2

Size: px

Start display at page:

Download "2"

与熊
6 years ago
Views:

如在第 1 章的概論, 發酵是以分批法, 連續法, 流加培養法等來進行這些運作方式的選擇, 要看發酵之目的生產物是什麼, 依此來決定的情形較多, 在本章則以分批法連續法流加培養法之速度論為中心加以論述分批培養分批培養法, 其開始培養基之營養條件是被限制之閉鎖系的培養法在分批培養中, 菌之生長則如圖 2.1 所示, 是成一連串之時期 (phase) 的經過圖 2.1 分批培養之菌的生長.

1 如在第 1 章的概論, 發酵是以分批法, 連續法, 流加培養法等來進行這些運作方式的選擇, 要看發酵之目的生產物是什麼, 依此來決定的情形較多, 在本章則以分批法連續法流加培養法之速度論為中心加以論述分批培養分批培養法, 其開始培養基之營養條件是被限制之閉鎖系的培養法在分批培養中, 菌之生長則如圖 2.1 所示, 是成一連串之時期 (phase) 的經過圖 2.1 分批培養之菌的生長. 在添加種菌 (seed) 之後暫時的, 菌是呈不生長的時期, 這個時期稱為誘導期 (lag phase), 是菌在適應新環境的時期, 在實際的發酵工廠中, 則如第 6 章所述, 使用最適的種菌 (seed) 盡量使誘導期縮短在誘導期之後, 接著菌的生長速度則開始慢慢加快, 很快的就可到達最大生長速度而呈一定, 這個時期稱為對數增殖期 (log phase) 對數增殖期之菌的生長則以下式來表示 dx =μx (2.1) dt 13

2 發酵工程的基礎在此,x 為菌體濃度,t 為培養時間 (hr),μ 為比增殖速度 (hr -1 ) 將式 (2.1) 積分則得下式 xt=xo e μt (2.2) 在此,xO 為開始的菌體濃度,xt 為培養 t 時間後之菌體濃度,e 為自然對數的底將上式 (2.2) 變成自然對數時, 則成為下式 lnxt=lnxo +μt (2.3) 以菌濃度之自然對數對培養時間來圖示 (plot) 時可得到其直線關係, 其傾斜 ( 斜線 ) 則表示比增殖速度 μ 在對數增殖期中, 菌一般呈其固有之最大比增殖速度 μmax 在生長各種菌之代表的 μmax 則如表 2.1 所示表 2.1 各種菌之代表的 μmax 微生物 μmax(hr - ) 文獻 Beneckea natriegens 4.24 Eagon(1961) Methylomonas 0.53 Dostalek et al.(1972) methyanolytica Aspergillus nidulans 0.36 Trinci(1969) Penicillium 0.12 Trinci(1969) chrysogenum 依式 (2.2) 時, 菌之生長是呈無限的繼續下去, 實際上隨著菌的生長, 培養基之營養物會被消費, 另外由菌體所排出之物質會蓄積的情形也有由於這些的影響, 在某種時間之後菌的生長速度就會開始減慢, 最後生長就會完全停止此種生長之停止是因培養基之基本營養成分的不足 ( 基質律速的情形 ), 在培養液中由菌本身所排出之有害代謝產物的蓄積 ( 抑制物質律速的情形 ), 或者由其二者之複合作用所造成的圖 2.2 分批培養中初發基質濃度對定常期之菌體濃度的影響. 改變開始的基質濃度, 調查其對菌之生長會造成何種影響的結果則如圖 14

3 2.2 所示從該圖可知, 從圖 A 到 B 的區域 (zone) 是菌在定常期 (stationary phase) 中的菌到達最終濃度, 會隨著開始基質濃度之增加而呈比例的增加此種情形則可由下式表示 X=Y(SR-S) (2.4) 在此,X 為生成的菌體濃度,Y 為菌體收率,SR 為開始之基質濃度,s 為殘存之基質濃度菌之生長在停止之時點的殘存基質濃度, 是從 A 到 B 的區域 (zone) 大多可以當零來看待, 這個區域 (zone) 則用式 (2.4) 來求出給予多少的基質可生成多少的菌體對此, 從 C 到 D 的區域 (zone) 是其生長呈抑制物質律速的情形, 菌體的生成量則不會與開始基質濃度成比例的增加而增加另外, 從 B 到 C 的區域 (zone) 是反應蓄積之抑制物質的濃度對基質消費的影響基質供給不足所引起之菌的生長速度下降或生長停止, 是表示律速生長之基質的殘存濃度 ( 培養液中之濃度 ) 與 μ 之關係此種關係則表示於圖 2.3 及式 (2.5) 中, 這個只會成為 Monod 的式子 (Monod,1942) μ= μ maxs K + (2.5) s s 在此,S 為殘存基質濃度,Ks 為基質利用常數 [ 通常稱為 Michaelis 常數,μ 為表示等於 1/2μmax 之基質濃度, 該值表示其微生物與其基質的親和性 (affinity)] 圖 2.3 假設之微生物的培養液基質濃度與比增值速度. 圖 2.3 之 A 到 B 的區域 (zone) 相當於分批發酵中之對數增殖期, 在此是充分供給基質, 菌的生長是維持在其最大速度 μmax 從 C 到 A 的區域 (zone) 是分批發酵之生長減衰期 (decleration phase), 在此未充分供給基質, 菌的生長是呈基質律速的結果, 無法維持在其最大速度 μmax 當菌對基質的 affinity 非常強,Ks 很小時, 不會影響其生長速度直達培養液中之基質濃度到達很低的情形, 此種發酵之減衰期是呈較短的時間但當菌對基質的 15

