工業生產之seed的調製

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1 6 工業生產之 seed 的調製前言發酵時要接種的 seed( 又稱種母 ), 必須具備下列的條件 1. 健康富有活力, 可以縮短發酵上的誘導期 (lag phase) 者 2. 具備能充分供給在接種時之最適量的菌數 3. 具備適當的形態者 4. 未受雜菌污染者 5. 具備充分之發酵生產的力價要調製此種 seed, 其最主要的地方就是在培養基的選擇要進行 seed 培養基選擇時, 對其以後之主發酵的發酵會有何影響需加以探討如第 4 章所述之發酵生產培養基, 並非只依所使用之微生物的營養要求來決定, 必須具有可獲得最大生產性的東西 Seed 培養其目的並非在蓄積生產物, 當然 seed 培養基組成與主發酵之生產培養基組成是不同的 Lincoln(1960) 說, 主發酵的誘導時間 (lag time), 可使用 final-type 培養基 ( 並非肉汁或酵母 extract 等天然物所配成的培養基, 是以糖鹽類 vitamin 等所組成之生產培養基加以改變成的 seed 培養基 ) 使生育縮短為最小此種想法含有很重要的重點, 即使 seed 培養基與生產培養基類似, 來使其對主發酵的適應時間縮短時, 就可以縮短誘導時間而達縮短發酵時間 Seed 培養基與生產培養基的例子則如表 6.1 所示 Seed 培養基與一般生產培養基比較時, 其營養成分較低, 尤其是碳 (C) 的濃度很低 Seed 的添加量, 普通對主發酵為 3~10%(Lincoln,1960;Meyrah and Suchanek,1972), 從保存菌株開始到主發酵的生產培養基中, 為了要得到充分的菌量, 故需重複數次的 seed 培養來增量因此其中需經 2~3 次的 flask 培養來增量以及依最終階段之主發酵槽的大小來決定還需經幾次的以 tank 來做 seed 培養, 使達到所需的接種量在此過程中會有雜菌汙染回歸變異等所引起生產力價下降的問題, 故需有嚴格的運作管理由保存菌株到主發酵間的增殖階數 ( 次數 ) 愈多則更容易引起 contamination 或隨伴增殖菌之世代數的增加而造成生產力價的下降因此 seed 量是由 contamination 及隨伴增殖菌之世代數增加所造成之生產力價下降等危險性, 一併考慮在內所決定者 161

2 發酵工程的基礎表 6.1 各種發酵之 seed 培養基與生產培養基的比較發酵之種類 Seed 培養基生產培養基文獻 Griseofulvin Whey 粉末 Lactose Lactose:3.5% N:0.05% Lactose 7% CSL( 當 N 0.2%) Rhodes et al.(1957) CSL 0.38% 石灰 0.8% ( 當 N 約 0.04%) KH2PO4 0.4% KH2PO4 0.4% KCl 0.05% KCl 0.1% L-glutamic acid n-paraffin(c12-c14) 4.0% 10% Kikuchi et al.(1972) (NH4)2SO4 1.5% 0.5%(+NH3 feed) CSL 0.1% - CaCO3 2.0% 1.0% KH2PO4 0.1% 0.1% MgSO4 7H2O 0.05% 0.05% K2HPO4 0.25% 0.25% FeSO4 7H2O 0.03% 0.03% MnSO4 XH2O 0.002% 0.002% ZnSO4 7H2O 0.002% 0.002% CoSO4 7H2O 0.001% 0.001% Glycerol 0.02% 0.02% Erythromycin Glucose 0.5% 4% Stark and Smith(1961) Corn 抽出物 0.3% 1% (NH4)2SO4 0.3% 0.6% NaCl 0.25% 0.25% CaCO3 0.5% 0.5% 鯨油 - 0.6% 在此則以代表性的 seed 培養加以詳述先將保存株 (master culture; 其保存法則如第 3 章所述 ) 播種於平板 (plate) 上, 再從中鉤取約 10 個具代表形態的 colony, 認為是高生產性者, 加以確認其力價後, 劃線培養於斜面 (slant) 上, 當做生產用保存株 (sub-master culture), 以此做為要進行發酵槽中培養時所用之原始 slant Colony 力價之確認則使用 flask 培養, 其結果的取得需在開始進行發酵生產的 seed 培養之前就要確認生產用保存菌株, 先以 250~500ml 之振盪 flask 培養, 然後再以實驗室型之小型 jar 或大型 flask 來培養使增殖後, 再以 pilot plant 規模之發酵槽來培養, 在培養中之各階段需進行檢查是否保持在純粹培養的狀態, 盡量使發生 contamination 的情形在很早的階段就檢出, 假如, 檢討的結果在把 seed 接到主發酵槽之前尚未很清楚時, 也可以做為在發生 contamination 時是由那一個階段所造成之污染的檢查, 是必要的胞子形成菌的情形, 以胞子懸浮液當 seed 使用的情形很多, 關於這部份在本章中另外加以敘述 162

