纪丽萍等 重组大肠杆菌产 - 环糊精葡萄糖基转移酶的摇瓶发酵优化! 氨苄青霉素 / 的 培养基中 6 7 / 过夜培养 将过夜培养的细菌按!4 的接种量接入含氨苄青霉素 / 的发酵培养基中 6 7 / 培养 定时取样 离心发酵液 收集上清 水解活性的测定碘液法测定 ; 9 的水解活性 取 样品 对照

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1 中国生物工程杂志!!" 重组大肠杆菌产 环糊精葡萄糖基转移酶的 摇瓶发酵优化 纪丽萍 吴 丹 吴 敬 陈 坚 江南大学食品科学与技术国家重点实验室 无锡, 江南大学生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室 无锡, 摘要 为了实现来源于碱性芽孢杆菌 ", 的 - 环糊精葡萄糖基转移酶的高效胞外表达 对./01 信号肽介导的 基因工程菌进行发酵培养基及发酵条件的优化 并进行正交试验 获得最优培养基 甘油! 蛋白胨 " 酵 母膏, 钙离子 "// 镁离子 // 甘氨酸 3!4., - 3/ 在此基础上最适 发酵条件 05"3!!6 培养 装液量 /!/ 转速 7 /3 4 在发酵 时利用! 乳糖进行诱导 使得酶活从初始的!%$3 ' / 提高到 "%3%' / 研究结果得到高效表达的培养条件 为实现该酶的工业化应用打下了基础 关键词 重组大肠杆菌 环糊精葡萄糖基转移酶 发酵优化中图分类号 %$ 环糊精葡萄糖基转移酶 : 79 ; 9 3,33$ 是一种分泌型糖基水解酶 它能以淀粉 糖原 麦芽寡糖等为底物 酶解环合生成不同大小的环糊精 9 由于环糊精具有外部亲水 内腔疏水的特性 使得其能容纳与其大小和形状合适的疏水性分子或基团而形成包合物 在农业 食品 医药 纺织 环保等领域有广泛的应用 #, 此外 环糊精还是目前公认的食品稳定剂和除臭剂! 近年来 还作为一种新兴药物载体广泛应用于医药行业中 " 常见的环糊精主要有 种类型 分别含有 " % 个葡萄糖残基 其中 # 环糊精空腔更大 水溶性更好 用途更加广泛 目前有关发酵生产 ; 9 的报道较少 胡静 等选育了一株产 ; 酶的芽孢杆菌 8 菌株 并进行 % 发酵优化 使产酶量达到!!$"' / 朱德艳从土壤中选育了一株嗜碱芽孢杆菌 - 并进行发酵优化 $ 产酶量达到!,"' / 曹新志等对一株嗜碱芽孢杆 收稿日期 #!#$ 修回日期 #%# $ 中央高校基本科研业务费专项资金 &' $ 资助项目 通讯作者 电子信箱 () * +(* 菌进行了发酵优化 产酶量达到!% ' / 由于天然菌株产酶能力低 为提高 ; 酶的生产水平 本研究对分泌型信号肽./01 介导的 基因工程菌的发酵条件进行优化 以实现在工程菌中高效表达 ; 酶 为工业化生产及应用打下基础 材料与方法 菌 种基因工程菌 由本实验室保藏 试剂 ; 异丙基 -# # 硫代半乳糖苷 氨苄青霉素等试剂购自上海生工生物工程有限公司 胰蛋白胨和酵母粉购自.8+ 公司 标准分子量蛋白及 # 1; 试剂盒购自碧云天生物技术研究所 其它试剂均为国产分析纯 表达方法按 的接种量从 -%6 保存的甘油管中取基因工程菌 接入含