4 發酵工程的基礎 affinity 很弱,Ks 很大時, 在培養液中之基質濃度在較高的情形下, 生長速度也會下降, 生長減衰期則呈較長的時間各種微生物對數種基質之 Ks 的代表值則如表 2.2 中所示從表中可知, 一般而言 Ks 的值是非常小表 2.2 各種微生物對各種基質的 Ks 微生物基質 Ks(mg/L) 文獻 Escherichia coli Glucose Shehata and Marr(1971) Saccharomyces cerevisiae Glucose 25.0 Pirt and Kurowski(1970) Pseudomonas sp. Methanol 0.7 Harrison(1973) 分批發酵中的定常期, 菌的生長速度變成零但是,Bull(1974) 認為把這個稱為定常期, 在發酵生理學上是不正確的想法因此, 菌雖可稱為是這個時期, 但持續著活潑的代謝活動, 尤其是在對數增殖期中不製造的二次代謝生產物, 在這個時期則會生成依此來看,Bull 則提議以 maximum population phase 的稱呼來取代定常期 (stationary phase) Borrow 等 (1961) 與 Bu'Lock (1965) 檢討在定常期中的代謝活動, 在微生物生理學上發揮了何種功用 Borrow 等研究 Gibberella fujikuroi 之 gibberellic acid 的生合成, 該微生物之生長可分類成下列的各期 (Ⅰ) 平衡期 (balanced phase): 從對數增殖期之初期到半途 (Ⅱ) 蓄積期 (storage phase): 在對數增殖期的後半, 菌體會蓄積脂質與碳水化合物 (Ⅲ) 維持期 (maintenance phase): 定常期 Gibberellic acid 為二次代謝生產物, 只會在蓄積期之最後到維持期之間才生成 Bu'Lock 等 (1965) 則以新的名稱 trophophase 來代替對數增殖期的名稱, 另外, 對生成二次代謝生產物之定常期則提議改用 idiophase 的新名稱 Idiophase 是表示在對數增殖期之後, 繼續生成二次代謝生產物之時期的字但是, 例如現在雖在對數增殖期, 使用使其生長速度減慢之碳源當基質等, 依培養條件的選擇, 則可以使其生產二次代謝生產物的事已經很清楚, 關於這方面則在第 4 章敘述 Pirt(1975) 敘述生長連接生產物 (growth-linked product) 與生長非連接生產物 (non-growth-linked product)( 另外也稱 growth associated product) 之速度論生長連接生產物是表示在對數增殖期由其增殖中的菌所製造的一次代謝生產物, 另外生長非連接生產物是表示其二次代謝生產物生長連接生產物之生成速度則以下式表示 16

5 dp =q (2.6) dt p x 在此,P 表示生產物的濃度,q p 表示生產物之比生成速度另外, 生產物生成速度與菌體生產之關係則以下式表示 dp =Yp/x (2.7) dx 在此,Y p/x 表示每單位基質消費之生產物收率將式 (2.7) 之兩邊乘以 dx/dt 時就成為 dp dt =Y dx p/x dt 但是, dx dt =μx (2.8) 因此, dp dt =Y p/x μx (2.9) 結局, 由式 (2.6) 與 (2.9) 會變成, q p =Y p/x μ (2.10) 由式 (2.10), 當生產物之生成與菌的生長呈同步 ( 同調 ) 時, 生產物之比生成速度就會與比增殖速度呈比例的應答, 當生產物之生成與菌的生長呈非同步時, 生產物之比生成速度則與菌的生長無關而呈一定, 或者呈現與菌的生長完全不同的舉動分批發酵法是被用於發酵生產菌體一次代謝生產物二次代謝生產物等在菌體生產方面, 是選擇可以獲得最大菌體濃度之培養條件, 在一次代謝生產物之生產時, 是設定在使蓄積生產物之對數增殖期盡量延長的條件另外以生產二次代謝生產物為目的時, 則要縮短對數增殖期延長定常期, 或以人為的改變培養條件來降低在對數增殖期中的生長速度, 使提早轉移到定常期, 以促進二次代謝生產物蓄積的方法連續培養分批培養中的對數增殖期, 在發酵槽中給予添加新的培養基時則可以延長其對數增殖期假如, 培養中沒有抑制物質之律速, 而可以設定培養基中之一種成分, 使成為律速之基質律速的培養條件時, 在對數增殖期應該會使被添加的營養成分繼續使完全消費掉如此的話, 此種培養基之添 17

6 發酵工程的基礎加可以反覆的進行到發酵槽的液體裝滿為止但是, 在添加新培養基之同時, 若能從發酵槽中取出等量的培養液時, 發酵就可以連續的進行假如能把培養基以適當的速度連續的流加 (feed) 到培養系中使形成定常狀態的話, 被取出到外部之菌體量就會與新增殖的菌體量平衡相等的意思流入發酵槽之培養基的流速是以培養液之單位容積來表示的東西, 將其定義為稀釋率 (dilution rate)d 時, 就如下式所示 D= F V (2.11) 在此,F 表示培養基的流速,V 表示培養液量因此 D 是具有 hr -1 之因次 (dimension), 每單位時間之菌濃度的變化量則以下式表示 dx dt = 生長量 - 流出量或為 dx =μx-dx (2.12) dt 在連續培養之定常狀態其菌濃度是不變, 故 dx/dt=0 μx=dx (2.13) 因此, μ=d (2.14) 之關係就會成立即可知連續培養之定常狀態其比增殖速度是由稀釋率來決定把 μ=μ max s/(ks+s) 之關係式代入式 (2.12) 時則成為下式 dx dt =x( μ maxs -D) (2.15) K + s s 另外, 培養液中在律速菌生長的基質變化量則以下式表示 ds dt = 基質流入量 - 基質流出量 - 微生物的消費量或者 ds dt =DS x s R-Ds-μ max ( Y K + s s ) (2.16) 定常狀態時 ds/dt dx/dt 均為零因此由式 (2.15) 與 (2.16) 就可導出下式 x =Y ( S R - ) (2.17) 18

