 吸取上清作为 PCR 验证的模版以 5 AOX 和 3 AOX 为引物扩增酵母总 DNA, 经琼脂糖凝胶电泳鉴定,PCR 产物大小为 900bp 左右的为阳性转化子人溶菌酶基因 LYZL4 的诱导表达将上述经 PCR 验证为阳性的重组毕赤酵母单菌落接种于 4ml YPD 培养基中,29 250r/min 培养过夜取 1ml 菌液接种于 30mlBMGY 培养基中,29 250r/min 摇床培养至 OD 600 =2~4 5000r/min 离心 4mim 收集菌体弃上清, 用 40mlBMMY 培养基重悬沉淀, rpm/min 开始诱导培养, 每隔 24h 取样, 并补加甲醇 ( 终浓度为 1%) 将 96h 诱导上清经 SDS PAGE 凝胶电泳

2014,34(1) 李新新等 : 人源溶菌酶基因 LYZL4 在毕赤酵母中的重组表达及活性测定 81 进行分析鉴定 1.2.6 重组人溶菌酶 LYZL4 活性测定以艳红微球菌作为底物, 通过比色法进行活性测定 [13] 以 Sigma 公司人溶菌酶 (164071U/mg) 为标准品, 用 0.1mol/L ph6.

3 2014,34(1) 李新新等 : 人源溶菌酶基因 LYZL4 在毕赤酵母中的重组表达及活性测定 81 进行分析鉴定重组人溶菌酶 LYZL4 活性测定以艳红微球菌作为底物, 通过比色法进行活性测定 [13] 以 Sigma 公司人溶菌酶 (164071U/mg) 为标准品, 用 0.1mol/L ph6.2 的磷酸盐缓冲液配制成体积为 100μl, 活性分别为 164U,328U,656U,984U,1312U,1640U,1968U 的标准品溶液检测方法如下 : 取待检测液 100μl, 加入 100μl0.1mol/LpH6.2 的磷酸盐缓冲液, 立刻加入底物 ( 艳红微球菌 )100μl,25 精确反应 20min 后立即加入 400μl 乳化剂 (0.1%Brij 35) 终止反应, 反应液 r/min 离心 2min, 吸取上清通过 Nanodrop2000 在 λ=520nm 下测定其吸光值通过标准品的活性与对应吸光值作标准曲线表达上清液使用上述检测方法, 将测得吸光值带入标准曲线, 计算其活性, 酶活力 (U/ml)= 活性 (U)/0.1(ml) 重组 LYZL4 溶菌酶的质谱鉴定取表达上清液, 进行 SDS PAGE 电泳, 染色后割下 14.4kDa 处的蛋白条带, 进行质谱鉴定人溶菌酶 LYZL4 的最适反应温度和热稳定性测定在 ph6.0, 温度 4 ~75 范围内检测人溶菌酶 LYZL4 对微球菌的溶菌活力, 确定酶的最适温度将表达上清液分别置于上述不同温度中 12h 后, 在 37 ph6.0 下检测残余相对酶活力, 确定酶的热稳定性人溶菌酶 LYZL4 的最适 ph 和 ph 稳定性测定在 37 时, 测定人溶菌酶 LYZL4 在 ph 范围内反应的酶活, 确定重组酶的最适 ph 值将发酵上清液分别置于上述 ph 中, 在 4 下放置 16h 后测定酶的残余活力, 确定酶的 ph 稳定性缓冲体系 ph3.6~5. 6 用 NaAc HAc 缓冲液,pH 6.0~8.0 用 KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 缓冲液,pH8.8 用 Tris HCl 缓冲液缓冲液浓度均为 0.1mol/L 2 结果与分析 2.1 LYZL4 基因序列的优化和合成为了获得较高的表达量, 我们根据毕赤酵母密码子偏好性对 LYZL4 基因序列进行了优化设计 LYZL4 成熟蛋白由 127 个氨基酸编码, 我们对其中的 80 个密码子进行了优化, 共有 94 个核苷酸发生了改变,G+C 含量由原来的 51.82% 降低到 40.62%, 与原始序列的同源性为 75.5%( 图 2) 通过全基因合成的方法获得了全长的优化 LYZL4 人工序列, 该合成序列作为表达重组人源 LYZL4 溶菌酶的序列模板图 2 根据毕赤酵母密码子偏好性优化和合成的 LYZL4 序列 Fig.2 OptimizationandsynthesisofLYZL4sequence basedonthecodonsbiasof yeastpichiapastoris LYZL4isthewildtypesequenceandoptiistheoptimizedsequence oflyzl4.optimizedbasesweremarkedwithgray 2.2 重组毕赤酵母表达体系的构建重组质粒 ppic9k LYZL4 的构建以质粒 pgh LYZL4(LYZL4 人工序列由上海捷瑞生物技术有限公司合成并组装到 pgh 克隆载体中 ) 为模板, 经 PCR 扩增获得优化的 LYZL4 序列通过引物 LYZL4 F2 和 LYZL4 R 进一步扩增, 在 LYZL4 片段的 5 端和 3 端分别加上 XhoΙ 和 NotΙ 酶切位点, 经琼脂糖凝胶电泳显示, 在 400bp 左右有明显的目的条带 ( 图 3a) 通过中间载体 ppic9, 将 LYZL4 基因克隆进 ppic9 的 XhoΙ 和 NotΙ 酶切位点之间由于在 ppic9 和 ppic9k 载体的 α factor 起始密码子上游 11 位碱基处存在一个唯一的酶切位点 BamHΙ, 因此可通过 BamHΙ 和 NotΙ 双酶切, 将 ppic9 中 BamHΙ 和 NotΙ 酶切位点之间的片段亚克隆至 ppic9k 载体中相应的位置通过 5 AOX 和 3 AOX 引物扩增质粒 ppic9 LYZL4 中 5 AOX1 和 3 AOX1 引物位点之间的片段, 其大小约 900bp, 经 Bam HΙ 和 NotΙ 双酶切后产生约 750bp 的片段 ( 图 3b), 酶切产物回收后再亚克隆至 ppic9k 表达载体中含 ppic9k LYZL4 质粒的阳性克隆经测序验证, 表明其插入序列完全正确

