"' 中国生物工程杂志 5 ( /(! + ) (+)( ( 2 34 ) 2 以转化有克隆载体 6''' 或表达载体 , 的 9:% 和.9% 两种大肠杆菌中为对象进行比较研究旨在为鉴定质粒拷贝数和选择合适的宿主细胞提供参考材料和方法材料大肠杆菌 9:% 和.9% 菌株由本实

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唯阳绪
5 years ago
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1 中国生物工程杂志!" "# 多重在质粒拷贝数检测中的应用李媛任长虹吴永红叶巧石锦平屈武斌郑晓飞刘虎岐张成岗军事医学科学院放射与辐射医学研究所蛋白质组学国家重点实验室北京 #% 西北农林科技大学生命科学学院杨凌 & 摘要聚合酶链式反应,- 作为常规分子克隆技术已在分子生物学的各个领域得到广泛应用然而多重,- 技术应用于质粒拷贝数检测的研究尚未见报道为深入探索多重,- 在质粒拷贝数测定中的应用首先利用构建的多重,- 引物设计及评估体系分别针对细菌基因组./0 和质粒载体./0 序列设计多重,- 引物然后以转化有不同质粒载体的大肠杆菌菌液为模板进行多重,- 反应最后利用凝胶成像仪采集图像后进行积分光密度分析以获得质粒的相对拷贝数结果显示通过多重,- 得到的质粒相对拷贝数与 - $),- 和 1 + 的检测结果基本一致说明多重,- 可用于质粒拷贝数的定性检测利用多重,- 技术建立了一种便捷的质粒拷贝数检测方法为在宿主细胞中快速确定克隆载体或表达载体的相对含量提供了参考关键词质粒拷贝数多重,- 菌液实时定量,-1 + 中图分类号 % 在分子生物技术方面大肠杆菌系统作为重要的宿主以其易于培养遗传背景清楚操纵简便等优点已被广泛应用于大量重要基因的克隆与表达但由于不同质粒载体在宿主菌中存在松弛型和严紧型调控使得不同宿主细胞中质粒拷贝数存在明显的差异其中多拷贝质粒在每个细胞可以达几十乃至几百份质粒拷贝少的则只有一到几份拷贝 $ 由于不同质粒拷贝数将严重制约目的基因的表达调控进而影响基因产物的产率因而发展一种经济合理操作简便的质粒拷贝数鉴定方法不仅可以加速基于原核表达体系进行基因表达调控的研究而且可以显著节约实验研究的成本和时间虽然利用传统 1 + 或.+ 方法以及借助于大型设备如高效液相色谱或毛细管电泳以及 - $),- 等可以实现质粒拷贝数的测定但由于存在操作复杂耗时长成本高以及对于仪器的要求高收稿日期 $$% 修回日期 $ $ " 国家 "& 计划!%' 国家科技重大专项课题 " "% " " " "!! 国家自然科学基金 "#! #"! 资助项目共同第一作者通讯作者电子信箱 ( )( * +)( ( 等缺点使其在普通实验室中的应用受到了极大限制本研究旨在利用多重,- 技术建立一种快速高效的质粒拷贝数鉴定方法聚合酶链式反应 ),- 是目前广为使用的分子生物学技术并进而衍生出包括差异显示,- 实时定量,- 巢式,- 多重,- 和不对称,- 等在内的多种不同类型的相关技术 ' 其中多重,-),- 通过在同一,- 反应体系里针对多个./0 模板使用两对或两对以上引物进行反应可实现多个核酸片段的同时扩增自 "## 年 )+ % 等首次提出这一概念以来多重,- 已被广泛应用于许多领域包括基因敲除分析突变和多态性分析! 植物病虫害检测 & 食品病原微生物检测 # 基因表达的定 " 性和半定量分析等因此如能通过在大肠杆菌基因组./0 和克隆载体或重组表达载体上设计引物进行多重,- 反应那么通过对电泳条带灰度值的分析就有可能更简单地计算得到质粒的相对拷贝数因此基于本实验室新近设计完成的多重,- 引物设计系统, ) 22+ ) (+)( ( 2, ) 2 和多因素引物特异性评估系统 34 ) 22