7 s = K D s μ max D (2.18) 在此, x 表示在定常狀態的菌體濃度, s 表示在定常狀態之培養液中的基質濃度從式 (2.18) 由稀釋率 D 就可以瞭解連續發酵之菌的比增殖速度 μ 是如何變化培養液之基質濃度 s, 在當時的 D, 即高於對 μ 所給予 Monod 式之基質濃度時, 培養液之菌濃度會增加而 μ 會下降, 其結果就會使培養液之基質濃度向降低方向之平衡的偏離, 另外, 培養液之基質濃度 s, 在當時的 D, 即低於對 μ 所給予 Monod 式之基質濃度時, 培養液之菌會流出使菌濃度下降, 其結果就會使比增殖速度 μ 變大, 而使基質濃度向增加方向之平衡的移動如此, 連續培養系經由自己制御就可保持平衡使培養基組成之一的營養成分變成對菌的生長有律速的加以制御的連續培養稱為同相 (chemostat), 而另一種之連續培養法同濁相 (turbidostat) 是以制御培養基之流速使培養液的濁度一定, 使培養系的菌體濃度保持一定的培養法 Turbidostat 法是以比濁計經常監控 (monitor) 培養液的濁度, 超過設定之濁度時則加速流加 (feed) 液流量把 D 變大使菌體流出, 濁度在低於設定值時則降低流加 (feed) 液流量把 D 變小使菌體濃度提高來運作培養系之生物量 (biomass) 的測定, 除測定濁度之外也可以測定二氧化碳濃度等, 此種情形反而稱為同生物相 (biostat) 較為正確要維持定常狀態時 chemostat 比 turbidostat 更不需制御那麼多複雜的要因, 故在連續培養法上廣泛被應用但是如第 3 章所述,turbidostat 之優點是在培養初期可一面防止菌的流出, 一面可連續進行菌體的集殖培養要培養之微生物的速度論的特徵, 在 chemostat 中則能以 Y,μmax,Ks 等常數, 以數學的來表示 Y 是決定連續培養之定常狀態中的菌濃度,μmax 是決定理論上之最大稀釋率,Ks 是決定培養液之基質濃度培養液之基質濃度變化的結果會律速培養液之菌濃度, 可能運作之最大稀釋率就能決定圖 2.4 是表示對流入限制基質在理論上具有低 Ks 值之微生物, 在連續培養時其培養的變化隨著稀釋率的增加, 培養液之基質濃度, 在最初只有微量的增加, 隨著 D 之接近 μmax 時就會急速的上昇 ( 增加 ), 然後把表示零的稀釋率 ( 即會發生 wash out) 定義為臨界稀釋率 Dcrit(critical dilution rate), 可以下式表示 μ max S R K S +S R 19

8 發酵工程的基礎 D crit = (2.19) Dcrit 在式中可知, 是由常數 μmax 與變數 SR 所決定的值,SR 若夠大時,Dcrit 就近似 μmax 但是, 實際的 chemostat 培養, 是在進行基質律速的運作, 故無法得到 μmax 定常狀態下之菌體濃度定常狀態下之培養液基質濃度圖 2.4 限制基質對具有低 Ks 之微生物在 chemostat 培養中, 與被設定之稀釋率菌體濃度培養液基質濃度的關係定常狀態下之菌體濃度定常狀態下之培養液基質濃度圖 2.5 限制基質對具有高 Ks 之微生物在 chemostat 培養中, 與被設定之稀釋率菌體濃度培養液基質濃度的關係定常狀態下之菌體濃度定常狀態下之培養液基質濃度圖 2.6 流加 (feed) 液基質濃度對定常狀態下之菌體濃度培養液基質濃度的影響 20

9 圖 2.5 是表示對流入限制基質在理論上具有高 Ks 之微生物, 在連續培養時的培養變化隨著稀釋率的增加為使生長速度增加, 培養液之基質濃度也會漸漸變高即, 此種情形, 隨著之濃度變高而使降低,D 就會接近 Dcrit 圖 2.6 是表示, 流加 (feed) 液中之基質濃度的提高對與的影響效果 SR 增加時也會增加, 培養液之基質濃度則無變化同樣的,SR 雖然增加但 Dcrit 的值則只有微量的增加從實際之 chemostat 培養, 得到數個與理論不同的結果, 其大多在目前所述的地方都可以推論的問題形成這些不同的原因, 有從關於培養裝置上之問題 ( 例如, 未能到達完全混合攪拌, 菌體在發酵槽壁的附著 ) 到發酵生理上的原因 ( 例如, 使用基質來維持代謝, 在高稀釋率下也呈現很強之高濃度基質的抑制 ) 等很多在 chemostat 培養中這些異常之主要原因的解析則請參考 Bull(1974) 之總論圖 2.7 多段式培養法. 多段式培養法多段式培養法則如圖 2.7 所示多段式之 chemostat 培養的優點是在各個培養槽中可設定不同培養條件的地方因此, 此種方法在混合使用數種碳源的情形或以生產二次代謝生產物為目的之情形等會比較方便依 Harte 與 Webb(1967) 說,Klebsiella aerogenes 以 glucose 與 maltose 之混合系來連續培養時, 在第一槽中只有 glucose, 在第二槽中只有 maltose 會被利用假如第二槽之菌的生長速度比第一槽慢的話, 結果使第二槽之培養槽更近似滯留槽的性格, 第二槽中可能會使二次代謝生產物蓄積但是, 多段式連續培養法, 不論是在實驗室或工廠, 被實用化的則很少這是因為 21

10 發酵工程的基礎此種系之構成在實際上是非常複雜的關係被實用化的則有 beer 之連續釀造, 關於這部份則後述 Feedback 式培養法以菌體循環之方式所進行的 feedback 式培養法, 比在 chemostat 中以式 Y(SR-S) 所給予之菌濃度要大的情形來進行菌濃度的濃縮則如下述來進行 (Ⅰ) 某種理由使流出液之菌濃度比培養液要低時, 則要限制從 chemostat 取出之菌量 (Ⅱ) 培養流出液經沉降離心等方法分離菌體, 將其濃厚菌液的一部份加回發酵槽中這些 feedback 式培養法之速度論的敘述, 在 Pirt(1975) 之報告中則有詳述, 將其實際的效果摘錄如下 (Ⅰ) 會增加培養槽的菌濃度 (Ⅱ) 比起普通之單槽式 chemostat, 會降低其菌濃度增加所對等 ( 平衡 ) 分量的培養液基質濃度 (Ⅲ) 會增加菌體及生產物之收量 (Ⅳ) 臨界稀釋率 Dcrit 之值會變大 Feedback 式培養法, 適用於如釀造或廢水處理之類, 在含低濃度基質時使分解更好為目的之處理然而此種方法, 如在處理廢水中含有不同濃度且複數基質的情形, 需使培養系安定化之後才會有效果連續發酵在發酵工業上的實用化雖然比起分批培養會具有更多的優點, 但連續發酵在發酵工業上的實用化至今仍非很積極 Hospodka(1966) 也如此說, 連續發酵比分批法的生產性要高, 在運作操作上要容易標準化, 以及容易自動化等方面較優良, 但較容易受雜菌污染為其缺點 1. 生產性發酵生產性是以發酵單位時間之生物量 (biomass) 的生產量來表示 22