3 6 工業生產之 seed 的調製 Lincoln(1960) 開發出複雜巧妙的細菌發酵用之 seed 培養法此種方法略加修正就可應用於所有細菌的培養該方法是以生產用保存株來進行適量的液體培養, 再將其分成數份, 置於超低溫來冷凍保存, 在數個月中以此當發酵槽 (batch) 的 starter 用即從生產用保存株進行分離 mono colony, 再以此做液體培養至對數增殖期時, 將其菌液接種到 19 倍量的液體培養基中, 再培養至對數增殖期, 然後再分裝成各 20ml 置於-20 以下之超低溫冷凍保存從中最少要取出 3% 的保存液來進行其 contamination 與其力價的確認, 剩餘的就做為各槽 (batch) 之發酵的 seed 使用, 一瓶解凍的保存液只當 5% 之 seed 量來使用, 即以前一階段的培養液成為 5% 之 seed 量的培養規模來使增量, 如此來調製主發酵所需的 seed 量, 到其前一階段之確實的 seed 調製就可以完成酵母細菌絲狀菌放線菌等各有不同的 seed 培養法, 以下就各別針對這些微生物加以敘述酵母的種母培養在發酵工業上使用酵母之最重要者, 是啤酒的釀造與菌體生產, 尤其是自古就被成為工業之麵包酵母的製造啤酒的種母在英國之啤酒釀造業界普通所進行之種母的調製法是, 以前面之槽 (batch) 的酵母當後面發酵之種母來使用 ( 稱為 pitch) 的方法採用此種方法的問題是, 容易引起 contamination, 以及尤其在增多其世代數時所引起的 flocculation 或活性劣化等引起菌之性質的變化在採用上面發酵時, 此種危險可在下一次 pitching 取其培養液之中間層 (middle skimming) 的酵母來使用就可減低發酵中的酵母會 flocculate 浮到表面, 最初浮上表面的酵母是最好的菌, 最後浮上的為最差的菌因此浮在表面之酵母中, 在最表層部份之 flocculation 太好者以及 contamination 危險較高者將其除去, 採取其下層部份即 middle skimming, 做為下次發酵的種母, 因此在 middle skimming 中的酵母是具有所希望的 flocculation 性質, 並且可防止啤酒表面之雜菌的混入 Pitching 起來的酵母, 為了要降低細菌的污染率以及除去蛋白質死酵母細胞, 將其酵母泥 (slurry) 的 ph 調降到 2.5~3.0, 再用水洗, 然後用過硫酸安清洗, 用 polymixin penicillin neomycin 等加以處理 (Mandl 等,1964;Strandskov,1964;Roessler,1968) 163

4 發酵工程的基礎雖然如此小心的調製, 此種種母使用的限度也只有 5 次 ~10 次 (Thorne,1970;Reed and Peppler,1973), 故需常常進行純粹分離此種情形, 必須由一個酵母細胞開始培養到 1L, 至少要能取得乾燥重量 2g 之酵母量的濃度, 如此增殖到能 pitch 之酵母的增殖過程 Hansen(1896) 最早開發純粹分離法, 在相同釀造條件下酵母的增殖只要使用 10% 的種母即可但是最近的啤酒工廠其種母量則用 1% 或以下, 發酵條件也很多隨之改變因此在酵母之增殖中則採用通氣培養, 這種情形將會對啤酒的品質造成某種的影響 (Curtis and Clark,1957) 依 Hoggan(1977) 說, 使用圓錐形 (conical) 型發酵槽時, 其發酵受種母培養槽之培養條件影響很大, 他認為需要使種母培養槽與發酵槽的溫度大致相同, 並使種母增殖的時間與在發酵槽中的培養時間相同, 然後當酵母達到最大生育後, 保持在種母培養槽中數小時以上時就會發生 flocculation, 造成後面發酵槽之誘導期延長關於種母培養槽 ( 密閉, 通氣型 ) 之段數則有文獻的記載最簡單的種母培養槽是一段式無攪拌的通氣槽, 將純粹分離到的酵母經振盪培養然後再進行移植 (Gilliland,1971) Curtis & Clark(1957), 以及 Thorne(1970) 報告半連續型之二段種母培養槽 Thorne 之種母培養槽是以 1.5L 與 150L 的兩個槽連結起來者, 在小的槽 (tank) 中加入麥汁經殺菌冷卻後, 接入由通氣 flask 所培養的種酵母, 經 3~4 天培養後, 其培養液以氣壓送到裝入麥汁並經殺菌冷卻, 在通氣中的大槽 (tank) 中, 經混合後, 將其中的 1.5L 再逆送回小槽中, 在大槽這邊經 3~4 日培養使酵母充分生育後再移送到 1m 3 之槽中, 小槽這邊的酵母也同樣處理後, 再移植到大槽中, 做為後面之槽 (batch) 的運作來使用, 此種情形, 為防止 contamination 發生之純粹酵母的培養則可以做到, 但對世代數之增加所造成酵母之變性方面則無法防止麵包酵母工業用麵包酵母的培養, 需經數段的增殖培養, 在培養之最終階段的主發酵, 必須要嚴格在無菌條件下進行, 在培養初期也要盡量防止 contamination 的發生, 在種母之越早的階段要求更高的無菌性 Reed & Peppler (1973) 檢討培養麵包酵母之種母培養, 培養分成 5 段, 最初的 2 段是無菌培養, 剩下的 3 段則採開放槽培養, 最初的 2 段是用密閉槽, 不通氣不添加流加液, 他們的理由是, 在很小的設備中, 加裝各種附帶設備會提高其成本, 但是, 依 Rosen(1977) 說, 在最初的槽給予通氣會比較好 164