2 "' 中国生物工程杂志 5 ( /(! + ) (+)( ( 2 34 ) 2 以转化有克隆载体 6''' 或表达载体 , 的 9:% 和.9% 两种大肠杆菌中为对象进行比较研究旨在为鉴定质粒拷贝数和选择合适的宿主细胞提供参考材料和方法材料大肠杆菌 9:% 和.9% 菌株由本实验室保存克隆载体 6''' 0) ; 和表达载体 , 0) ; 均由东京女子医科大学 1 教授惠赠质粒提取试剂盒购自美国, ) 公司琼脂糖购自 8 : 公司 4 : 酶 : -1 -, ) 4 : : 试剂盒.6./0 /:, 限制性内切酶购自 : - 公司 8 5 : 核酸染料购自北京赛百盛基因技术有限公司 6 培养基相关试剂均购自 <. 公司,- 购自美国热电公司 - $),-, 购自美国安捷伦公司电泳仪购自北京六一仪器厂凝胶呈像仪购自 1 公司引物和生物素标记探针均由 <= 公司合成碱变性液 >% ) 26/ >% ) 26/ 9 中和液 ) 26 : $9 9&>'>% ) 26/ 转移液?11 方法 > > 多重,- 引物设计首先从 /< 数据库获得大肠杆菌 9:% 和.9% 的基因组序列克隆载体 6''' 序列和表达载体 , 序列并以 301:0 格式保存到同一文本文件然后提交到多重,- 引物设计软件, ) 22+ ) (+)( ( 2, ) 2 进行引物设计根据实验需要设计两组多重引物每组均以大肠杆菌基因组中的 8 0 为内参根据各引物序列的值产物长度各引物罚分值等参数选择多重引物对中值较接近的一组扩增引物并送 <= 公司进行化学合成具体引物序列信息如表所示 8 0 表多重反应的引物序列对!" #$ % #&!' ' '! & % 靶序列 ''' 7 引物序列上游 08::88:88: :: 下游 0000:08:88:8800 上游 : 下游 : :0 预期扩增长度 + # '# > > 菌液多重,- 模板的制备根据, ) 公司质粒提取说明书所述方法分别提取质粒 6''' 和 , 然后采用热激法将其分别转化入两株不同大肠杆菌 9:% 和.9% 感受态细胞继而采用涂布棒涂布到含有 0) ; 终浓度 2) 的 6 固体培养基上并置于 & A 恒温箱孵育 B 待长出克隆次日挑取阳性克隆并接种到含有 0) ; 终浓度 2) 的 6 液体培养基中 & A 2) 摇菌约 B' 待! 值达 ># 并经测序验证后用作菌液,- 模板 > > 菌液多重,- 扩增及凝胶图像采集分析按照 : - 公司 4 : 说明书提供方法进行多重,- 反应其中,- 总反应体系为 % 模板量为 >% 菌液上下游引物分别为 > 的质粒引物对和 > 的基因组./0 引物对具体,- 反应程序如下 "% A %>% )"% A! A '% & A!! 个循环 & A % ),- 扩增产物采用 >%C 琼脂糖凝胶电泳分离并结合凝胶成像仪采集凝胶图像继而利用凝胶成像仪自带分析软件进行各基因片段的积分光密度值 <. 分析并获得质粒 <. 相对于基因组 <. 的相对比值以此数值的大小表征质粒含量的相对高低程度 > >' - $),- 体系及反应按照 : - 1 -, ) 4 : : 试剂盒说明书进行实时荧光定量,- 反应所用引物与多重,- 的一致以 8 0 为内参通过荧光值变化相对定量两种质粒的拷贝数,- 体系 1 -, ) 4 :? - - D. >' 上下游引物 ) 26 各 >' 菌液模板上样量 >' 9 #>',- 反应条件 "% A "% A %! A & A 反应循环数!,- 结束后对扩增产物进行熔解曲线分析以确保特异性扩增 > >% 使用 1 + 技术检测质粒拷贝数针对相同体积! 值相同的 ' 种菌液按相同的实验流程提取质粒用限制性内切酶质粒 D $483, 用 9< 质粒 6''' 用各 ' & A 水浴消化 ' 酶切样品用于 >&C 琼脂糖凝胶 >%C 8 5 : 电泳虹吸转移到硝酸纤维素膜 #% A 将膜干燥!% A 预杂交后用生物素标记的探针 : :088:E%!% A 杂交过夜经?11>C 1.1!% A )? 11>C 1.1!% A )>%?11>C 1.1

