上海交通大学学报 农业科学版 第 卷 大肠杆菌 ) 是肠出血性大肠杆菌 #. -4& -*&44 +, #/ $%. $! ##% 的一个主要血清型 是食源性人兽共患病原菌 它可引起人的食物中毒 严重的可致人死亡 在公共卫生和动物医学等方面都具有重要的研究意义 大肠杆菌 ) 产生的志贺毒素, + &

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1 第 卷第 期 年 月 上海交通大学学报 农业科学版! "#!$ %!%# %# "&'& 文章编号 (() ( ((() 大肠杆菌 ) 噬菌体裂解酶的克隆表达及活性分析 杨 曦 吉文汇 曹冬梅 孙建和 严亚贤 上海交通大学农业与生物学院 上海市兽医生物技术重点实验室 上海 摘 要 为研究大肠杆菌 ) 噬菌体编码的裂解酶 内溶素 对肠出血性大肠杆菌的抗菌作用 克隆表达了大肠杆菌 ) 噬菌体裂解酶 并检测其裂解作用和裂菌谱 利用 ;% 方法扩增大肠杆菌 ),. 株中 噬菌体裂解酶基因 基因 构建表达质粒 7#!+B '1 #% 并转化至大肠杆菌 5# 重组质粒在 5 中获得了高表达 目的蛋白表达量占菌体总蛋白的 经, 4+7! 亲和层析柱纯化后 获得的重组 1 #% 的纯度大于 ( 体外裂解活性试验证实纯化的噬菌体裂解酶 1 #% 对肠出血性大肠杆菌菌株具有很好的裂解作用 这为新型噬菌体抗菌生物制剂的研发提供了新的研发方向 关键词 大肠杆菌 ) 噬菌体 裂解酶 酶活性 中图分类号 ) 文献标识码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收稿日期 基金项目 国家自然科学基金项目 ) 作者简介 杨曦 ( 男 硕士生 研究方向 分子细菌学 # *+,'1+.,( 0-2. 严亚贤 ( 为本文通讯作者 女 博士 副教授 研究方向 微生物学与免疫学 # *+,'1+.1+,

2 上海交通大学学报 农业科学版 第 卷 大肠杆菌 ) 是肠出血性大肠杆菌 #. -4& -*&44 +, #/ $%. $! ##% 的一个主要血清型 是食源性人兽共患病原菌 它可引起人的食物中毒 严重的可致人死亡 在公共卫生和动物医学等方面都具有重要的研究意义 大肠杆菌 ) 产生的志贺毒素, + &,. 是引起人的腹泻 出血性肠炎和继发性溶血性尿毒综合症的 主要毒力因子 此种毒素主要是由溶源性噬菌体即 噬菌体所编码 大肠杆菌噬菌体不但能够介导宿主菌生物学特性的改变 还能够影响宿主菌的繁殖周期 决定宿主 菌的溶源和裂解状态 由大肠杆菌噬菌体 基因所编码的内溶素即裂解酶是一种既可溶解细胞质的糖基转移酶 也能够降解细胞壁的溶壁酶 聚集在宿主菌细胞质中可破坏 类不同的肽聚糖多聚体的共价键 同时拥有溶解细胞壁从而抑制或杀灭细 ) 菌的活性 迄今噬菌体裂解酶的研究主要集中在 对革兰氏阳性菌的裂菌作用 大肠杆菌噬菌体裂解酶是否是能够治疗细菌感染的新型抗菌药物的相关研究鲜有报道 已知抗生素药物不能有效缩短 ##% 的疗程 且抗生素的使用还会促进志贺毒素 ( 的释放 加重 ##% 的感染 因此从噬菌体裂解酶的角度筛选特异性的新型抗菌生物制剂将对控制 ##% 感染具有重要意义 本课题组前期完成了 株大肠杆菌 ) 噬菌体,. 的分离鉴定和全基因组测序 通过基因比对分析 发现,. 的裂解酶基因与已知的出血性大肠杆菌 ) 噬菌体 (= 裂解酶基因 基因 同源性高达 为了进一步确定裂解酶在体外对不同细菌的裂解效果 本研究对大肠杆菌 ) 噬菌体的裂解酶基因进行克隆表达 探索了高表达菌株的诱导表达条件和纯化工艺 并对裂解酶进行活性分析 为进一步研究新型高效的控制大肠杆菌感染的噬菌体治疗制剂奠定了基础 材料和方法 主要实验材料 质粒与菌株 表达载体 7#! +B 和大肠杆菌 ) 和 5# 均为本实验室保存 致病性大肠杆菌 ),. 株 为,. 