5 6 工業生產之 seed 的調製典型的麵包酵母培養, 酵母在各階段之增殖的例子, 如圖 6.1 所示圖 6.1 麵包酵母的 seed 培養 (Burrows,1970). 細菌的 seed 培養利用細菌的發酵, 需要 seed 培養的主要目的, 是要縮短主發酵之誘導期, 故需調製具有此種活性的 seed 很長的誘導期會造成時間與培養基的雙重浪費誘導期的長短會受接種量與菌的生理活性的影響 (Meyrath and Suchanek,1972) 如前所述, 接種量普通是培養液量的 3~10% 左右 Lincoln(1960) 認為細菌的 seed 需在細胞具有充分代謝活性之對數增殖期就要移殖 Seed 的世代數 (age) 對有胞子細菌特別重要, 胞子的形成是在對數增殖期的末期進行, 假如 seed 中含很多帶胞子的細胞則會使主發酵中的誘導期變得很長之影響 Keay 等 (1972) 報告以 5% 對數增殖期的細胞當 seed 來生產耐熱性 Bacillus 的 protease Aunstrup(1974) 使用 2 段 seed 培養法來生產 B.subtilis 的 protease 要接種到 seed 培養槽中的 seed 則使用在固體或液體 ( 振盪 ) 培養基中培養 1~2 天的菌, 將其移植到 seed 培養槽中使增殖約 10 世代後, 再移植到主發酵槽表 6.2 是表示以 B.subtilis 生產 bacitracin 之 seed 培養依 Underkofler(1976) 的方法, 在生產細菌酵素時, 使 seed 培養之培養基組成與生產培養基相同, 使用具有大量活性之 seed 於工廠之發酵槽, 可使其誘導期幾乎可以變成 0 使用生理活性很強之 seed 的必要性, 在醋 165

6 發酵工程的基礎的製造中, 也可以強烈的體會到在醋的製造中所用的醋酸菌是很強的好氣性菌, 對氧氣不足的感受性很強, 因此為了要避免發生困擾, 以發酵終了之細胞當下次發酵之 seed 來用, 故從發酵槽中約取走 60% 的培養液, 然後再補充新的培養基使達到原有的液量再繼續發酵 (Conner and Allgeier, 1976) 此種情形, 使用具有活性很強之 seed 的優點是, 比以培養液 recycle 造成世代數增加所引起之變性或 contamination 危險性之缺點要大得多表 6.2 以 Bacillus subtilis 生產 bacitracin 之 seed 培養 (Inskeep 等,1951) Seed 培養 stage 培養條件培養時間 1 由保存 slant 接種 18~24 hr 到 4L 之振盪 flask 中 2 移植到 750L 之 jar 中 6 hr 3 從 750L jar 移植到 6 m 3 tank 中直達最大增殖速度為止 4 從 6 m 3 tank 移植到 120 m 3 生產槽中嫌氣性細菌之 seed 培養的例子, 可從 acetone butanol 發酵中看出, 此種發酵現在只有南非在進行, 在第一次世界大戰中, 以及戰後, 是一種非常重要的發酵, 而且最近又被重視起來 (Bu Lock,1975) 此種發酵之 seed 培養則有 Beech(1952) 的報告, 表示於表 6.3 中從種菌調製 seed 時, 先以 heat shock 處理來促進胞子的發芽及淘汰較弱之胞子的操作開始表 6.3 Acetone butanol 發酵之 seed 培養 (Beech,1952) Seed 培養培養條件培養基 stage 1 由保存胞子開始培養 (24hr) Potato glucose 培養基 2 上述培養物移植到 600mL 之培養基中 (20~24hr) 含 4% 轉化糖之 molasses 5%(NH4)2SO4 6%CaCO3 0.2% 五氧化磷 3 將 stage 2 之培養液 90mL 接種到含 3L 培養基與 stage 2 相同之 4L 的 Erenmeyer flask 中 4 將 stage 3 之培養液移植到 25L 之發酵槽中糖濃度為 6% 之 stage 2 培養基 5 將 stage 4 之培養液接種到 300m 3 ~2500m 3 發酵與 stage 4 相同, 但需流加 ammonia 槽中, 使成 0.5~3% 的接種量 166