3 ! 李媛等多重,- 在质粒拷贝数检测中的应用 "%!% A )>?11>C 1.1!% A )>?11>C 1.1!% A ) 梯度洗膜后用辣根酶标记链亲和素 E 室温孵育 )?:1: 洗膜 )? 后进行 46 显色胶片曝光 ) 显影定影直至条带清晰继而利用 <,, 软件对条带的积分光密度值 <. 进行分析以此数值的大小表征质粒含量的相对高低程度 > >! 统计学分析上述分析数据采用 1,11 > 统计分析软件的 $ 检验进行统计学分析将 >% 定义为显著性差异将 > 定义为极显著差异结果菌液多重条件优化./0 扩增反应中进入平台期是基于,- 技术分析基因差异的重要影响因素为探索循环数对多重,- 反应平台期的影响我们采用梯度,- 分别系统排查了从到个循环中分别以质粒 6''' 和 , 为模板进行,- 扩增到达平台期的时间并采用琼脂糖凝胶电泳分离后进行积分光密度计算及柱状图分析结果如图所示当循环数为到 # 个时质粒 6''' 和 , 扩增片段的积分光密度值随着循环数的增加而增加! 个循环时已达最大图 + 电泳条带的亮度直观上有明显的变化当循环数达到次以后质粒 6''' 和 , 扩增片段的积分光密度值基本没有变化提示反应已进入平台期图由于大肠杆菌基因组的模板在数量上较载体要少所以在质粒,- 扩增没有达到平台期前基因组的扩增理论上不会进入平台期因此本实验选择! 次作为最适合的,- 循环参数在此条件下每对引物的扩增都是有效扩增不受平台期的影响图反应循环条件优化及柱状图分析 ' % $!$# "&"!' "$!( $!$#!( $'! & 0) D D ) ,+0) D D ) 6''' 利用多重技术进行质粒相对拷贝数的测定根据上述多重,- 条件优化结果选择! 次循环对大肠杆菌基因组和载体./0 进行菌液多重,- 扩增结果如图所示同一质粒在不同大肠杆菌中经,- 扩增后的琼脂糖凝胶电泳结果呈现明显差异且条带亮度的强弱与所检测得到的质粒浓度结果未显示之间呈正相关关系即质粒浓度高的菌液中,- 条带的亮度更高质粒浓度较低的菌株中,- 条带的亮度相应较弱进一步通过 <,, 软件对上述琼脂糖凝胶图像进行积分光密度分析得到各组质粒扩增条带的积分光密度与基因组扩增条带的积分光密度的相对比值然后在重复实验次数的基础上得到平均相对比值以及各自的标准差用 = #> 软件进行柱状图分析以及 $ 检验分析结果可见在宿主菌.9% 中种质粒的相对比值与宿主菌 9:% 中两种质粒的相对比值存在极显著性差异 > 图 + 因此通过菌液多重,- 扩增及积分光密度分析可以便捷地判定质粒拷贝数的相对数量为在宿主细胞中快速确定克隆载体或表达载体的相对含量提供了技术参考 ) 通过 * 技术检测质粒的相对拷贝数近年来基于灵敏度高所需样品量少等优点实时荧光定量,- 在动植物外源基因拷贝数检测中发挥重

可见同一质粒在不同大肠杆菌株系中的相对表达量存在明显的差异其中两种质粒在菌株.9% 中的相对表达量为菌株 9:% 中的倍左右并且此结果与通过多重,- 技术的检测结果趋势基本一致 - 通过 /$! $ 检测质粒的相对拷贝数为了进一步明确克隆载体 6''' 和表达载体 3 7 图质粒拷贝数测定及柱状图分析 +!,- '.! $!$# % ("$%&!!( $'! &.