11 即, 分批培養中的發酵生產性則以下式表示 x x R batch = max 0 (2.20) t + t i ii 在此,R batch 是表示單位時間單位液量之菌體生成量,X max 表示到達最大菌濃度 (stationary phase),x 0 表示培養開始時之菌濃度,t i 表示在 μ max 的生長時間,t ii 表示在 t i 以外之培養所需的全時間, 含誘導期生長減衰期殺菌或輸送 broth 所需的時間而連續發酵之生產性則以下式表示 R cont =D X ( 1- T t iii ) (2.21) 在此 R cont 是表示連續發酵之單位時間單位液量的菌體生成量,t iii 表示在到達確立連續發酵之定常狀態所需培養之全時間, 在連續發酵之前建立培養所需之分批培養所要的時間, 以及含培養基設備之殺菌時間,T 是表示連續發酵中之定常狀態的持續時間圖 2.8 連續發酵之稀釋率與菌體生產性 D X 會隨著稀釋率之增加而增加, 到最大值之後雖然增加稀釋率 D, 該值也會急激的降低此種關係則如圖 2.8 所示因此可知連續發酵之菌體的最大生產性, 就要求得使 D X 變成最大之稀釋率式 (2.20) 所給予之分批發酵的生產性是表示發酵全體之平均值, 因菌體之生產量是依賴菌濃度, 依式 (dx/dt)=μx 可知大部份之菌體是在發酵的後半生成因此, 分批發酵之最大生產性, 會在培養之後期得到反之連續發酵, 在發酵之定常狀態中只要維持其最適稀釋率時, 就經常可以達到最大生產性因此, 連續發酵會比分批發酵得到較高的生產性連續發酵是連續運作數週或數個月之長期間, 在 tiii 所示對生產沒有直接貢獻之期間對生產的負 (minus) 效果, 並不會很大但是分批發酵, 是在一定之時間表 (time schedule) 的限制下, 以循環的組合被運作, 要使發酵槽反覆的運作 23

12 發酵工程的基礎時, 對生產無直接貢獻之時間 tii 的負 (minus) 效果則會變得很大如此連續發酵比分批發酵在生產性上較好的理由, 是可以長時間的維持發酵的最適條件, 以及經由長時間的連續運作使對生產無直接貢獻之時間的負 (minus) 效果變成很小等所造成在理論上, 不僅在菌體生產上, 在物質生產之情形也同樣, 連續發酵比分批發酵可以得到更高的生產性, 此乃因分批法其到達生產物生成之最大值的時間只有短暫而已, 連續法其生產物生成之最大速度可以長時間維持的關係如此連續發酵法要得到與分批發酵法同樣的生產性時, 其所需的發酵槽只要很小的就可以, 因此在建設安裝之費用較便宜而且運作經費也較省, 關於此點則在第 12 章詳述 2. 運作操作之標準化與運作之自動化如前所述, 連續發酵是依稀釋率可以自己來決定生長速度, 具有可自行調節的機制即會使形成培養之定常狀態, 是使培養系之菌濃度基質濃度生產物濃度抑制物濃度等全部達到平衡 (balance), 使其平衡 (balance) 在培養中一直繼續下去連續發酵, 一旦只要確立培養的定常狀態時, 要維持管理其發酵的制御 (control) 因子也會成一定值反之分批發酵, 要使其發酵在最適條件下進行之管理因子或條件設定, 會隨著培養經過而時常變化無法一定例如其氧氣需求量在培養初期則非常小, 從培養之中期到後半, 菌體量顯著增加之外, 生產物之影響而使培養液粘度上昇, 使培養系之氧氣需求量變得非常大由於發酵熱而使冷卻負荷的增大, 或隨著代謝生產物之蓄積引起 ph 之變動, 其調節所需之中和劑的量等也是一樣的事連續發酵對這些氧氣需求量冷卻負荷中和劑之量等全部都成一定值即連續發酵其自動制御則非常容易分批發酵, 其準備或附帶的作業比其發酵本身要花更多的勞力例如培養基的調製殺菌混合 broth 輸送或清洗整理等工作則需很多的勞力連續發酵, 其培養基的殺菌是連續的進行,broth 的取出也是連續的進行, 培養的準備或設備之殺菌所需的勞力, 相對的就會比較小, 同時作業的尖峰 (peak) 被分散就可省力化 ( 第 5 章 ) 3. 連續發酵與污染 (contamination) 連續發酵比分批發酵要培養更長的時間, 遭受污染 (contamination) 的危險性則非常的高但是連續發酵是在高度選擇之條件下所形成之定常狀態的培養系, 由外部侵入之雜菌在此種特性之培養系中並非那麼簡單就可 24

13 以生長在 chemostat 中, 除非雜菌的比增殖速度等於連續培養之稀釋率, 或大於其稀釋率時才可看到雜菌的生長即, 雜菌的比增殖速度只要與連續培養之稀釋率相等時, 或要大時, 雜菌就會與發酵菌共存, 雜菌之比增殖速度要比連續培養之稀釋率要大時, 發酵槽之菌就會被雜菌取代要解決 contamination 的問題時, 是與發酵槽為中心之培養裝置的構造設計或運作操作等有直接的連帶關係, 對其重要性的強調則不會有過分的地方另外一項是非由雜菌的污染, 是所用的發酵菌為突變株的時候, 該突變株 ( 本命菌 ) 的世代 (generation) 不一致使變性之菌佔優勢生長的 degeneration 依 Calcott(1981) 的說法, 會有 contamination from inside 的問題但是, 此種問題, 不管如何使用信賴度再高的發酵槽也無法解決的問題連續發酵是需長時間的運作, 比起分批發酵其突變株之回歸突變的可能性當然較大但是, 假如所使用之培養條件真的很適合突變株的話, 該突變株就會凌駕變性的菌, 變性菌的生長就很困難以連續發酵來生產菌體, 培養條件是選擇最適合該菌的條件, 連續發酵就是利用此種特點, 利用突變技術或基因工程經高度育種的菌, 以其來生產物質時, 此種連續發酵之特點, 反而變成非常不利的情形也有工業用微生物是以改造遺傳的方法來使特定的物質大量蓄積而超過該微生物所需的量如此大量製造自己所不需要的東西, 對菌本身而言是一種非常無效率的事情因此如此能大量製造特定物質被改良過的突變株, 與其具有低生產能力性質的親株比較時, 其親株之生物的效率就比較良好, 故在連續發酵中, 此種回歸突變株就是使導進去的基因性質脫落的菌, 其生長就會凌駕生產菌的突變株在連續培養也同樣, 要取得使獲得之遺傳性質能夠安定維持的菌, 其遺傳的育種方法則在第 3 章敘述如到目前所述, 雖然連續發酵比分批發酵具有更多的優點, 在工業上幾乎沒有被實用化的例子, 到底是什麼原因 Pirt(1975) 認為其理由是, 分批法可將其發酵試驗之結果的累積經驗直接應用在工業生產中, 連續法則缺乏此種 scale up 的理論, 有其培養控制的困難但是近年來在分批培養中導入流加培養後, 已知也可以得到連續法的一部份優點關於流加培養技術之詳細情形則在本章後面敘述不論如何, 目前實際在使用連續培養法的則有 25