7 6 工業生產之 seed 的調製依南非之 acetone butanol 發酵的報告 (Lurie,1975), 僅以 10L 的 seed 來進行 100m 3 的 tank 培養, 以此種少量之 seed 所進行的發酵, 是可以防止 contamination, 而且誘導期不會變得很長絲狀菌之 seed 培養絲狀菌之發酵的 seed 調製, 比起細菌或酵母的情形要稍微複雜一些 (Hockenhull,1980) 在發酵工業中所用之絲狀菌幾乎都具有無性胞子形成能, 在調製 seed 時普通是使用胞子懸浮液要做 seed 用之高濃度胞子的調製則有下列三個重點以洋菜培養基來形成胞子大部份的絲狀菌在洋菜培養基上都會形成胞子, 要使充分的製造胞子則需很大的表面積 Parker(1950) 使用 roll-bottle 來使 P.chrysogenum 形成胞子, 把 300mL 含 3% 洋菜之培養基裝入 1L 之 cylinder 型瓶中, 冷卻至 45 C, 再以 roller mill 使迴轉時, 洋菜就會在瓶的內部凝固成圓筒狀, 再接入生產菌之保存 slant 中的胞子, 在 24 C 培養 6~7 日依 Parker 說, 以 roll-bottle 法, 其生育狀況則無法以肉眼視察, 因要擴大表面使其形成胞子, 如此就能擴大表面積, 用在實驗室的 seed 調製則很方便以固體培養基來形成胞子絲狀菌在穀物的表面上會形成大量胞子的很多大麥麩割碎玉米等廣被用來調製絲狀菌的胞子, 胞子的著生會受這些培養基之穀物, 在殺菌前之加水量與培養環境之濕度的影響, 培養環境的濕度愈高就越有利於胞子的形成 (Vezina and Singh,1975) Singh 等 (1968) 報告,Aspergillus ochraceus 之胞子調製法, 在含 200g 除去外殼之釀造用大麥 (pot barley) 或 100g 浸漬後的麩當培養基之 2.8L Fernbach flask 中, 置於 28 C, 相對濕度 98%, 培養 6 日可得到 5x10 11 的分生胞子 (conidia), 此與在 Roux flask 中之 Sabouraud agar 上, 在相同條件下, 相同培養時間下所得到之胞子量比較時, 約有其 5 倍, 約為 Difco nutrient agar 上所培養時的 50 倍之多 Vezina 等 (1968) 發表 Phycomycetes Ascomycetes Deuteromycetes Basidiomycetes 等在穀類上容易產生胞子之菌種的目錄 Sansing & Cieglem(1973) 報告以白麵包使 Aspergillus 及數種 Penicillium 大量產生胞子的方法 167

8 發酵工程的基礎以深部培養法來形成胞子培養基要適當時, 很多的絲狀菌在深部培養中就會形成胞子 (Vezina 等, 1965), 以此種方法在工業上來製造絲狀菌之 seed 的例子則有 griseofulvin 發酵 Rhodes(1957) 等, 報告 griseofulvin 生產菌之 Penicillium patulum, 以深部培養法來製造胞子, 其培養基組成如表 6.4 所示他們認為要使胞子的形成良好, 需限制氮濃度在 0.05~0.1%(w/v) 之間, 並給予充分的通氣, 而且氮濃度與通氣之間有相互作用存在, 通氣較少時, 要使氮濃度降低才會形成胞子以表 6.4 中所示之培養基組成, 600mL 裝入 2L 之振盪 flask 中, 再接入在 Czapek-Dox 上胞子著生良好的 slant 種菌, 置於 25 C 培養 7 日, 如此所製作的胞子液, 接種 10% 到攪拌型發酵槽中來製作菌絲 seed, 再將此接種到生產培養基中使達 10% 進行主發酵菌絲 seed 培養基與生產培養基之組成則如表 6.1 所示表 6.4 P.patulum 在深部培養時之胞子形成培養基 (Rhodes et al.,1957) Lactose 3.5% Whey 粉末 N 0.05% KH2PO4 0.4% KCl 0.05% CSL(N 量約 0.04%) 0.38% 胞子 seed 工業規模之大量胞子的 seed 製作則有各種方法,seed 之最終階段 ( 在主發酵槽中所用的 seed) 都是共通的依 Parker(1950) 的報告,penicillin 發酵之 seed 培養則如表 6.5 所示表 6.5 Penicillium chrysogenum 生產 penicillin 之 seed 培養 (Parker,1950) 第 1 段第 2 段第 3 段第 4 段第 5 段原株是以胞子的形態保存於砂中做成 slant 當運轉用的 seed 將 slant 之 seed 接種到 1L 培養基中, 在 roll bottle 中培養移植到實驗室規模之 jar 中使菌絲增殖進行 penicillin 生產之主發酵依該表中可知,seed 之最終階段, 是以培養 roll-bottle 之胞子的懸浮液, 在此製造主發酵用之菌絲增殖是利用由深部培養所形成的胞子在 griseofulvin 發酵, 依 Rhode 等 (1957) 以深部培養所製作的胞子, 也可以直 168