2 纪丽萍等 重组大肠杆菌产 - 环糊精葡萄糖基转移酶的摇瓶发酵优化! 氨苄青霉素 / 的 培养基中 6 7 / 过夜培养 将过夜培养的细菌按!4 的接种量接入含氨苄青霉素 / 的发酵培养基中 6 7 / 培养 定时取样 离心发酵液 收集上清 水解活性的测定碘液法测定 ; 9 的水解活性 取 样品 对照不含样品 加入 3 / 05$3 的 3 / 甘氨酸 #.5 缓冲溶液 3 / 3 4 马铃薯淀粉溶液 空白不加马铃薯淀粉溶液,6 反应 / 后加入 3!/ 3!/ 醋酸终止反应 加入 / 3!4 碘液显色 在 / 处测定吸光值 1 以吸光值下降 4 的酶量为 个单位 酶活力 ' / 1 对照 -1 样品 3 1 对照 稀释倍数 菌体生长曲线研究按 的接种量将重组大肠杆菌从甘油管中接入含氨苄青霉素 / 的 培养基中 6 培养 每隔 取样测 " 将培养 % 的大肠杆菌按!4 的接种量接入 培养基中 6 7 / 培养 每隔 取样测 " 和酶活 酶表达培养基的组成研究运用 % 七因素三水平正交试验 对培养基的主要组成成分及浓度进行了研究 配方见表 要包括菌体的活力 接种量 种龄等 为了确定种龄 对 培养基和 培养基的菌体生长曲线进行了研究 结果见图 表明 > 是延滞期 >$ 是对数生长期 $ > 为稳定期 开始进入衰亡期 最佳接种时间为对数生长的中后期 因此选择培养 " >% 的大肠杆菌转接入 培养基验证最佳种龄 结果如图 所示 菌体生长和产酶良好 延滞期较短 因此应选用 " >% 的种子 图 重组菌在 *+ 培养基中的生长曲线, -&%."/!(& %$&!% ' '" '*+ # ( 表 培养基优化正交试验因素水平表!" #$!"%& '# ' # $%& % " ' # (!% %' '" '#!%'! '"& " %' 7 * : 7 ; 7! % 7 0 " < 9 87 ",, 2 // "! = 2 //, " ; 4 3! 3! 3!., - / 3! 3 3 ) 酶表达条件的研究 进行发酵条件的单因素实验 研究 05 温度 装液量 表面活性剂 诱导剂对重组大肠杆菌产 ; 9 的影响 结 果 菌体生长曲线研究 对发酵过程来说 种子的优劣是至关重要的 这主 图 重组菌在 + 培养基中的生长曲线, &%."/!(& %$&!% ' '" '+ # ( 发酵培养基的正交试验研究通过表 所示配方进行正交试验研究 结果见表 对正交试验结果进行极差分析 表明各指标对重组酶的影响大小依次为蛋白胨? 钙离子?. -,? 甘油? 甘氨酸? 酵母膏? 镁离子 最好的实验方案应该是 甘油! 蛋白胨 " 酵母膏, 钙离子 "//

3 ! 3 3 表 * 0 ) 正交试验结果 * 0 ) %&"/% %' && 1 %$# ' & '" 7 * ; 7 < = 2 ;. -, ; 9 ' / %3" "!! 3!!!3, "!!$3!,$" 3, ","!3",%"3! %!"3 $! %3" $!"3! "3!%!3",$ "3!, $%"3! $ %3$ " $ "3!,3" %! "3 A $%3 %3 $,%3,!"3, "$$3" % 3"!!" A,%,,3 $""!3 % 3,$",3",,,!3,, 3%,,3 A, $ 3%," $ 3!"$,3!3!! 3,,,$ ""%3 B!,%,3 " 3,%$3, %$ 3 "3"!, %3" %, 3 B % 3, ""3$ " "3 %$,3, 3" %" 3 3! B! 3$ $$3! $,%,,"!3 "$ 3$ ""3!3,!%%3,$ 3%,!$ 3"!"%3% $3 %%3!3% 镁离子 // 甘氨酸 3!4. -, 3/ 为确定此方案是否为最佳方案 将此培养基配方进行摇瓶发酵验证 在同样条件下发酵酶活达到,% $' / 为摇瓶优化最高酶活 说明优化结果为最佳培养基组成方案 对菌体产酶的影响控制一定的 05 不仅是保证微生物生长的主要条件之一 而且是防止杂菌感染的一个措施 维持最适 05 已成为发酵生产成败的关键因素之一 05 主要从酶的活性 细胞膜所带电荷的状态 培养基中某些组分的解离以及代谢过程等方面影响菌体生长繁殖和发酵产物合成 因此 采用不同初始 05 的培养基对重组菌进行考察 结果如表所示 从表中可以看出 重组菌生长阶段和产物合成阶段的最适 05 不同 在 05 为 "3! 时 对生长的促进作用最为明显 但产酶量不是最高 而在 05 为 时 产酶量比在 "3! 时提高了 "4 因此 可以在发酵过程中采取 05 两阶段控制策略 以寻求生长和产酶的最佳平衡点 表 对重组大肠杆菌生长和产 的影响 / $!"%$ ' " %'"/ &%."/ '#"/ &%#(!" %'%$ / 05 " ; 9 ' / " 3 %,$3 "3! 3!%3" 3%! 3 3! 3!3$ % 3$ $%%3% 温度对菌体产酶的影响 由于微生物的生长繁殖和产物的合成都是在各种酶的催化下进行的 而温度却是保证酶活性的重要条件 因此在发酵过程中必须保证稳定而合适的温度环境 温度对细胞生长的影响不仅表现为对表面的作用 而且因热平衡的关系 热可以传递到细胞内 对微生物细胞内部的所有结构物质都有作用 温度主要从发酵动力学特性 菌体代谢产物合成方向 微生物代谢调节机制 发酵液的理化性质等方面来影响产物的合成 温度对重组菌生长和产酶的影响如表, 所示 从表, 可以看出 重组大肠杆菌细胞生长和

