第十四章 免疫细胞的分离及其表面标志检测技术
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- 适鲤 赵
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1 第十五章 免疫细胞标志和功能检测技术 白杨娟 华西医院实验医学科临床免疫实验室
2 免疫器官 中枢免疫器官 : 胸腺 骨髓 外周免疫器官 : 淋巴结 脾脏等 免疫系 免疫细胞 参与免疫应答或与 免疫应答有关的各 种细胞 淋巴细胞 单核巨噬细胞 其他免疫细胞 统 免疫分子 Ig 补体 细胞因子 黏附分 子 神经递质 CD 抗原等
3 参与免疫应答的细胞分为三类 : 淋巴细胞主要有 T B NK 细胞等, 在免疫应答中起核心作用 单核 - 巨噬细胞包括单核细胞和巨噬细胞, 在免疫应答中起辅佐作用 其他免疫细胞包括树突状细胞 中性粒细胞 嗜酸性粒细胞 肥大细胞 血小板等, 参与免疫效应
4 第一节淋巴细胞标志及亚群分类
5 淋巴细胞 (lymphocyte) T 细胞 B 细胞 辅助 T 细胞 (Th) 细胞毒 T 细胞 (Tc) 调节 T 细胞 (Treg) NK 细胞 形态基本相似, 主要依靠 表面标志检测区分不同亚群
6 细胞表面标志 (cell surface marker) 存在于细胞表面的特异的可供鉴别的膜分子 不同淋巴细胞亚群 淋巴细胞分化的不同阶段 淋巴细胞的不同活化状态 介导与其它细胞 分子之间的相互作用以及淋巴细胞生物功能
7 分化抗原 (differentiation antigen) 有核细胞在发育的不同阶段 不同的细胞亚群和受不同刺激而活化过程中出现或消失的细胞表面抗原 是区分淋巴细胞的重要标志
8 分化抗原 (differentiation antigen) 性质 : 跨膜蛋白或糖蛋白 ( 大多数 ) 碳水化合物半抗原 ( 少数 ) 结合方式 : 跨膜结合 ( 胞外区 - 跨膜区 - 胞内区 ) 锚合 : 糖基磷脂酰肌醇 (GPI) 分布 : 白细胞 红细胞 巨核细胞 / 血小板 非造血细胞
9 分化抗原分类 根据胞膜外区结构特点, 可分为不同家族 : 免疫球蛋白超家族 (IgSF) 细胞因子受体超家族 C 凝集素超家族 整合素家族 肿瘤坏死引子超家族 (TNFSF) 肿瘤坏死因子受体超家族 (TNFRSF)
10 簇分化抗原 (cluster of differentiation,cd ) 人类白细胞分化抗原以单克隆抗体鉴定为 主的聚类分析法 将识别同一分化抗原的来自不同实验室的 单克隆抗体归为一个分化群, 简称 CD (cluster of differentiation) 在许多场合下, 抗体及其识别的相应抗原 都用同一个 CD 序号
11 CD 抗原 鉴定与检测 : 单克隆抗体 ( McAb) CD 抗原国际统一编号 目前已鉴定的 CD 分子达 300 多种, 已弄清 130 多种 CD 分子编码基因的核苷酸序列及其染色体定位 很少通过单一 CD 抗原区分某一淋巴细胞亚群