9 6 工業生產之 seed 的調製接當生產培養基的 seed 使用, 或接到 seed 培養基中使發芽成菌絲後再接入生產培養基中也可以, 實際上選擇後者的情形較多, 其接種量是 7~10% Aspergillus niger 之 gluconic acid 發酵, 依 Lockwood(1975) 的方法說, 要接種到主發酵之胞子懸浮液, 使其胞子發芽成菌絲後再接種會較好以胞子直接接種的方法在設備費上較便宜, 在 seed tank 的運作經費也較省另外, 使胞子發芽成菌絲 seed 時在主發酵的培養時間就可以縮短, 使一年中的運作次數可以增加但是要使胞子發芽成菌絲 seed 的製作, 與主發酵槽之運作相同要費一樣的勞力在 seed tank 所生成的 gluconic acid 能在主發酵液中一起被回收, 或考慮增大 tank 容量之效果等, 但都會有使人事費增大的缺點 Lockwood 認為在工廠生產上, 其 seed 製作方法的選擇是由運作次數發酵槽之規模與生產量人事費等來決定菌絲 seed 有些絲狀菌是不會形成胞子的, 此種情形則需做成菌絲 seed 如 Gibberella fujikuroi 就是其中之一的絲狀菌, 此種菌則應用在工業上生產 gibberellin(borrow 等,1961) Hansen(1967) 報告 gibberellin 發酵之 seed 培養, 先在 potato dextrose 洋菜 slant( 長度為 25x150mm) 上, 在 24 C 培養一週, 再從 3 支此種 slant 刮取菌體接入含有 4L 培養基 (2% glucose, 0.3% MgSO4.7H2O 0.3% NH4CI,0.3% KH2PO4) 之 9L 的 Carboy 瓶中, 在 28 C 一面通氣培養 75 小時, 再移植到含 100L 相同培養基組成的 seed tank 中要以菌絲當 seed 用之難點是在不容易製成在形態上有相同標準的菌絲在這方面的對策之一, 即要以菌絲為 seed 使用之前, 先以 waring blender 之類的 homogenizer 使分斷的方法, 此種方法可做出很多的菌絲片段, 此就等於可以供給更多的 seed Worgan (1968) 有詳細的報告利用此種方法在絲狀菌的深部培養絲狀菌深部培養菌之形態對 seed 的影響絲狀菌在深部培養中生育時, 菌絲會由所形成之凝集塊的 pellet 開始在培養液中均質分散成 pulp 狀, 菌會呈各種形態 (Whitaker and Long, 1973) 深部培養所形成之菌絲形態會影響工業生產, 這是由培養基組成與胞子 seed 之胞子濃度所造成通常胞子濃度很高則會形成 pulp 狀, 胞子濃度很低則形成 pellet 狀 (Foster,1949) P.chrysogenum 之胞子 seed 的胞 169

10 發酵工程的基礎子數與形態之關係如表 6.6 所示表 6.6 培養基與胞子接種量對 P.chrysogenum 在深部培養之菌絲形態的影響 (Camici et al.,1952) 培養基接種胞子量形態 CSL-dextrin 個 /L 以上 Pulp 個 /L 以下 Pellet Czapek dox 個 /L 以上 Pulp 個 /L 以下 Pellet Glucose- 乳糖個 /L 以上 Pulp 乳酸氨個 /L 以下 Pellet 在 citric acid penicillin 深部培養 mushroom 絲狀菌蛋白質之生產等, 生產菌之形態對生產物蓄積有很大的影響這些則摘要成如表 6.7 所示這些物質的工業生產, 要使用形成所希望之菌的形態當 seed, 因此需要實施 seed 的管理使達到其目的假如要使用胞子 seed 時, 則需要控制胞子的濃度, 使在發酵槽中形成所期望的菌絲形態另外使用菌絲 seed 時, 則要製作使在發酵槽中會形成所期望之菌絲形態的 seed 在菌絲 seed 培養基中接入適當量的胞子來製作另外若要使胞子在 seed tank 中發芽時, 其培養基的組成也要具備會使誘發形成所期望之菌絲形態的條件 Whitaker 與 Long(1973) 討論在深部培養中, 菌絲之形態與培養基組成的關係表 6.7 菌絲形態對發酵生產之影響發酵之種類微生物最適之文獻菌絲形態 Penicillin P.chrysogenum Pulp Dion et al.(1954);smith and Calam(1980) Citric acid A.niger Pellet Snell and Schweiger(1949);Clark(1966); Al Obaidi and Berry(1980) Mushroom 之深部培養 Agaricus campestris Pellet Szuecs(1958) 絲狀菌 SCP 未記載 Pulp Solomons(1975) 表 6.7 所例出之發酵生產菌的形態可能與通氣攪拌效果會有關係關於這方面則在第 9 章敘述放線菌之 seed 培養大部份的工業用放線菌都會形成無性胞子, 因此與絲狀菌相同, 在製作 seed 時大多使用胞子懸浮液,, 要使形成高濃度之胞子時則使用洋菜培養基是最普通的方法但是 Stark 與 Smith(1961) 說要使培養基凝固的洋菜, 對菌的生育或胞子形成之雙方或對某一方會有抑制效果, 為了要除去此種有毒物質, 故洋菜需要經過水洗放線菌之代表性的胞子形成培養基則如 170