4 纪丽萍等 重组大肠杆菌产 - 环糊精葡萄糖基转移酶的摇瓶发酵优化! ; 9 积累的最适温度相同 在!6 时 菌体生长和产酶均达到最高 但和 6 差别较小 考虑到工业生产中控制 6 成本较低 因此 采取 6 作为发酵生产的最佳温度 表 温度对重组大肠杆菌生长和产 的影响 $!"%$" & "(& %'"/ &%."/ '#"/ &%#(!" %'%$ /0 7(7 6 " ; 9 ' /! 3,!% 3 3%, %3 3! %!3 溶氧对菌体产酶的影响在好氧培养中 氧气的供应往往是发酵过程能否成功的重要因素之一 如果外界不能及时供氧 溶解氧只能维持微生物菌体极短时间的正常呼吸 氧气不足时容易引起乙酸的积累从而影响菌体生长和产酶 在实验室和小规模发酵过程中 装液量和转速是影响溶氧的最重要的两个因素 因此 考察了这两者对于重组大肠杆菌生长和产酶的影响 结果如图所示 从图中可见 在装液量为 / 和转速 7 / 时 菌体生长和产酶均达到最佳水平 为后期放大培养提供参考 图 装液量和转速对重组大肠杆菌生长和产酶的影响, $!"%$ %( '#"(&' ' & " %'"/ &%."/ '#"/ &%#(!" %'%$ 不同的表面活性剂对菌体产酶的影响研究表明 表面活性剂能够改善细胞膜透性 使得 重组酶能够顺利地分泌到细胞外 提高产酶量 #, 因此 对 7# #% 种不同的表面活性剂的添加浓度进行了研究 结果如图, 所示 从图, 可以看出 种表面活性剂中 和 7# 对生长抑制明显 而 #% 对生长没有抑制 但是 和 7# 对重组菌产 ; 9 有明显的促进作用 在 3 4 的添加作用下 菌体产酶量明显增高 在, 时 是对照的 3% 倍 因此 可以选用 3 4 的 进行扩大发酵培养 ) 不同的诱导剂对菌体产酶的影响 ; 是一种极强的诱导剂 十分稳定 不易被菌体代谢 但是价格昂贵 乳糖是一种天然的 启动子的诱导剂 价廉 无毒 但是由于其在菌体的代谢过程中可以充当碳源和能源 比 ; 的转化过程要复杂 因 此菌体细胞在利用乳糖的过程中会发生一系列的变化! 对不同浓度的两种诱导剂对菌体的生长和产酶情况进行对比 结果如表! 所示 并进行了 # 1; 分析 结果如图! 所示 从表! 中可以看出 ; 对菌体生长的抑制作用比乳糖较为明显 而! 乳糖和 3 // ; 的产酶效果基本相同 # 1; 显示在此两种诱导条件下目的条带也是最粗 9 和! 因此可采用! 的乳糖替代 ; 作为发酵过程中的诱导剂 讨 论 近年来 环糊精的生产开发十分受重视 应用研究也不断深入 产品类型主要为 # 以及少量 # 国外目前只有 C B 7 和 等少数几家公司生产 # 和 - 环糊精 而且产量非常有限 国内至今尚未有 - 环糊精的工业生产 究其原因 主要由于生产环糊