12 CD 分组 T 细胞相关 CD B 细胞相关 CD 髓系细胞相关 CD NK 细胞相关 CD 血小板相关 CD 激活抗原 粘附分子 内皮细胞 细胞因子受体
13 一 T 淋巴细胞表面标志 : 分化抗原 (CD 分子 ) 丝裂原受体 细胞因子受体
14 1. 分化抗原 T 细胞表面主要 CD 抗原及其分布 CD 抗原 CD2(ER) CD3 CD4 (HIVR) CD8 CD25(IL-2R) CD28 CTLA-4 CD40L 分布 全部 T 细胞和 NK 细胞成熟 T 细胞 Th 细胞 Mφ Tc 细胞 部分 NK 细胞活化 T 细胞 T 细胞活化 T 细胞活化 T 细胞
15 (1)CD2: 表达 : 全部 T 细胞和 NK 细胞表面 ; CD2-1,2,3 CD2-1,CD2-2 表达于静止 T 细胞表面 CD-2,CD2-3 表达于活化 T 细胞表面生物学功能 : 粘附分子, 又称 LFA2, 配体为 LAF3 1 增强 T 细胞与 APC 或靶细胞之间的粘附, 促进 T 细胞对抗原的识别 2 胞浆区可与多种酪氨酸激酶相连, 介导信号传导
16 CD2 可与绵羊红细胞 (SRBC) 结合, 故又称绵 羊红细胞受体 (E 受体 ) E 花环试验 : 测定外周血 T 细胞总数 外周血淋巴细胞 + SRBC T 淋巴细胞 CD2- 多个 SRBC 形成致密花环 计数外周血 T 细胞总数
17 (2)CD3: 表达于全部 T 细胞表面 T 细胞表面标志 由 γ δ ε ζ 和 η 五种链组成的跨膜多肽链复合体 通过其跨膜区的带负电的氨基酸与 TCRαβ 或 TCRγδ 跨膜区带正电的氨基酸形成盐桥, 而形成稳定的 TCR-CD3 复合物
18 (2)CD3: 生物学功能 : 胞浆区含有与免疫细胞活化信号转导有关的免疫受体酪氨酸活化基序 (ITAM) TCR-CD3 复合体 : TCR 负责识别抗原肽 -MHC 分子复合物,CD3 分子负责传递活化信号进入细胞内
19 (3)CD4 和 CD8 分子 : T 细胞亚群的表面标志, 将外周 T 细胞分为 两种不同亚群
20 CD4 分子 :T 辅助细胞标志 单链跨膜蛋白, 胞膜外结构属 IgSF 成员, 共 4 个 IgSF 结构域 第一 二结构域可与 MHCⅡ 类分子结合 HIV 受体 生物学功能 :TCR-CD3 识别抗原的辅助受体, 通过与 MHCⅡ 类分子结合, 通过其胞浆区与 p56 lek 激酶结合参与信号传导
21 CD8 分子 : 细胞毒性 T 细胞标志 由 α β 链借二硫键连接形成的异二聚体, 胞膜外结构属 IgSF 成员 α 链 V 样区与 MHCⅠ 类分子非多态 α 3 区域结合 生物学功能 : 胞浆区可与 p56 lek 激酶结合参与信号传导
22 CD4 和 CD8 分别是 MHC-II 类或 MHC-I 类分子 的受体, 可加强和稳定 T 细胞表面 TCR 与抗原呈递细胞或其它靶细胞表面非己抗原肽 -MHC 分子复合物的结合, 并有助于 TCR-CD3 信号传递