11 6 工業生產之 seed 的調製表 6.8 所示表 6.8 放線菌之胞子形成培養基菌種生產物培養基文獻 S.aureofaciens Tetracycline Beef extract 2.0% Di Marco and Pennella(1959) Aspartic acid 0.05% Glucose 1% K2HPO4 0.05% Agar 1.3% Aureofaciens Tetracycline Malt extract(difco) 1.0% Williams et al.(1974) Yeast extract(difco) 0.4% Glucose 0.4% S. Erythreus Erythromycin Beef extract(difco) 0.1% Williams et al.(1974) Yeast extract(difco) 0.1% Casamino acid(difco) 0.2% Glucose 0.2% S. melanochronogenes Actinomycin L-aspartic acid 0.1% Williams et al.(1974) Beef extract(difco) 0.2% Glucose 1.0% KH2PO % S.vinaceus Viomycin CSL( 固形物 50%) 1.0% Williams et al.(1974) 澱粉 1.0% (NH4)2SO4 0.3% NaCl 0.3% CaCO3 0.3% 關於放線菌在深部培養中, 其形態有關問題的研究只有少數例子 (Williams 等,1974), 放線菌的情形則不會有像絲狀菌之 pellet 的嚴重問題 Williams 等報告在放線菌之深部培養生產抗生物質的工業用培養基中會形成 colony( 相當於絲狀菌的 pellet) 但是這個實驗只是大概的實驗條件而已, 與胞子濃度的關係則沒有報告,Lowton 等 (1984) 最近發現各種放線菌會形成各種形態的 pellet, 發現這些形態與胞子濃度培養基組成, 培養中所加入的力學強度等之間有關係但是在放線菌之深部培養中, 生產物蓄積與菌之形態間的關係, 到目前幾乎尚未瞭解工業生產設備中之 seed 的無菌接種工業生產設備上要接種 seed 的工作, 則有在實驗室規模之發酵槽, 或由胞子 suspension tank 到生產用發酵槽之培養液的移動, 或使培養液由 1 個發酵槽移動到另一個發酵槽等的接種操作 171

12 發酵工程的基礎來自實驗室規模之發酵槽或胞子 suspension tank 的 seed 要防止培養液移動時的 contamination, 需使雙方的 tank 保持在陽壓下, 同時供給 seed tank 殺菌用的蒸氣 Meyrath 與 Suchanek(1972) 報告從實驗室規模之發酵槽接種到工廠之發酵槽的設備, 如圖 6.2 所示連接點 A 普通有連接盲栓 ( 暗栓 )a, 操作時先將此螺旋稍微打開, 同時關閉 valve E, 打開 valve F 使少量的蒸氣從 A 排出, 然後關閉 valve F, 打開 E, 取下暗栓 a 時, 會由發酵槽這邊吹出無菌空氣暗栓 a 取下後立刻浸漬於很強的消毒液中取下 seed tank 這邊的盲栓 b, 立刻將 A 與 B 的螺旋接上鎖緊關閉 valve E, 將空氣管線接上 C, 使 seed tank 的壓力高於發酵槽打開 valve E 就會使 seed tank 中的液體全部壓送到發酵槽關閉 valve E, 使其與 seed tank 分開, 再將暗栓 a 裝上, 打開 valve F 時就會呈使蒸氣吹出的狀態圖 6.2 從實驗室規模之 jar fermentor 到發酵槽之 seed 法 (Meyrath and Suchanek,1972). Jackson(1985) 的報告則與由胞子 suspension tank 到發酵槽的 seed 設備完全相同 ( 圖 6.3), 其操作法則與 Meyrath 及 Suchanek 的方法完成相同圖 6.3 添加胞子懸浮液到發酵槽 (Jackson,1958). 172

13 6 工業生產之 seed 的調製 Parker(1950) 則設計出如圖 6.4 所示之稍微複雜的從胞子 suspension tank 到發酵槽的 seed 設備圖 6.4 胞子 seed 添加槽與發酵槽之連接及添加法 (Parker,1950). 在實驗室將 seed 的胞子液裝入胞子 suspension tank 中發酵槽則裝入培養基準備好, 在 A 與 B 的地方則裝有暗栓, 經由蒸氣的吹出來進行殺菌全部的連接管線都通入蒸氣加壓進行殺菌約 20 分鐘將暗栓 A 及 B 稍微打開就會吹出蒸氣, 再關閉 A 與 B, 關閉 valve E 與 G, 打開 D F C, 將無菌空氣導入發酵槽, 胞子 suspension tank 與 A B 輕輕 ( 鬆鬆 ) 的接上, 關閉 valve D H I C, 打開 E F G, 經 20 分鐘蒸氣殺菌後將 A 及 B 連緊, 關閉 G 及 E, 打開 valve D 通入空氣, 保持在陽壓下冷卻配管配管冷卻後發酵槽的內壓約降到 0.3 atg 左右, 關閉 valve F, 打開 H I C, 由此將胞子 suspension 壓送到 tank 中關閉 valve D H I C, 使與胞子 suspension tank 分開, 再接上暗栓 A 及 B, 打開 valve E 及 G, 使蒸氣通入配管中 Meyrath 與 Suchanek(1972) 介紹如圖 6.5 所示之嫌氣發酵用的 seed 設備要將 seed 液移到發酵槽時, 需降低發酵槽的內壓, 打開 valve A 但是此種方法在移液時, 需將 tank 壓力降到相當低, 因不使用蒸氣, 故並非很好的方法 173