82 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No.12014 图 3 LYZL4 基因及 ppic9 LYZL4 双酶切验证 Fig.

AOXand3 AOXprimersofrecombinantpPIC9 LYZL4 2.

25mg/ml 和 0.5mg/mlG418 抗性进一步筛选后, 共获得了约 60 个抗性克隆, 取其中 7 个克隆进一步进行 PCR 鉴定, 结果获得了约 900bp 的预期大小的条带 ( 图 4), 说明在这些重组菌株中,LYZL4 基因已经整合到酵母的基因组中图 5 96h 表达产物 SDS PAGE 电泳分析图 Fig.

4 82 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 图 3 LYZL4 基因及 ppic9 LYZL4 双酶切验证 Fig.3 LYZL4geneanddoubledigestionofpPIC9 LYZL4 (a)m:markerdl2000;1:lyzl4gene (b)m:markerdl2000;1:thegenesegmentsbetween5 AOXand3 AOXprimersofrecombinantpPIC9 LYZL4;2:Doubledigestionofgenesegmentsbetween5 AOXand3 AOXprimersofrecombinantpPIC9 LYZL 重组毕赤酵母的转化筛选及 PCR 验证挑取 200 个转化子经 MD 和 MM 固体培养基进行营养型筛选,29 生长 1d, 在两种培养基上生长情况基本无差异的为甲醇利用快型 (Mut + 型 ), 在 MD 平板上生长状况良好, 而在 MM 平板上菌落较小或几乎不生长的为甲醇利用慢型 (Mut s 型 ), 结果大部分转化子为 Mut + 型 Mut + 型转化子经 0.25mg/ml 和 0.5mg/mlG418 抗性进一步筛选后, 共获得了约 60 个抗性克隆, 取其中 7 个克隆进一步进行 PCR 鉴定, 结果获得了约 900bp 的预期大小的条带 ( 图 4), 说明在这些重组菌株中,LYZL4 基因已经整合到酵母的基因组中图 5 96h 表达产物 SDS PAGE 电泳分析图 Fig.5 TheSDS PAGEelectrophoretic analysisofexpresproteinon96h 图 4 表达菌株整合外源片段的鉴定 PCR Fig.4 PCRanalysisofextracelularintegration DNAgeneoftheyeaststrainvector M:MarkerDL2000;1 3:PCRverficationoftransformantsusing5 AOXand3 AOXprimers 2.3 人溶菌酶基因 LYZL4 的诱导表达及活性测定将高拷贝阳性转化子经甲醇诱导表达对 96h 发酵上清液进行 SDS PAGE 电泳分析, 结果如图 5 所示, 在 14.4kDa 左右有明显的特异性目的蛋白条带以人溶菌酶标准品作标准曲线, 结果如图 6 所示通过标准曲线计算发酵上清中蛋白的酶活力, 结果显示,96h 诱导上清在 37 ph6.0 下酶活力达到 38893U/ml 图 6 以人溶菌酶为标准品的酶活标准曲线 Fig.6 Enzymeactivitystandardcurve bythehumanlysozyme 2.4 重组 LYZL4 溶菌酶的质谱鉴定表达蛋白进行经质谱鉴定, 结果如图 7 所示, 有 13 段肽段区域证实目的条带为 LYZL4 蛋白因此, 结合以上结果可以确定, 通过毕赤酵母 GS115 成功表达了活性重组人溶菌酶 LYZL4