14 發酵工程的基礎 (Ⅰ) 啤酒釀造 (Ⅱ)SCP (Ⅲ) 菌之分離與鑑定 (Ⅳ) 以改良分批培養或流加培養為目的之培養工程的基礎研究 4. 以連續法之啤酒釀造在英國對啤酒釀造之連續化較關心, 具體上則使用下列的二個方法 (Ⅰ) 階梯狀 (cascade) 法或者多段法 (Ⅱ) 塔式發酵法 Hough(1976) 報告在 London 之 Watneys' Mortlake 釀造所的 Cascade 型連續發酵法據此報告, 該工程是由 3 槽所構成, 第一槽第二槽是用於發酵, 第三槽是用於分離酵母第一槽中之麥汁的比重則從 1040 降到 1019, 第二槽則從 1019 降到 1011 在該期間的滯留時間是 15 小時到 20 小時, 所使用之原料麥汁的比重為 1035 到 1040 左右, 大約可以連續運作三個月但是因此種連續釀造裝置會使酵母的生成量過多之理由, 結果被停止使用然而此種方法在紐西蘭則很成功, 據說廣泛的被使用 (Kirsop,1982), 但其後來在擴建時則回復到分批法 26

15 圖 2.9 啤酒釀造用塔型發酵槽 (Royston,1966). 啤酒釀造用塔型發酵槽之模式 (model) 則如圖 2.9 所示在該發酵所使用的酵母, 其凝集 (flocculation) 性很好, 故要防止酵母流出以免使發酵槽內的酵母濃度降低時, 需將一部份的培養系加以過濾來運作麥汁則從塔的底部導入, 通過酵母之凝塊 (flocs) 間而成層流慢慢上昇, 這個時候就會旺盛的發酵塔之上部其直徑是下部的二倍, 這是要在這個部位使酵母沉降分離, 使麥汁通過酵母之凝塊 (flocs) 間使呈層流的流動, 最初想出此種方法的是 Hough(1976), 另外他還確立了此種塔型發酵槽之運作條件連續法比起分批法, 特別重要的就是無菌性的維持, 在運作之前要把塔內洗淨再經蒸氣殺菌然後先在塔內加入一部份培養基, 再添加在實驗室所純粹培養的種母最初的 9 天內要間歇的添加麥汁, 在不流加 (feed) 培養基的條件下來促進酵母的增殖, 在塔內使酵母充分形成凝塊 (flocs) 從第 9 天到第 12 天時, 慢慢提高麥汁的流加 (feed) 量, 以後的培養大致已達定常狀態在形成定常狀態之後, 麥汁就會被製成啤酒同時大約會與分批法之情形相同速率進行酵母的生產但是在運作開始後約 3 週之間的製品, 通常其品質是無法達到滿足, 需與其他高品質的製品混合 (blended), 因此如考慮其最初的損失 (loss) 時, 至少要進行連續運作三個月才會合算 27

16 發酵工程的基礎啤酒釀造用塔型發酵槽之最大優點是可將在分批法中約需滯留一週的時間縮短成 4~8 小時但是, 圓筒圓底型發酵槽 (cylindro-conical, 此種構想實際上是在 1930 年代被 Nathan 所提出, 為何一直到 1970 年代未被實用化 ) 的引進也使分批法釀造啤酒的發酵時間縮短成約 48 小時當然這個比起塔型連續法要更長的發酵時間但是啤酒釀造, 在其後面的熟成或裝瓶的地方比發酵還需要更長的時間, 考慮製造啤酒之全工程的時間時, 由於圓筒圓底型發酵槽的引進, 使得分批發酵法也可與連續法來競爭塔型發酵槽在運作開始需要較長的時間, 比起分批法之管理, 其工程管理較複雜需要高度的技術, 需要熟練的技術人員另外要進行從一個發酵槽移換到別的發酵槽, 考慮會造成其後面之運作時間表 (schedule) 的延遲, 事實上幾乎是不可能, 因發酵槽 (tank) 之順序運作的彈性 (flexibility) 很少再則塔型連續發酵槽所製造的啤酒, 與傳統之分批發酵法製造的啤酒比較時, 其風味 (flavor) 有若干差異, 如此會有各種的問題, 因此塔型連續發酵槽的實用化就被放棄, 分批式之圓筒圓底型發酵槽則在世界各地被採用 5. 連續發酵與 SCP 微生物之菌體可以直接當作製造人類的糧食用或家畜飼料用的蛋白質, 稱此為 SCP( 微生物蛋白質 ) 以前第一次世界大戰時德國曾經試過大量培養酵母來生產糧食 (Laskin,1977) 真正考慮檢討以微生物直接當作糧食資源來利用是從 1960 年代才開始以後就有很多的化學工業公司, 開始檢討以各種碳源來製造 SCP 的方法, 這些研究幾乎沒有例外對微生物的生長培養都採用連續培養法為前提以製造菌體為目的時, 連續發酵法是理想的方法比起分批培養法其生產性絕對比較高, 與以代謝生產物為目的的情形不同, 變性後之菌的增殖, 即造成 degeneration 之問題的可能性很低以 chemostat 法進行篩選 (screening) 時, 使用適當的選擇壓 ( 有條件的使目的菌生長 ) 時, 就可以分離出適於 SCP 之工業生產的優良菌因此在 SCP 工程之開發, 是在大容量 chemostat 的設計開發, 以及對此種大型培養槽中之微生物的變動有關之研究則下了很大的功夫很多新型發酵槽是為了生產 SCP 所設計製作, 這些的詳細情形則在第 7 章敘述很多的碳源用於生產 SCP 都被檢討過把乳清 (whey) 當做生產生物量 (biomass) 之原料是在 1940 年代以後 (Meyrath and Bayer,1979), 近代對乳清 (whey) 利用的工程則用 air lift 型發酵槽 ( 第 7 章 ) 以連續培養法, 28