的溶原菌株 和所有裂菌谱试验所用菌株均为本实验室提供 % 引物和主要试剂 限制性内切酶购自于 -4*-. + 公司 ;% 产物回收试剂盒和! 连接酶购自于!? 公司 质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自于 *- + 公司,, 蛋白纯化柱购自 # 公司 5% 蛋白浓度测定试剂盒购自上海前尘公司 引物由上海生工公司合成 上游引物 )@ 下游引物 )@ %%%%!!!!!%!!%!!%% 其他所有化学试剂均为进口或国产分析纯试剂 方法 % 裂解酶基因的克隆及表达载体的构建 提取大肠杆菌 ),. 噬菌体基因组 以其为模板扩增噬菌体裂解酶基因 ;% 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定 然后回收 提取 7#! + B 质粒 回收纯化后的 ;% 产物和 7#! + B 质粒分别用 + 和 进行双酶切! 酶连接后转化至大肠杆菌 ) 筛选重组子并进行序列比对分析 将测序正确的表达质粒转化 5# 感受态细胞 获得表达 1 #% 的工程菌 5#7#!+B 1 #% %% 重组蛋白 - #+& 的表达以及条件优化 将表达菌株接入含有 * 卡那霉素的 5 培养基中 A 培养 ) 再以 的体积比接入含有卡那霉素和 ;! 的 5 培养基中进行诱导 最后利用 ; # 检测并分析重组蛋白 分析不同诱导剂浓度 诱导温度和诱导时间对重组蛋白表达量和活性的影响 确定最佳诱导表达条件 % 重组蛋白 - #+& 的纯化 ;! 诱导后的表达菌用 **&' ;5 7 洗涤 次后离心 沉淀溶于 * 5,.2, )**&' 磷酸钠缓冲液 7 中 超声破碎 离心 收集上清 利用, 4+7! 亲和层析柱进行梯度洗脱 分别用 )) **&' 磷酸钠尿素缓冲液洗脱 收集目的蛋白峰后进行 ; # 分析蛋白纯度 最后以 5% 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度 % 平板裂解试验 将大肠杆菌 ),. 株接入 )*5 培养基中 A 培养 直至 为 后离心 用 **&' ;5 7 清洗 次后以 * **&' ;5 7 重悬 清洗后的细菌加入 的融化的琼脂糖中混匀 将混合物倒入

3 第 期 杨 曦 等 大肠杆菌 ) 噬菌体裂解酶的克隆表达及活性分析 平皿中 冷却后在平板上打 个孔 每孔直径 ** 分别滴加 ) 空载体裂解液 ) 5 #7#!+B 1 #% 裂解液 ) * *1 #% 纯化蛋白 A 温箱培养直至观察培养基上出现的透明抑菌圈 %) 酶活性 大肠杆菌 ),. 培养过夜 4*,. 离心 *,. 弃上清 预冷的 **&' ;5 7 洗 遍后重悬 调 为 纯化浓度为 * * 的 1 #% 将 1 #% 稀释为终浓度为 * 后用 **&' ;5 7 在 ( 孔板中依次进行 倍稀释直至 终体积为 每个稀释孔中加入 细菌悬液 每个稀释度 个重复 细菌悬液加 **&' ;5 7 作为空白对照 在.* 处读取吸光度 记录初始值 ( 孔板置 A 放置.* 处读取吸光度 记录反应后的吸光值 计算浊度下降 可使细菌浊度下降 ) 的酶的最高稀释度的倒数即定义为该蛋白酶的活性 * %4 裂解谱的检测 以细菌浊度下降 ) 为裂解阳性标准 检测 1 #% 对沙门氏菌 金黄色葡萄球 链球菌 大肠杆菌 ) 和 % 等菌株的裂解作用 具体方法同 ) 结果 表达载体的构建以大肠杆菌 ),. 噬菌体基因组为模板 利用 ;% 方法扩增裂解酶基因 扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后 鉴定在 )67 处出现目的片段 图 将目的片段插入 7#!+B 后得到 7#!+B 1 #% 重组表达质粒 经测序比对分析 与噬菌体 基因片段的同源性为 表明重组表达质粒插入的外源片段正确 - #+& 的表达与条件优化将重组质粒转化至 5#;! 