5 !, 3 3 图 & "%' 和. ' 0! 对重组大肠杆菌生长和产酶的影响, / $!"%$ & "%' '#. ' 0! %'"/ &%."/ '#"/ &%#(!" %'%$

6 纪丽萍等 重组大肠杆菌产 - 环糊精葡萄糖基转移酶的摇瓶发酵优化!! 表 乳糖和 23 对重组大肠杆菌生长和产 的影响 $!"%$!"% '#23 %'"/ &%."/ '#"/ &%#(!" %'%$ +( 7 " ; 9 ' / 7 3!$%3 9 3 "! 3%! 9 3!%3 9 3", "3 3 // ; %3 "%3% 3,// ; 3! " 3$ 3"// ; 3!%3 图 乳糖和 23 对产酶影响的 34 分析, 34 ' 1 %$"/ $!"%$!"% '#23 %'"/ "/ &%#(!" %'%$ 7 >,! 9! > 3 // 3, // 3"// ; 精所使用的 ; 9 特异性较差 而且 # 的水溶性相对较高 不容易分离纯化 因此造成生产成本太高 目前工业上生产环糊精所使用的 ; 9 主要来自芽孢杆菌属 " 研究也多集中在野生菌的筛选和优化上 但是野生菌的产量较低 特异性较差 而重组大肠杆菌生长 表达 分泌机理日趋成熟 产酶特异性较强 生长周期短 分泌效率高 可以作为 ; 9 的生产菌种 论文以含环糊精葡萄糖基转移酶基因的重组大肠杆菌为出发菌株 从发酵培养基中的碳源氮源的成分入手 并对金属离子和无机盐离子进行考察优化 使得重组环糊精葡萄糖基转移酶在大肠杆菌中的表达得到了较大的提高 在考察发酵培养基组分的基础上 对重组大肠杆菌的发酵条件进行了研究 考察了 05 温度 装液量 表面活性剂 诱导剂对重组大肠杆菌产 ; 9 的影响 确定了最佳培养条件 通过正交试验优化得到的培养基为甘油! 蛋白胨 " 酵母膏, 钙离子 "// 镁离子 // 甘氨酸 3!4., - 3/ 在 05!6 装液量 /!/ 7 /3 4 时添加! 乳糖诱导的培养条件下 实现了酶活从初 始!%$3 ' / 到 "%3%' / 提高了 3$ 倍 是目前摇瓶发酵的最高表达水平 为实现该酶的工业化生产打下基础 参考文献 D 7/ 7 91 * ( : 79 :7/ E$ *! "! $%! %%"# %$* E C = C E *;//# D / 07+( *100 = 7,!#!!* 1 ;( :7+1 *100 : / : :7 7 99*&(7 :7/ 70 1 $! #$" *, : = * 7/ ( 00 9 : ( + 0/ *&(7 : 7/ + 7/ " " #" *! D D &* : * 7 +9 E+,! #, #, * " = + ( 7& ( &*= + :707+( D / # + 87 /0 8*',13 * 胡静 陈育如 魏霞 等 * 高产环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌选育 产酶与酶学特性 * 食品与生物技术学报 %,$ # * 5( & < C *&(7 :E+ + %,$ # * % 朱德艳 * 一株产环糊精葡萄糖基转移酶的枯草芽孢杆菌的选育及产酶条件的研究 * 荆楚理工学院学报 $,! $# * ( <*7 + + D / : #$ 07+( / + 87 ( 79: 79 * &(7 : & ( ' 79 : $,! $# * $ 曹新志 金征宇 * 嗜碱芽孢杆菌产环糊精葡萄糖基转移酶发酵条件的优化 * 食品科学! " # "* & <*E+! " # "* C( ( 5 < 5 & *A #9: 7 97 :70 //# (/ + 07+( #$ ;=% * / 7 &(7!,# %* C ; < ( ; * 100 : #9 /0 7( :7 + ( 07+( : 7/ % && $ *! %% #%$* ; ; A* + 07+( : 7 / 97 0B9! (9 : +#

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