17 把 cheese 產業上麻煩的廢棄物轉變成能滿足經濟性之高純度的飼料用蛋白質 (Meyrath and Bayer,1979) 以 cellulose 當 SCP 的原料也曾經被研究很多, 關於這些則有 Clayton 等 (1979) 之總論但是 cellulose 是非常難分解性的物質, 使其成為發酵原料之困難的問題很多另外檢討其他各種碳源來生產生物量 (biomass), 例如 Rank Hovis MacDougall 公司則以小麥玉米馬鈴薯等當原料培養絲狀菌來生產食用蛋白質生產微生物蛋白質若使用絲狀菌時, 就可得到組織蛋白質, 就很容易可以製成齒感舌感良好的製品 (Forage and Righelato,1979) 但是, 被研究得最多的是以 methane methanol normal paraffin 等碳化氫之 SCP 生產很多的化學企業進行研究開發加入以碳化氫來生產 SCP 的工程, 由於不合算的經濟理由, 故實際企業化的只有數家而已原因是, 開始此種研究之當時, 碳化氫確實是便宜的資源, 但在 1973 年中東戰爭以後油價急速上升, 因此以碳化氫生產 SCP 之經濟上的優勢就緩和下來雖然如此,ICI 公司仍然以 methanol 為原料來生產 SCP, 每年生產 54,000 噸到 70,000 噸之工廠仍然在進行該工廠是世界上以 methanol 生產 SCP 使商業生產的第一個工廠, 在此則使用 air lift 型之 3,000m 3 的發酵槽 (king,1982) 6. 菌之分離或育種的連續發酵對 chemostat 培養中生長菌之特異的選擇性, 是最適於當分離特定微生物或育種有用微生物的手段, 例如分離能蓄積多量酵素之微生物等時, 一般使用連續發酵來集殖培養, 比通常的集殖培養法可以得到更好結果的情形較多, 其詳細的情形則在第 3 章敘述 7. 連續發酵在工業生產上所需之基本資料的取得 chemostat 培養是很適於調查微生物之生理生化學性質的良好工具即與分批培養比較時, 連續培養則具有下列的優點 (1) 可以做成培養的定常狀態 (2) 菌的增殖速度可以稀釋率來制御 (3) 菌的增殖速度會被培養液中之限制基質濃度所律速, 可以此來調查各種限制基質對微生物的影響如此,chemostat 培養比分批法要在更嚴格之限制培養條件下培養, 故需明確得到該資料之有意差異或實驗事實的解析, 可得到對生產現場之分批培養或流加培養有益的支持 (back up) 資料 29

18 發酵工程的基礎流加培養法在分批培養中, 不把培養液取出而連續或間歇的流加 (feed) 培養基的培養法,Yosida 等 (1973) 將其定義為流加法 (fed-batch culture) 當然培養液量會隨著培養時間的增加而增加 Pirt(1975) 則討論流加培養法之速度論考慮以一種基質來限制菌生長之分批培養時, 在任意的培養時間中之菌濃度則以下式表示 x t =x 0 + Y(S R -s) (2.22) 在此,x t 表示培養 t 時間後之菌體濃度,x 0 是表示開始的菌體濃度 x max 可在 s 0 時來取得, 假如,x 0 與到達最終濃度 x max 比較時, 要是非常小時, x max YS R (2.23) 之關係就會成立另外, 在 x=xmax 之培養時間內, 就開始添加培養基時, 其稀釋率則比 μmax 要小, 故被添加下去的基質立刻就會被消費, FS R μ X Y (2.24) 在此,F 表示添加培養基之流速,X 表示培養液中之菌的總量, 把培養時間 t 之培養液量當 V 時, 就會有 X=xV 之關係之關係就會成立上式 (2.24) 是表示基質添加量與基質消費量大約相等即 (ds/dt) 0 培養液中之總菌量 X 則會隨著時間的增加而增加, 菌濃度 x 呈一定不變,(dx/dt) 0 之關係就會成立即表面上 μ=d 之關係就會成立把此種狀態定義為準 ( 類似 ) 定常狀態 (quasi-steady state) 流加培養會隨著時間的增加而增加培養液量, 稀釋率則會隨著時間的增加而變小此種關係則以下式表示 D = F V + 0 F t (2.25) 在此,V 0 表示流加 (feed) 開始直前的培養液量依表示 Monod 之式子的地方, 降低 D 使菌濃度增加時培養液中之基質濃度就會降低但是在流加培養法之大部份所有 μ 之範圍內, 其流加 (feed) 液之基質濃度 SR 是比 Ks 要大,μ 則比較小, 故培養液中殘存之基質濃度的變動則變小, 事實上可把此當零看待即 D 比 μmax 要小,Ks 比 SR 小得很多之條件下形成準定常狀態將此表示於圖 2.10 中 Chemostat 中的定常狀態與流加培養液中的定常狀態之不同, 是在 chemostat 之 μ 經常保持一定, 而流加培養之 μ 則會一直減少的地方 30