4 "! 中国生物工程杂志 5 ( /(! 要作用 $% 因此我们将 - $),- 作为本文方法的对照实验由于 1-8 是一种非特异性的./0 双链结合染料在实时荧光定量,- 中须进行熔解曲线的分析来判断是否存在非特异性扩增本实验的熔解曲线如图所示无论是针对内参 8 0 还是目的基因外源质粒的扩增在,- 过程中都没有非特异性的条带出现较好地避免了检测过程中假阳性结果的出现本研究为半定量检测通过将 8 0 的表达量作为均一化的标准对目的质粒的表水平进行半定量分析结果如图 + 所示可见同一质粒在不同大肠杆菌株系中的相对表达量存在明显的差异其中两种质粒在菌株.9% 中的相对表达量为菌株 9:% 中的倍左右并且此结果与通过多重,- 技术的检测结果趋势基本一致 - 通过 /$! $ 检测质粒的相对拷贝数为了进一步明确克隆载体 6''' 和表达载体 3 7 图质粒拷贝数测定及柱状图分析 +!,- '.! $!$# % ("$%&!!( $'! &. ) D ) )+ + ),- +9 ) D<. 483, 在两种大肠杆菌中的复制效率即相对拷贝数在 - $),- 对照体系的基础上我们通过 1 + 对其又进行了无放大的基因水平确认当! 值达到 ># 时吸取相同体积 ) 的菌液进行质粒提取其原理在于基因组./0 的个数理论上在图 ) * 对质粒相对拷贝数的检测 ').! $!$# 0 % ("$%&! & *. = D+ D +- = D ) )+ 不同菌株中是一致的根据本研究需求仅针对两个质粒设计了生物素标记探针而没有进行基因组水平的 1 + 分析结果如图 ' 所示在基因水平上种质粒在大肠杆菌菌株.9% 和 9:% 中拷贝数同样存在较显著的差异通过对图像进行积分光密度分析可见 1 + 结果也与本文基于多重菌液,- 的结果是一致的由此可见本文提出的通过多重菌液,- 对质粒的拷贝数进行相对定量的技术是切实可行的并能够在普通实验条件下推广 ) 讨论与传统的 1 + 以及近年来新发展的 - $ ),- 技术相比较通过对多重,- 电泳结果的半定量分析也可方便地计算出质粒的相对拷贝数虽然

5 ! 李媛等多重,- 在质粒拷贝数检测中的应用 "& 图 -/$! $ 对质粒相对拷贝数的检测和柱状图分析 '-.! $!$# 0 % ("$%&! & /$! $!( $'! & 该方法不能获得质粒拷贝数的精确含量但是可以给实验人员提供一个可参考的数值范围并能够清晰地反映出不同宿主细胞内对于同一质粒扩增效率的差异更重要的是该技术操作简便而且更加经济可行尤其适合于普通实验条件下比较和选择最适合的宿主细胞进行基因的克隆和蛋白的高效表达本文结果显示由于多重,- 对质粒相对拷贝数的检测结果与 - $),-1 + 等结果基本一致说明本文所述方法具有一定的可行性并且基于本实验室自行研发的多重,- 引物设计软件 22 + ) (+)( ( 2, ) 2 可以很容易地实现高质量高特异性多重引物设计! 因此通过多重,- 检测质粒相对拷贝数在技术方面不存在障碍其次与传统质粒拷贝数的检测方法如氯化铯溴化乙锭 $4 平衡梯度离心法高效液相色谱 $ ) 9,6 以及毛细管电泳 4 和核酸杂交等方法比较而言多重菌液,- 的方法可操作性强重复性好可显著节省检测的时间和成本多重菌液,- 通过基因组./0 实现相对定量的方法更加简便和直观甚至跳过了从质粒提取到浓度检测这些繁琐的步骤可直接判断出哪种菌株更适合于目的基因的克隆或蛋白的表达而传统方法则相对比较耗时与同属于聚合酶链式反应家族的 - $),- 相比较通过普通的琼脂糖凝胶电泳技术分析多重,- 的扩增产物不需要昂贵的 - $),- 仪和荧光标记物实验条件更简单成本更低更适合于普通实验室的推广另一方面研究表明在传统方法检测质粒拷贝数的过程中提取./0 的步骤最为关键如果提取效率不高检测结果也会产生很大的偏差 & 而在本研究中无需./0 的提取通过以反应体系中包括的宿主内部基因组中的特异基因做对照可直接评价质粒模板的含量从而推测质粒的相对拷贝数这样可显著减少实验操作过程中误差累积对结果造成的干扰另外需要说明的是使用该技术进行质粒相对拷贝数的计算时要特别注意,- 扩增循环参数的选择如果循环数过大,- 扩增就会进入平台期而导致各样品间的条带差异不明显甚至消失以至对结果的判断产生干扰因此通过循环梯度,- 进行循环数的选择很关键以确保宿主基因组和质粒./0 的扩增均处于,- 扩增的对数期内总之多重,- 技术以其高效快捷高度特异敏感能加速实验进程等优点已得到很多领域科研工作 $ 者的青睐该技术在质粒相对拷贝数鉴定中的应用与传统的检测手段相比具有显著的技术优势并且还可推广到酵母中基因克隆和表达量的鉴定以及真核细胞中转染外源基因的丰度鉴定等因此多重,- 技术的引入可以显著提高质粒等外源基因丰度的检测效率从而使选择合适的宿主细胞进行基因克隆和蛋白的表达更加便利参考文献门大鹏 ( 质粒 ( 生物工程进展 "" ' '"$%(.,(, "" ' '"$%( 萨姆布鲁克拉塞尔. ( 黄培堂等译 ( 分子克隆实验指南 ( 第版 ( 北京科学出版社 ( $!( 1)+ -. (: + 9,:( 0 6+ ( ( 1, ( $!( 周涛 ( 质粒拷贝数的测定方法 ( 生物技术通讯 """ %$%&( :(6 """ %$%&( ' 萨姆布鲁克拉塞尔. ( 黄培堂等译 ( 分子克隆实验指南 ( 第版 ( 北京科学出版社 (%"&$&( 1)+ -. (: + 9,:( 0 6+ ( ( 1,