23 CD3 + CD4 + CD8 - T 细胞辅助性 T 细胞 (T helper,th), 主要识别 MHCⅡ 类分子结合的外源性多肽抗原, 具有辅佐或诱导免疫应答的功能, 部分细胞也有杀伤和抑制功能 ; CD3 + CD4 - CD8 + T 细胞细胞毒性 T 细胞 (cytotoxic T cell, CTL 或 Tc), 主要识别 MHCⅠ 类分子结合的内源性多肽抗原, 具有杀伤靶细胞和抑制免疫功能
24 Th 细胞分类根据分泌细胞因子不同将其分为 : Th0 Th1 Th2 Th3(TGF-β) Th17(IL-17) 等 其他 CD 抗原也可作为区分 Th1 和 Th2 的相对特异标志 : Th1 CD3 + CD4 + CD30 - Th2 CD3 + CD4 + CD30 +
25 IL-5 体液免疫 辅佐 B 细胞增殖和抗体生成, 对清除游离病原体起重要作用 细胞免疫 介导细胞免疫和局部炎症反应, 对清除胞内病原体起很重要作用
26 细胞毒性 T 细胞 (Tc) 分类 根据分泌细胞因子不同将其分为 : Tc1(IFN-γ) Tc2(IL-4 IL-5 IL-10) 其他 CD 抗原也可作为区分 Tc1 和 Tc2 的相对特异标志 : Tc1 CD3 + CD8 + CD30 - Tc2 CD3 + CD8 + CD30 +
27 调节性 T 细胞 CD4+ 调节性 T 细胞 : 表型 :CD4+CD25+Foxp3+ 包括 :Tr1(IL-10) Th3(TGF-β) 主要作用方式 : 直接接触 分泌细胞因子 CD8+ 调节性 T 细胞 包括 :CD8+CD28-Treg 和 CD8+Qa-1 限制性 Treg 主要主要方式 : 调控 APC 免疫耐受 ( 抑制 CD80/CD86 分子表达 抑制 IL-12 分泌 促进 IL- 10 合成等 )
28 (4)CD28 和 CTLA-4(CD152) 经典共刺激分子 两者结构高度同源, 均是由两条多肽链连接而成的同源二聚体 CD28: 表达于几乎所有 CD4+T 细胞, 50%CD8+T 细胞 浆细胞和部分活化 B 细胞也有表达 CTLA-4: 仅表达于活化 T 细胞
29 CD28 和 CTLA-4 的天然配体均是 B7(CD80/CD86) CD28 B7(CD80/CD86) 传递 T 细胞活化第二信号 ( 协同刺激信号 ) CTLA-4 B7(CD80/CD86) 给予已活化 T 细胞抑制信号
30 (5)CD40L(CD154) Ⅱ 型跨膜蛋白 主要表达于活化 CD4+T 细胞和 CD8+ T 细胞表面 CD40L 与 B 细胞表面的 CD40 相互作用, 提供协同刺激信号参与促进 B 细胞增生 分化 抗体合成和胸腺依赖抗原 (TD-Ag) 诱发的免疫应答反应
31 4. 致有丝分裂原受体 致有丝分裂原 (mitogen) 能与相应受体结合, 刺激静止期淋巴细胞转化为淋巴母细胞, 发生有丝分裂而增殖 最常用的 T 细胞丝裂原 : 植物血凝集素 (PHA) 人 刀豆蛋白 A(ConA) 鼠
32 5. 病毒受体病毒通过这类受体可以选择性地感染某个 T 细胞亚群 如 HIV 可以感染辅助性 T 细胞 (CD4+ 细胞 ) 引起艾滋病 6. 其他表面标志白细胞介素受体 整合素受体 转铁蛋白受体等
33 课间休息!