19 圖 2.10 在流加培養之準定常狀態下之稀釋率限制基質濃度及菌體濃度 (Bazin, 1981) 流加培養法之實用化在發酵工業上有關流加培養法之實用化則有 Whitaker(1980) 之總論產業上認為流加培養法有利的地方是, 其培養液中之基質濃度可以保持在非常低的地方即由於這樣, (1) 可以防止因 repression 造成基質消費速度之延遲, 另外可以防止培養系造成氧氣不足的狀態 (2) 可以減少培養基成分在高濃度時的抑制效果 1. 以流加培養避開 repression 與好氣狀態之維持已經在 1915 年以前, 在麵包酵母的生產上, 培養基之麥汁濃度很高時酵母之生長速度太快而造成培養系對氧氣的需求量過大, 發酵槽則無法相對的供給所要求之氧氣量, 培養系就成嫌氣環境而使菌體生產減少, 就會生成 alcohol(reed Peppler,1973) 在此則開發出, 在培養初期以低濃度培養基培養, 隨後則以比菌之利用速度更慢的速度來追加添加培養基的培養法此種方法, 在基質限制培養基中基質的流加 (feed) 速度, 即在稀釋率比 μmax 要小的條件下使形成準定常狀態, 由 Pirt(1975) 對其速度論詳加討論麵包酵母對游離 glucose 的感受性非常高, 已知約在 5μg/ l 就會抑制其 31

20 發酵工程的基礎呼吸活性 (Crabetee,1929) 即高 glucose 濃度, 不但使培養系形成無法相對的供給所要求之氧氣量很高的菌密度, 而且 glucose 也會造成抑制其呼吸活性以最新型之流加培養法由廢糖蜜 (molasses) 製造麵包酵母的發酵, 則採用一面以監測器 (monitor) 測定排氣中所含之微量的 ethanol, 並嚴密制御 molasses feed 的方法此種培養法, 菌的生長速度受到限制, 使菌體收率大約與理論值相近 (Fiechter,1982) 二次代謝生產物之 penicillin 的發酵, 則使用流加培養法該發酵有二個主要的時期, 即分成菌在 μmax 生長的菌體生成期 (rapid-growth phase), 與幾乎看不見菌生長之二次代謝生產物 penicillin 生產之 penicillin 生成期 ( 稱為 slow-growth phase 或 production phase) Glucose 之流加 (feed) 是在進行調節兩個時期之菌的代謝在菌體生成期,glucose 要過量時就會生成酸, 培養系之氧氣要求量就會超過設備所能供給之氧氣量, 另外, 要是 glucose 不足時, 培養基中的氮化合物就會被當碳源使用, ph 就會上昇, 就不能充分的生成菌體 (Queener and Swartz,1979) 在分批培養中,hexose 之蓄積問題則可使用如 lactose 分解很慢的碳源來防止 (Matelova,1976) 但是依 Queener 與 Swartz 說,penicillin 之高生產性, 則以 glucose 當碳源, 在菌體生成期以 computer 來控制 (control)glucose 之流加而使溶氧或 ph 維持一定值監控 (monitor) 氧氣消費之溶氧水準 (level) 或 ph 是要制御發酵所需的因子,glucose 要過剩時, 呼吸速度就會增大而降低溶氧水準 (level), 設備之氧氣供給能力就追不上呼吸速度而生成有機酸使 ph 下降因此, 假如在菌體生成期對 glucose 流加 (feed) 制御得很好時, 就會使發酵順利的進行在 penicillin 生成期, 要限制 glucose 的流加來制御菌的生長速度與氧氣要求量, 使培養系經常保持在充分的好氣環境來使 penicillin 達到高生產該時期, 其制御因子完全是在溶氧水準 (level),ph 對 penicillin 生成則不會有如在菌體生成期所見到之良好的回應 (response) 隨著培養時間的增加菌濃度就會增加, 培養液之粘度就會提高, 氧氣要求量就會增加即, 培養會受到氧氣供給能力很大的影響但是這個以 computer 來控制 (control) 限制基質供給速度則可以得到相當克服 ( 改善 ) 在流加培養中, 發酵槽裝滿後則取出一部份培養液, 再流加 (feed) 新的培養基的話, 也可以繼續維持 penicillin 之高生產性 Queener 與 Swartz 說, 在此種情形則對下列的項目需加以檢討 (1) 會把未被利用之基質與降低活性之菌體取出培養系外 32

21 (2) 以一面流加 (feed) 一面取出時, 培養液會被稀釋, 會使抽出工程的負擔增加 (3) 雖然進行稀釋與取出, 抑制物之生產速度很快, 發酵仍會遭受抑制物限制 (4) 生產能很低的菌 ( 回歸突變株等 ) 會優勢的生長取出培養液再流加 (feed) 的培養法, 前述的那一種會成為律速因子的問題需加以考慮培養法之黏度的控制 (control) 法則在第 9 章敘述很多的酵素系, 已知消費速度很快之碳源會抑制其酵素的生合成, 會接受其 catabolite repression(aunstrup 等,1979) 在以生產酵素為目的之發酵中, 則需避開 catabolite repression, 流加培養法則適用於此種目的以少量的流加 (feed) 濃厚的培養基, 使 catabolite repression 之原因代謝產物不會過剩生成的來調節其碳源濃度例如 Waki 等 (1982) 在 Trichoderma reese 之 cellulase 的生產中, 成功的以制御二氧化碳發生量為指標之流加培養法來提高 cellulase 的生產 2. 以流加培養法來解除高濃度抑制效果流加培養法, 用於培養基成分中對菌有毒性之化合物時則很好此種情形也一樣, 在 penicillin 發酵中可以找到很好的例子即, 在 penicillin 發酵上, 使用對 Penicillium chrysogenum 有毒之 sodium phenyl acetate 來當 penicillin 的 precursor 此種情形, 少量的添加 sodium phenyl acetate, 或連續的流加 (feed) 都需限制在對菌之抑制濃度以下 (Queener and Swartz,1979) 因此流加培養法可以使 precursor 之水解限制到很低, 使 precursor 之 penicillin 的轉換率變大在 glutamic acid 發酵上, 以流加培養法使分批法中在高濃度培養時會有抑制菌生長以及 glutamic acid 生成之舉動的基質也可以善加利用文獻 AUNSTRUP, K., ANDRESEN, O., FALCH, E. A. and NIELSEN, T. K. (1979) Production of microbial enzymes. In Microbial Technology, vol. 1 (2nd edition), pp (Editors Peppler, H. J. and Perlman, D.). Academic Press, New York. BBAZIN, M. J. (1981) Theory of continuous culture. In Continuous Culture of Cells, vol. 1, pp (Editor Calcott, P.H.). CRC Press, Boca Raton. BBORROW, A., JEFFERYS, E. G., KESSEL, R. H. J., LLOYD, E. C., LLOYD, P. B. and NIXON, I. S. (1961) Metabolism of Gibberella fujikuroi in stirred culture. Can. J. Micro. 7, BBULL, A. T. (1974) Microbial growth. In Companion to Biochemistry, Selected Topics for Further Study, pp (Editors Bull, A. T., Lagnado, J. R., Thomas, J. O. and TIPTON, 33