诱导表达后进行 ; # 分析 在约 : 处出现目的蛋白条带 对不同诱导剂浓度 诱导温度和诱导时间进行优化分析 图 结果显示 温度对表达系统具有较大影响 A 不表达 A 重组蛋白部分以可溶性形式表达 A 重组蛋白完全以包涵体形式表达 最佳表达条件确定为 **&' ;! A 诱导 优化后目的蛋白表达量可达到菌体总蛋白的 图 图 温度对 1 #% 表达的影响,#3-&3 -*7-4+4-& ,&.&3 1 #% 74& -,.*+4:-4 A,.2-2 +*7' &3 A,.2-2 +*7'-+3-4 ' 4+ &., +,&. 7-'- &3 A,.2-2 +*7'-+3-4 ' 4+ &., +,&. A,.2-2 +*7'-) &3 A,.2-2 +*7'-+3-4 ' 4+ &., +,&. 7-'- &3 A,.2-2 +*7'-+3-4 ' 4+ &., +,&.A,.2-2 +*7' &3 A,.2-2 +*7'-+3-4 ' 4+ &., +,&.(7-'- &3 A,.2-2 +*7'-+3-4 ' 4+ &., +,&. 图 裂解酶基因的 ;% 扩增,;% +*7',3, +,&.&3-.- *+4:-4 &. 4&';% 74&2 &3-.- 图 1 #% 的表达鉴定,; #+.+'1, &3 1 #% 74& -,.*+4:-45#7#! +B+3-4,.2-, ;!.,.2-2 +*7'-&35#7#! +B1 #% 74& -,.&35#7#! +B1 #%+3-4,.2-, ;!

4 上 海 交 通 大 学 学 报!农 业 科 学 版" $& <!重组 > 5:的纯化及鉴定 重组菌经过离心'重悬'超声破碎后%收集上清% 利用 0?+亲和层析柱纯化%获得重组 - 57%%进 /^/?Y,15 分析!图 #"利用 SP 软件进行分 析%重组蛋白 - 57% 论值! $!X^"相符) 第!"卷 使细菌浊度下降 A"[ 的稀释度的倒数即定义为该 酶的活性! )$B<")实验中%在!> e 条件下%当原 浓度为 % B< $B- 的 - 57% 稀 释 倍 数 为 %g&"" 时%大肠杆菌 (%A> 的 (^=""值下降 A"[!图 ="%因 此% - 57% 的 活 性 为 &"" )$B<%每 单 位 所 含 的 - 57%量为%: $A$<) 图=!- 57%的酶活性测定. =!5 G J - 57% <: B!裂解谱 同时以 (^="" 值下降 A"[ 为裂解阳性标准%检 图#!- 57%的纯化. #!/^/?Y,15 U; P- 57% <: $U53 Z# B X &%# S-$%! ^5!"? $&!f " P; U V L2 Y31&$%!# PU - 57% U; =!平板裂解实验 平板裂 解 实 验 结 果 表 明 含 有 U53$&!f "W - 57%质粒的细菌裂解液和 - 57% 重组蛋白能 够有效地裂解致病性大肠杆菌 (%A> Z $> 株%裂 解裂解圈直径分别为 %= 和 %&BB%纯化的 - 57% 重组蛋白较全菌裂解液有更好的裂菌作用!图A") 测 - 57%对多种细菌的裂解活性)结果显示裂解 酶 - 57%只对不同血清型的大肠杆菌菌株具有裂 解作用%对革兰氏阴性菌如沙门氏菌和包括金黄色 葡萄球和链球菌在内的!种革兰氏阳性菌均无裂解 活性!表%") <!讨论 实验中重组质粒经诱导表达后以包涵体和可溶 性表达两种形式同时存在)温度对表达系统具有较 大影响%在!> e 下重组蛋白主要以包涵体形式表 达&在$> e重组蛋白能够以可溶性形式表达%同时 表达菌成特殊的粘稠状不易吹散%可能已经产生了 部分裂解作用)为了最大程度地保存裂解酶的天然 活性%同时避免包涵体在透析和复性过程中对裂解 酶活性造成的影响%实验中仍采用可溶性表达体系 进行后期的纯化和活性分析) 本实验证实了大肠杆菌 (%A>Z $>/ \$噬菌 体裂解酶对除了宿主菌外多种大肠杆菌具有有效的 杀菌作用)裂解酶杀菌作用的产生是因为其能够打 图A!