2014,34(1) 李新新等 : 人源溶菌酶基因 LYZL4 在毕赤酵母中的重组表达及活性测定 83 图 7 重组 LYZL4 溶菌酶的质谱鉴定结果 Fig.7 TheMsresultoflysozymeLYZL4 2.5 诱导时间对酶活力的影响将阳性转化子进行甲醇诱导表达, 将 24h,48h, 72h,96h,108h 取样上清液在 ph6.

5 2014,34(1) 李新新等 : 人源溶菌酶基因 LYZL4 在毕赤酵母中的重组表达及活性测定 83 图 7 重组 LYZL4 溶菌酶的质谱鉴定结果 Fig.7 TheMsresultoflysozymeLYZL4 2.5 诱导时间对酶活力的影响将阳性转化子进行甲醇诱导表达, 将 24h,48h, 72h,96h,108h 取样上清液在 ph6.0,37 下测定其酶活力, 酶活曲线结果如图 8 所示从图 8 可以看出, 重组人溶菌酶 LYZL4 活力随着诱导时间的延长而增加, 到 96h 时达到最高, 待到 108h 时酶活力明显有所下降这可能是由于随着诱导时间的延长, 酵母菌裂解释放出可降解酶活力的物质图 9 酶的最适温度和热稳定性 Fig.9 Optimum temptureandthermostability ofrecombinantlysozymelyzl4 的酶活, 确定重组酶的最适 ph 值, 结果如图 10 所示, 重组酶在酸性 ph 下反应活性较高, 其最适反应 ph 约为 5.0 对其稳定性检测结果显示, 人溶菌酶 LYZL4 在 ph3.6~8.8,4 放置 16h 后酶活力差别不大, 说明重组酶的 ph 耐受范围较宽图 10 酶的最适 ph 和 ph 值稳定性 Fig.10 Optimum ph andph stability ofrecombinantlysozymelyzl4 图 8 重组 LYZL4 溶菌酶酶活力随诱导时间增加曲线 Fig.8 Activitycurveoflysozyme LYZL4withinductiontime 2.6 人溶菌酶 LYZL4 的最适反应温度和热稳定性在 ph 6.0, 温度为 4 ~75 下检测人溶菌酶 LYZL4 酶活力, 确定酶的最适温度, 结果如图 9 所示最适温度为 45 而在 45 时放置 12h 后, 残余 65% 酶活力, 超过 55 后酶活力急剧下降,65 时完全失活 2.7 人溶菌酶 LYZL4 的最适 ph 和 ph 稳定性在 37 时, 测定人溶菌酶 LYZL4 在 ph3.6~8.8 3 讨论人源 LYZL4 基因是一种人溶菌酶家族基因, 其长度, 预测分子量及其八个形成二硫键的半胱氨酸保守结构符合 c 型溶菌酶的特征, 属于 c 型溶菌酶基因家族免疫组化和原位杂交的方法均显示在人体 16 种组织中仅在睾丸组织中可检测到表达, 且在附睾近端上皮有强的表达最近定性的人体抗菌分子 DEFB18 (ESC42), 免疫组化的方法显示也是在附睾头部表达 [14], 人体抗菌基因 HE2 也是表达于附睾近端 [15], 因此,LYZL4 基因在附睾上皮组织中表达的特异性是否预测着其与男性生殖有着某种相关性有待进一步的研