14 發酵工程的基礎圖 6.5. 嫌氣發酵槽之 seed 的接種法 (Meyrath and Suchanek,1972). 由 tank 到 tank 的 seed 圖 6.6 是 Parker 所報告的 system,2 個 tank 間以易曲管 (flexible pipe) A-B 使連在一起打開 valve G 及 J 使蒸氣吹入發酵槽, 打開 valve D I A B H E, 關閉 C 來進行殺菌 valve H 及 I 則與蒸氣捕捉器 (steam trap) 連在一起, 以此來分離蒸氣排水 (steam drain) 在規定( 設定 ) 的壓力下保持 20 分鐘後, 關閉蒸氣入口之 valve G 及 J, 關閉 trap valve H 及 I 打開 F E D 使連線配管與殺菌培養基相通, 在發酵槽中以通氣攪拌來冷卻培養基, 培養基冷卻到發酵溫度時,seed tank 的內壓最少會上升到 0.7atg, 發酵槽的壓力則會降到 0.1atg 左右打開 valve C, 將 seed 壓送到發酵槽中送完後,flexible pipe 在拆下前要加以殺菌圖 6.6 Tank 到 tank 間的 seed 法 (Parker,1950). 174

15 6 工業生產之 seed 的調製文獻 AL OBAIDI, Z. S. and BERRY, D. R. (1980) camp concentration, morphological differentiation and citric acid production in Aspergillus niger. Biotechnol. Letters, 2(1), AUNSTRUP, K. (1974) Industrial production of proteolytic enzymes. In Industrial Aspects of Biochemistry, Vol. 30, Part 1, pp (Editor Spencer B.). North Holland, Amsterdam. BBEECH, S. C. (1952) Acetone-butanol fermentation of sugars. Ind Eng. Chem. 44, BBORROW, A., JEFERYS, E. C., KESSELL, R. H. J., LLOYD, E. C., LLOYD, P. B. and NIXON, I. S. (1961) Metabolism of Gib-berella fujikuroi in stirred culture. Can. J. Microbiol. 7, BBU LOCK, J. D. (1975) Acetone/butanol, butandiol, and other fermentations. In Large Scale Fermentations for Organic Solvents, Octagon Papers, Vol. 2, pp (Editors Powell, A. T. and Bu Lock, J. D.). Dept of Extra Mural Studies, The University, Manchester. BBURROWS, S. (1970) Bakers yeast. In The Yeasls, Vol. 3, pp (Editors Rose, A. H. and Harrison, J. S.). Academic Press, London. CAMICI, L., SERMONTI, G. and CHAIN, E. B. (1952) Observations on Penicillium chrysogenum in submerged culture. Mycelial growth and autolysis, Bull. World Health Org. 6, CLARK, D. S., ITO, K. and HORITSU, H. (1966) Effect of manganese and other heavy metals on submerged citric acid fermentation of molasses. Biotech. Bioeng. 8, CONNER, H. A. and ALLGEIER, R. J. (1976) Vinegar: its history and development. Adv. Appl. Microbiol. 20, CURTIS, N. S. and CLARK, A. G. (1957) Experiments on growing culture yeast for the brewery. Summary of paper read at European Brewing Conference (Copenhagen 1957). Brewer s Guardian, 86 (7), DI MARCO, A. and PENNELLA, P. (1959) The fermentation of tetracyclines. Prog. Ind. Micro. 1, DION, W. M., CARILLI, A., SERMONTI, G. and CHAIN, E. B. (1954) The effect of mechanical agitation on the morphology of Penicillium chrysogenum Thom. In stirred fermenters. Rend. Inst. Sup. Sanita (Roma), 17, (English edition). FOSTER, J. W. (1949) Chemical Activities of Fungi, p. 62. Academic Press, New York. GILBERT, F. A. (1960) The submerged culture of Morchella. Mycologia, 52, GILLILAND, R. B. (1971) Classification and selection of yeast strains. In Modern Brewing Technology, pp (Editor Findlay, W.P.G.). Macmillan, London. HANSEN, A. M. (1967) Microbial production of pigments and vitamins. In Microbial Technology, pp (Editor Peppler, H. J.). Reinhold, New York. HANSEN, E. C. (1896) Pure culture of systematically selected yeasts in the fermentation industries. In Practical Studies in Fermentation, Chapter 1, pp (translated by A. K. Miller). Spon, London. HOCKENHULL, D. J. (1980) Inoculum development with particular reference to Aspergillus and Penicillium. In Fungal Biotechnology, pp (Editors Smith, J. E., Berry, D. R. and 175