- 57%在 5057(%A>平板上的裂解效果. A!Y - 57% 5057(%A> <: $U53,# P; PS-$%! ^5!"? $&!f"&s# P; P $U53? ^5!" 57%&7# S-$%! $&!f"w- PU - 57% U;!酶的活性单位 通过浊度递减法对 - 57% 进行活性定义%可 破细菌细胞壁结构%导致宿主菌的裂解%同时裂解酶 的作用位点是细胞壁的肽聚糖成分*%$+)本实验曾 尝试利 用 酶 谱 试 验 检 测 噬 菌 体 裂 解 酶 的 裂 菌 作 用*%!%%#+%然而由于革兰阴性菌细胞壁肽聚糖含量较 少无法在聚丙烯酰胺凝胶中形成眼观可见的结构% 因此利用含有丰富肽聚糖的链球菌细胞壁替代)由

5 第 期 杨 曦 等 大肠杆菌 ) 噬菌体裂解酶的克隆表达及活性分析 ( 表 - #+& 的裂菌谱测定 - #"## $! - #+& 细菌 5+-4,+' 菌株 4+,. 初始 +4,. 终末 #.2,. 裂解活性 1, // 1/ ) 2$!!.% /!%% ( (.%2!! // / +!% 2!. + ) +!% 2$+. + % () )) #/ $%. $! # B #/ $%. $! ) B #/ $%. $! ( ( #/ $%. $! )!%%() ) B #/ $%. $! ),. ( B #/ $%. $! ) ) #/ $%. $! % ) B 于革兰阳性菌与阴性菌细胞壁肽聚糖在铰链结构和 ) 成分上具有较大差异 1 #% 不能裂解所有菌株恰好表明了大肠杆菌 ) 噬菌体裂解酶 1 #% 具有特异性的杀菌活性作用 这一特性提示 1 #% 可特异性的用于大肠杆菌的感染控制 目前尚未见有针对革兰阴性菌噬菌体裂解酶的研究报道 本试验为进一步研发防控革兰氏阴性菌的噬菌体相关治疗制剂提供了很好的研究基础 以浊度下降 ) 为阳性标准测定了大肠杆菌 ) 噬菌体裂解酶对多种细菌的裂解作用 结果证实裂解酶能够针对多种大肠杆菌不同菌株产生裂解作用 对于其他种属革兰阴性和阳性菌无有效裂解作用 由于噬菌体对细菌的裂解作用不单依靠裂解酶基因 其中重要的一步还包括由穿孔蛋白 &',. 介导的针对细胞膜裂解作用 因此要进一步扩大该裂解酶 1 #% 的裂菌谱 可能还要从穿孔素的协调增强作用机制来考虑 本实验室前期针对,. 的测序结果表明了该噬菌体具有类似穿孔素蛋白基因 基于以上分析 大肠杆菌 ) 噬菌体穿孔蛋白和裂解酶之间的作用机制还有待于更深入的研究 参考文献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

6 上海交通大学学报 农业科学版 第 卷 ( (,+. :-% -. 7,. % +4+-4,/+,&.&3, + &,. -. &2,. 6+-4,&7 + -,., &'+ -234&* #/ $%. $! )4+,.&3%,.+ *!"$! "$! " 0#!$'( (( =+. $.%; ; 4,3,-24- &*6, '1,. 1;+.--., * &3'1, +,, 1 3&4.%2!! &!! "$! "() () &.. $ %&*7'- - -.&* &3+.- '1, &'+ -2'1, 6+-4,&7 + -#; &3# %.!! / %/+.2+.,6+-4,+'+,, 1&3,-.2&'1,. #! * " "$! " )( ( -.4,,3-4-.,+,&.&36+-4,+'+&'1,. 61/1 *& 4+*+.+'1,* "$" $' "#! 上接第 页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