6 84 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No 究且与 LYZL4 相比, 传统 c 型人溶菌酶 LYZ 基因在 16 种组织中均有较强表达, 这揭示着 LYZL4 和 LYZ 两者在功能方面可能存在差异因此通过基因工程手段表达获取有生物学活性的人溶菌酶 LYZL4 蛋白, 无论是对其功能进行更深入的探讨, 还是作为产品开发都是必需的该研究实现了人溶菌酶 LYZL4 基因在真核表达系统毕赤酵母中的重组表达, 并验证其有明显的抗菌活性首先通过 PCR 方法获取目的基因, 构建 ppic9k LYZL4 重组质粒, 经 SalΙ 线性化质粒后, 电转化至毕赤酵母表达菌株 GS115 中, 通过营养型筛选得到甲醇利用快型, 经抗性筛选得到 2 个拷贝的转化子再利用摇瓶通过每 24h 添加 1% 浓度甲醇进行诱导表达, 表达结果经 SDS PAGE 电泳分析显示, 发酵上清液在 14. 4kDa 大小处有明显的特异性目的条带, 并经质谱方法进一步证实最后表达上清以艳红微球菌作为底物, 通过比色法初步检测其活性, 活性结果显示, 摇瓶发酵活性在 96h 时达到最高, 其最高酶活力为 38893U/ml 重组酶的最适反应温度为 45, 最适 ph 为 5.0, 在 ph 3.6~8.8 范围内有较好的耐受性本文中成功表达的人溶菌酶 LYZL4 蛋白, 补充与完善人溶菌酶家族蛋白种类, 可用于进一步的抗菌谱测定参考文献 [1]JolesP,JolesJ.Whatsnewinlysozymeresearch alwaysamodel system,todayasyesterday.molecularandcelularbiochemistry, 1984,63(2): [2] SimserJA, MacalusoK R, MulengaA, etal. Immune responsivelysozymesfrom hemocytesoftheamericandogtick, DermacentorvariabilisandanembryoniccellineoftheRocky Mountain wood tick, D andersoni. InsectBiochemistry and MoledularBiology,2004,34(12): [3]KlockarsM,RobertsP.Stimulationofphagocytosisbyhuman lysozyme.actahaematologica,1976,55(5): [4] BodanskyO. Blood enzymesin cancerand otherdiseases. AdventureinCancerResearch,1961,6:1 80. [5]LugerT,KokoschkaEM,SagasterP,etal.Serum lysozyme levelsinpatientswithsolidtumors.oncology,1979,36(1): [6]CarusoR A,LaspadaF,CasablancaG,etal.Lysozymeand mucinsingastricadenomas.journalofclinicalpathology,1989, 42(8): [7]Lee HuangS,HuangPL,SunYT,etal.LysozymeandRNases asanti HIV componentsin beta core preparationsofhuman chorionicgonadotropin.proceedingsofthenationalacademyof SciencesoftheUnitedStatesofAmerica,1999,96(6): [8]ZhangKX,GaoR,ZhangH X,etal.Molecularcloningand characterizationofthreenovellysozyme likegenes,predominantly expresedinthemalereproductivesystem ofhumans,belonging tothec TypeLysozyme/Alpha LactalbuminFamily.Biologyof Reproduction,2005,73(5): [9] MooreH D M.Contributionofepididymalfactorstosperm maturationandstorage.andrologia,1998,30(4 5): [10] 张克雄. 人体 LYC4 基因克隆暨 LYC4 LYC3 Cdv 1R 与生殖关系的初步研究. 上海 : 复旦大学,2004. ZhangKX.ThecloningofhumanLYC4geneandpreliminary studyofthe relationsbetween LYC4, LYC3, Cdv 1R and reproduction.shanghai:fudanuniveristy,2004. [11]SharpPM,CoweE.SynonymouscodonusageinSacharomyces cerevisiae.yeast,1991,7(7): [12]CreggJM,VedvickTS,RaschkeW C.Recentadvancesinthe expresionofforeigngenesinpichiapastoris.bio Technology, 1993,11(8): [13] 李春联. 微量溶菌酶比色测定法在临床诊断中的应用. 同济大学学报,2002,23(3): LiCH L.Tracelysozymecolorimetricasayinthediagnosisof clinicalapplication.journaloftongjiuniversity,2002,23(3): [14]LiuQ,HamilKG,SivashanmugamP,etal.Primateepididymis specificproteins: Characterization ofesc42, anovelprotein containing a trefoil like motif in monkey and human. Endocrinology,2001,142(10): [15]HamilKG,SivashanmugamP,RichardsonRT,etal.HE2beta andhe2gamma,newmembersofanepididymis specificfamily ofandrogen regulated protein in the Human. Endocrinology, 2000,141(3):