34 二 B 细胞的表面标志 : BCR CD28 和 CTLA-4 配体 B 细胞活化第二信号 CRⅠ (C3bR) CRⅡ (C3dR) BCR
35 B 细胞的表面标志 : 膜免疫球蛋白 (SmIg,BCR) 补体受体 (CR) Fc 受体丝裂原受体 MHC 抗原 分化抗原 (CD 分子 ) 细胞因子受体
36 1. B 细胞抗原受体 / 表面免疫球蛋白 ( B-cell antigen receptor, BCR / surface membrane immunoglobulin, SmIg ) 镶嵌于细胞膜类脂质分子中的免疫球蛋 白 表达于成熟 B 细胞和大多数 B 细胞瘤细 胞 成熟 B 细胞主要表达 migm 和 migd, 含 量与成熟程度相关 : IgM>IgD 则较幼 稚,IgD> IgM 则较成熟
37 BCR--Igα/Igβ 复合体
38 BCR 是 B 细胞最具特征性的表面标志 BCR 既是 B 细胞识别抗原的受体, 能与相应的抗原特异性结合 (BCR 直接识别未经加工处理的天然抗原 ); 又是表面抗原, 能与抗免疫球蛋白的抗体特异性结合 常用抗 Ig 抗体借助荧光法来鉴定 B 细胞
39 2. 补体受体 (CR): 表达于成熟 B 细胞表面 主要是 C3 受体 主要包括 : 补体受体 1( CR1) 补体受体 2(CR2)
40 补体受体 1(CR1) CD35 又称 C3b 受体或 C3b/C4b 受体 可与 C3b 和 C4b 结合, 促进 B 细胞活化
41 补体受体 2(CR2) CD21, 是 B 细胞的重要标记 又称 C3d 受体, 同时也是 EB 病毒的受体 表达于成熟 B 细胞 滤泡 DC 细胞 咽部和宫颈上皮细胞 可与 ic3b 和 C3d( 或 C3dg) 结合 CD21 与 ic3b 和 C3d 结合, 其信号与 BCR 信号联合, 增强 B 细胞对抗原的应答 ; 同时参与免疫记忆
42 3. Fc 受体 CD32 识别并结合 IgG-Fc 与 B 细胞活性相关 Fc 受体可与抗体包被的红细胞相结合形成 EAC 花环, 是鉴别 B 细胞的传统方法之一
43 4. CD 抗原 B 细胞表面有大量 CD 抗原表达 : 在分化成熟过程中表达不同的 CD:CD10(B 前体细胞 ) CD22( 成熟 B 细胞 ) 随 B 细胞活化状态而改变的 CD: CD20(B 细胞激活后逐渐丢失 ) 细胞功能相关的 CD:CD21 CD35 CD32
44 成熟 B 细胞分类标志 :CD19 CD5 CD19: 存在于除浆细胞外的各阶段 B 细胞, CD19 在 B 细胞活化后不消失 CD5: 区分 B1 细胞和 B2 细胞 B1:C19+CD5+ B2:CD19+CD5-
45 B1 和 B2 细胞的表面标志 表面标志 B1 细胞 B2 细胞 IgM IgD +/ CD5 + - CD CD CD CD MHCⅡ
46 B1 与 B2 细胞的比较 特点 B1 B2 发生 早 晚 分布 ( 成年 ) 腹腔 胸腔 周围免疫器官非胸腺依赖区 针对抗原 多糖抗原 主要为蛋白质抗原 抗体产生 细菌抗原及自身抗原 广谱抗原 抗体种类 IgM>>IgD IgD>>IgM 更新情况 自我更新 不断新生 ( 骨髓区 ) 比例 10% 90%
47 B 细胞的亚群及功能 B1 细胞 (CD5+): 参与机体免疫调节, 产生的抗体主要为亲和力较低的 IgM 型, 在对多糖抗原的免疫应答及对防止肠道细菌等病原微生物的感染具有重要作用, 与免疫调节 自身免疫病 B 细胞源性肿瘤密切相关 B2 细胞 (CD5-): 执行体液免疫功能, 产生特异性较强 亲和力较高的 IgG 型抗体, 在对蛋白质抗原的免疫应答中起主要作用
48 三 NK 细胞表面标志 : NK 细胞表面有多种抗原 :CD2 CD16 CD56 CD69 CD94 CD96 CD158a CD159a CD161 和 CD244 等, 均非其特有, 目前多以 CD3 - CD16 + CD56 + 作为其典型标志 健康成年人外周血 NK 细胞占淋巴细胞总数的 8%~15%