6 "# 中国生物工程杂志 5 ( /(! (%"&$&( % ) (. D ) =)./0 ) D ( / 0 - "##! '$%!(! 刘正斌高庆荣王瑞霞 ( 多重,- 技术在植物生物学研究中的应用 ( 分子植物育种 %!$!#( (, %!$!#( & D ) 0 ),6 / - 0(,- D D0D =) = 4 0D = ) ) = =( 5 # %' $ ( # (,-D D D + ) (3 + & ' &%$#( " 张平平刘宪华 ( 多重,- 方法对大豆转基因食品的定性检测 ( 食品科学 ' % &$ (,, 6 9(3 1 ' % &$ ( 1 (, ) )D + ),- ) ( D ) ' ( 1 ( 34 ) ) D = D D D,- ) (D ) " % &!$ &#(, 1 ( DD $,- ) )+ + ( 8 ) - ""!! $!( (9 $ )+ ) + ) =,-(, -!%$ &&( ' 6:. (4 ) )+ D D ) + $) =,-(, - % &%"$&! ( % 樊佳佳白俊杰马冬梅等 ( 转红色荧光蛋白基因唐鱼外源基因拷贝数的测定 ( 生物技术通讯!$!%( 3. (6!$!%(! 王稳屈武斌申志勇等 ( 利用, ) 设计引物并优化扩增条件以提高多重,- 效率的实验研究 ( 生物化学与生物物理进展 & ' $'!( 1 (, ) & ' $'!( & 丁满生马文峰郭美锦等 ( 温度诱导模式对重组大肠杆菌质粒拷贝数的影响 ( 华东理工大学学报! $&( ( 4 =D 1 :! $&( 1 $( $ (! #& $%& $# ( & % 6< -4/ $ $ 4 19< $ $+ 94/8 $D 6< 9 $ 90/8 $ < D D, ) #% : D6D 1 / 0 3 = & 1 " :,- + = D D) + ( 9 = ),-D ) D ) )+ + (:D D + ),- ) = ) ) : $,- ) ) D + ) )./0 + D! D ) = ) D ),- (3 D ) * ) = )+ D ) (: D = )+ D ) ) + ),- ) + - $),- 1 + ),- = = + ) ) ) (1 D ) D D ) )+ + = + + ) = )+ D = = ( & $ ( )+ D ),- - $) =,- 1 +

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析

材料! 方法! # 基因的扩增及其序列分析生物技术通报黄艳燕黄靖华卢福芝孙靓彭立新周兴黄日波利用的方法从鼠李糖乳杆菌基因组中扩增到乳酸脱氢酶基因并连接到载体上构建表达质粒将重组质粒转化大肠杆菌重组菌株经诱导表达电泳分析表明在大肠杆菌中实现了表达表达产物的分子量约为同时采用紫外分光光度法测定乳酸脱氢酶的酶活测得重组菌株的乳酸脱氢酶活力为最适反应温度为最适乳酸脱氢酶克隆表达鼠李糖乳杆菌