7 2014,34(1) 李新新等 : 人源溶菌酶基因 LYZL4 在毕赤酵母中的重组表达及活性测定 85 RecombinantHumanLysozymeLYZL4:ExpresioninPichia pastorisanditsantibacterialactivity LIXin xin TAOJian jun YULong (StateKeyLaboratoryofGeneticEngineering,InstituteofGenetics,FudanUniversity,Shanghai ,China) Abstract LYZL4isakindofctypehumanlysozymegeneandclonedbyourlaboratory.Itwasoptimized accordingtotheyeastcodonpreference.thecodesequencesoptimizedlyzl4genewasclonedunderthecontrol ofthealcoholoxidase1 promoter(aox1) inthevectorppic9k andintegratedintothegenomeofthe methylotrophicyeastpichiapastoris(p.pastoris)straings115byelectroporation.thescreeningofmultiple copiesoftransformantswasoperatedonypdmediumaddingdiferentconcentrationofg418geneticin.wecould getthemultiplecopiesafterscreening.aftermethanolinducingbytheflasks,thesupernatantwasanalyzedby SDS PAGEelectrophoresis.Theproteinbandsshowedon14.4kDa.Withhumanlysozyme(164071U/mg)as thestandardandtheredmicrococcusasthesubstrate,theactivityofthehumanlysozymelyzl4wasdetected. TherecombinantproteinofLYZL4showedbactericidalactivitytomicrococcusanditsactivitywasupto38893U/ ml. Keywords RecombinanthumanlysozymeLYZL4 Pichiapastoris Bactericidalactivity

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌

80 中国生物工程杂志 ChinaBiotechnology Vol.34No Polymerase DNAMarker 和蛋白 Marker 均购自 TaKaRa 公司 ; 高纯度质粒小提中量试剂盒购自 TIANGEN 公司 ; 蛋白胨 酵母提取物为 Oxoid 公司产品 ;G418

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