22 發酵工程的基礎 K. F.). Longman, London. BBU LOCK, J. D., HAMILTON, D., HULME, M. A., POWELL, A. J., SHEPHERD, D., SMALLEY, H. M. and SMITH, G. X. (1965)Metabolic development and secondary biosynthesis in Penicillium urticae. Can. J. Micro. 11, CALCOTT, P. H. (1981) The construction and operation of continuous cultures. In Continuous Culture of Cells. Vol. 1, pp (Editor Calcott, P. H.). CRC Press, Boca Raton. CLAYTON, D., CALLIHMN, L. D. and CLEMMER, J. E. (1979) Biomass from cellulosic materials. In Economic Microbiology, 4. Microbial Biomass, pp (Editor Rose, A. H.). Academic Press, London. CRABTREE, H. G. (1929) Observations on the carbohydrate metabolism of tumours. Biochem. J. 23, DOSTALEK, M., HAGGSTROM, C. and MOLIN, N. (1972) Optimisation of biomass production from methanol. Fermentation Technology Today, Proc. IV Int. Fermentation Symp., pp (Editor, Terui, G.). EAGON, R. G. (1961) Pseudomonas natriegens, a marine bacterium with a generation time of less than ten minutes. J. Bact. 83, FIECHTER, A. (1982) Regulatory aspects in yeast metabolism. In Advances in Biotechnology, I. Scientific and Engineering Principles. pp (Editors Moo-Young, M., Robinson, C., W. and Vezina. C.). Pergamon Press, Toronto. FORAGE, A. J. and RIGHELATO, R. C. (1979) Biomass from carbohydrates. In Economic Microbiology, 4. Microbial Biomass, pp (Editor Rose, A. H.). Academic Press. London. HARRISON, D. E. F. (1973) Studies on the affinity of methanol and methane utilizing bacteria for their carbon substrates. J. Appl. Bact. 36, HARTE, M. J. and WEBB, F. C. (1967) Utilisation of mixed sugars in continuous fermentations. Biotech. Bioeng. 9, HOSPODKA, J. (1966) Industrial applications of continuous fermentation. In Theoretical and Methodological Basis of Continuous Culture of Microorganisms, pp (Editors Malek, I. and Fencl, Z.) Academic Press, New York. HOUGH, J. S., KEEVII., C. W., MARIC, V., PHILLISKIRK, G. and YOUNG, T. W. (1976) Continuous culture in brewing. In Continuous Culture. 6, Applications and New Fields, pp (Editors Dean, A. C. R., Ellwood, D. C., Evans, C.G.T. and Melling, J.). Ellis Horwood. Chichester. KIRSOP, B. H. (1982) Developments in beer fermentation. Topics in Enzyme and Fermentation Biotechnology, (Editor Wiseman, A.). Ellis Horwood, Chichester. KING, P. P. (1982) Biotechnology: an industrial view. J. Chem. Tech. Biotechnol. 32, 2-8. LASKIN, A. I. (1977) Single cell protein. Ann. Reports on Fermentation Processes, 1, (Editor Perlman, D.). Academic Press, New York. MATELOVA, V. (1976) Utilization of carbon sources during penicillin biosynthesis. Folia Microbiologica, 21, MEYRATH, J. and BAYER, K. (1979) Biomass from whey. In Economic Microbiology, 4. Microbial Biomass, pp (Editor Rose, A. H.). Academic Press. New York. MONOD, J. (1942) Reserches sur les Croissances des Cultures Bacteriennes, 2nd edition. Hermann and Cie, Paris. PIRT, S. J. (1975) Principles of Microbe and Cell Cultivation. Blackwell, Oxford. 34

23 PIRT, S. J. and KUROWSKI, W. M. (1970) An extension of the theory of the chemostat with feedback of organisms. Its experimental realisation with a yeast culture. J. Gen. Micro. 63, QUEENER, S. and SWARTZ, R. (1979) Penicillins: Biosynthetic and semisynthetic. In Economic Microbiology, 3. Secondary Products of Metabolism, pp (Editor Rose, A. H.). Academic Press, London. REED, G. and PEPPLER, H. J. (1973) Yeast Technology, pp Avi, Westport. ROYSTON, M. G. (1966) Tower fermentation of beer. Process Biochem. 1(4), SHEHATA, T. E. and NARR, A. G. (1971) J. Bact. 107, TRINCI, A. P. J. (1969) A kinetic study of growth of Aspergillus nidulans and other fungi. J. Gen. Micro. 57, WAKI, T., LUGA, K, and ICHIKAWA, K. (1982) Production of cellulase in fed-batch culture. In Advances in Biotechnology, 1. Scientific and Engineering Principles, pp (Editors Moo-Young, M., Robinson, C. W. and Vezina, C.). Pergamon Press, Toronto. WHITAKER, A. (1980) Fed-batch culture. Proc. Biochem. 15(4), YOSHIDA, F., YAMANE, T. and NAKAMOTO, K. (1973) Fed-batch hydrocarbon fermentations with colloidal emulsion feed. Biotech. Bioeng. 15,

X 傳統育種技術分子育種技術基因改良育種

X 傳統育種技術分子育種技術基因改良育種 06 2015 7 511 72 92? 2010? X 傳統育種技術 1960 1980 30 60 20 分子育種技術 5 10 3 5 基因改良育種 2015 7 511 07 改良後的基因及其生產的蛋白質都需經過嚴格的動物及田間生物安全試驗才會上市, 程序就跟新藥一樣 20 基改產品禁得起考驗 12 2013 1.75 50 1 5 1996 80 2013 156 35 21 6 90 08