49 自然杀伤细胞 (natural killer, NK) 自然杀伤细胞 无需抗原刺激, 可非特异性地杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞, 是参与机体免疫应答反应特别是肿瘤免疫应答的重要淋巴细胞 活化的 NK 细胞可分泌 IFNγ GM-CSF 等因子, 发挥杀伤细胞或调节造血和免疫应答的功能
50 NK 细胞表面标志的检测 目前临床上常采用三色荧光标记单克隆抗体 ( 抗 CD3 抗 CD16 和抗 CD56 抗体 ) 标记 NK 细胞, 在流式细胞仪上进行计数分析
51 T B 及 NK 细胞表面标志的比较 表面标志 T 细胞 B 细胞 NK 细胞 膜免疫球蛋白 (SmIg) TCR CD CD CD19,CD CD16,CD 补体受体 (CR) - + 部分 Fc 受体 - + +
52 第二节 淋巴细胞表面标志的检测及应用
53 一 淋巴细胞表面标志的检测方法 抗体致敏花环法 免疫细胞化学法 免疫荧光法 流式细胞分析法
54 ( 一 ) 抗体致敏细胞花环法 T 淋巴细胞 抗体标记红细胞 抗 CD3 单克隆抗体
55 ( 一 ) 抗体致敏细胞花环法 CD3- 抗 CD3 抗体 细胞数 %= 阳性细胞数 / 总计数细胞 100%
56 ( 二 ) 免疫细胞化学法 常用技术 : 细胞酶免疫组化技术生物素 - 链霉亲和素放大系统以酶作为抗体标记物 观察方法 : 普通显微镜观察 结果判断 : 凡着色的细胞即为相应 CD 抗原阳性细胞 阳性细胞 / 总记数细胞 100%
57 ( 三 ) 免疫荧光法 直接法 荧光标记特异性抗体 显微镜观察或流式细胞仪 间接法 特异性抗体 + 荧光标记二抗 显微镜观察或流式细胞仪
58 二 淋巴细胞表面标志应用 1. 淋巴细胞及其亚群的鉴别 2. 研究淋巴细胞分化过程和功能 3. 临床上研究某些疾病的发病机制和诊断方法
59 各种疾病均可出现不同群淋巴细胞数量和功能的变化, 如 : 艾滋病患者 CD4+T 细胞明显减少甚至缺乏 (CD4+/CD8+ 比值小于 0.5); 巨球蛋白血症患者 B 细胞数量明显增高 自身免疫病患者 B 细胞功能大多亢进, 免疫缺陷病患者免疫细胞功能严重低下
60 小 结 T 淋巴细胞及亚群分类标志及其它表面标志 B 细胞亚群分类标志及其它表面标志 NK 细胞表面标志 细胞表面标志检测方法
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传染病 性传播疾病 考点 总论 1 下列五种感染过程中最常见的是 A 病原体被清除 B 隐性感染 C 显性感染 D 病原携带状态 E 潜伏性感染 考点 感染过程的各种表现 解析 病原体被清除的特点是病原体在体内被消灭或排除体外 病原携带状态的特点是引起轻度病理损害 而人体不出现疾病的临床表现 潜伏性感染的特点是病原体一般不排除体外 不易成为传染源 显性感染 导致组织损伤 引起严重病理改变和临床表现
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第十四章抗原提呈细胞与抗原的处理及提呈 早期研究发现, 在胸腺依赖性抗原诱导 B 淋巴细胞产生抗体的过程中, 不仅需要 T B 淋巴细胞的协同作用, 还需要另一类细胞的协助, 遂将该类细胞称为辅佐细胞 (accessory cells) 现已知辅佐细胞在机体的免疫应答过程中起着十分重要的作用, 能摄取 加工 处理抗原并将抗原信息提呈给 T 淋巴细胞, 故又称为抗原提呈细胞 (antigen-presenting
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( 一 ) 淋 巴 系 統 與 循 環 A 淋 巴 系 統 的 功 能 : (1) 包 括 淋 巴 淋 巴 管 淋 巴 組 織 淋 巴 器 官 (2) 回 收 組 織 液 : 有 組 織 液 送 回 血 液, 以 維 持 血 液 成 分 恆 定 (3) 運 送 脂 溶 性 養 分 : 運 送 小 腸 乳 靡 管 吸 收 的 脂 溶 性 養 分 回 血 液 (4) 產 生 免 疫 反 應 : 具 有
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