16 發酵工程的基礎 Christiansen, B.). Academic Press, London. HOGGAN, J. (1977) Aspects of fermentation in conical vessels. J. Inst. Brew. 83, INSKEEP, G. C., BENNETT, R. E., DUDLEY, J. F. and SHEPHERD, M. W. (1951) Bactracin, product of biochemical engineering. Ind. Eng. Chem. 43, JACKSON, T. (1958) Development of aerobic fermentation processes: Penicillin, in Biochemical Engineering, pp (Editor Steel, r.). Heywood, London. KEAY, L., MOSELEY, M. H., ANDERSON, R. G., O CONNOR, R. J. and WILDI, B. S. (1972) Production and isolation of microbial proteases. Biotech. Bioeng. Symp. 3, KIKUCHI, M., DOI, M., SUZUKI, M. and NAKAO, Y. (1972) Culture conditions for the production of L-glutamic acid from n-paraffins by glycerol auxotroph GL-21. Agr. Biol. Chem. 36, LAWTON, P., WHITAKER, A., ODELL, D. and STOWELL, J. D. (1984) A study on gross morphology of actinomycetes in shake flasks. Presented at the Society for General Microbiology meeting, Reading University, January LINCOLN, R. E. (1960) Control of stock culture preservation and inoculum build-up in bacterial fermentation. J. Biochem. Microbiol. Tech. Eng. 2, LOCKWOOD, L. B. (1975) Organic acid production. In The Filamentous Fungi, Vol. 1, pp (Editors Smith, J. E. and Berry, D. P.). Arnold, London. LURIE, J. (1975) In Large Scale Fermentations for Organic Solvents. Octagon Papers, Vol. 2, pp (Editors Powell, A. J. and BU LOCK, J. D.). Dept. of Extra Mural Studies, The University, Manchester. MANDL, B., GRUNEWALD, J. and VOERKELIUS, G. A. (1964) The application of time-saving brewing methods. Brauwelt, 104(80), MEYRATH, J. and SUCHANEK, G. (1972) Inoculation techniques-effects due to quality and quantity of inoculum. In Methods in Microbiology, Vol. 7B, pp (Editors Norris, J. R. and Ribbons, D. W.). Academic Press, London. PARKER, A. (1950) Aseptic technique in industrial scale fermentations. In Recent Advances in the Fermentation Industries. Royal Institute of Chemistry, London. PHILLIPS, D. H. (1966) Oxygen transfer in mycelial pellets. Biotech. Bioeng. 8, REED, G. and PEPPLER, H. J. (1973) In Yeast Technology, pp Avi, Westport. RHODES, A., CROSSE, R., FERGUSON, T. P. and FLETCHER, D. L. (1957) Improvements in or relating to the production of the antibiotic griseofulvin. British Patent 784,618. ROESSLER, J. G. (1968) Yeast management in the brewery, Part II. Yeast handling and treatment. Brew. Digest, 43(9), 94, 96, 98, 102, 115. ROSEN, K. (1977) Production of bakers yeast. Process Biochem. 12(3), SANSING, G. A. and CIEGLEM. A. (1973) Mass propagation of conidia from several Aspergillus and Penicillium species. Appl. Microbiol. 26, SINGH, K., SEHGAL, S. N. and VEZINA, C. (1968) Large scale transformation of steroids by fungal spores. Appl. Microbiol. 16, SMITH, G. M. and CALAM, C. T. (1980) Variations in inocula and their influence on the productivity of antibiotic fermentations. Biotechnol. Letters, 2(6),

17 6 工業生產之 seed 的調製 SNELL, R. L. and SCHWEIGER, L. B. (1949) Citric acid by fermentation. U.S. Patent 2,492,667. SOLOMONS, G. L. (1975) Submerged culture production of mycelial biomass. In The Filamentous Fungi, Vol. 1, pp (Editors Smith, J. E. and Berry, D. R.). Arnold, London. STARK, W. M. and SMITH, R. L. (1961) The erythromycin fermentation. Prog. Ind. Micro. 3, STRANDSKOV, F. B. (1964) Yeast handling in a brewery. Amer. Soc. Brewing Chemists Proc., pp Szuecs, j. (1958) Growing mushroom mycelium. U.S. Patent 2,850,841. THORNE, R. S. W. (1970) Pure yeast cultures in brewing. Process Biochem. 5(4), UNDERKOFLER, L. A. (1976) Microbial enzymes. In Industrial Microbiology, pp (Editors Miller, B. M. and Litsky, W.). McGraw-Hill, New York. VEZINA, C., SEHGAL, S. N. and SINGH, K. (1968) Transformation of organic compounds by fungal spores. Adv. Appl. Microbiol. 10, VEZINA, C. and SINGH, K. (1975) Transformation of organic compounds by fungal spores. In The Filamentous Fungi, Vol. 1, pp (Editors Smith, J. E. and Berry, D. R.). Arnold, London. VEZINA, C., SINGH, K. and SEHGAL, S. N. (1965) Sporulation of filamentous fungi in submerged culture. Mycologia, 57, WHITAKER, A. and LONG, P. A. (1973) Fungal pelleting. Process Biochem. 8(11), WILLIAMS, S. T., ENTWISTLE, S. and KURYLWICZ,W. (1974) The morphology of streptomycetes growing in media used for commercial production of antibiotics. Microbios. 11, WORGAN, J. T. (1968) Culture of the higher fungi. Prog. Ind. Micro. 8,

18 發酵工程的基礎 178

92 China Biotechnology Vol. 32 No g 3 00ml 5ml 0. 5mol /L 24 % 24 ph NaOH Ca OH ml h 24h 48h 72h OD

92 China Biotechnology Vol. 32 No g 3 00ml 5ml 0. 5mol /L 24 % 24 ph NaOH Ca OH ml h 24h 48h 72h OD 殏檪檪殏檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪 China Biotechnology 202 32 3 9-99 殏殏 8 Mitchell Bieniek Mitchell Bieniek 2 Garrett Flack 2 * 00086 2 60506 Clostridium acetobutylicum AS. 7 Clostridium acetobutylicum AS. 32