工業生產之培養基

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1 前言要確保發酵工程中之最適培養基, 則需對各種培養條件加以詳細的檢討, 但也有只考慮培養基之基本共通條件者 所有微生物都需要有水份 當能源之碳源 氮源 礦物質 維他命等 好氣性菌還需要氧氣 小型之發酵規模, 可用一般之試藥來配製培養基, 大型的時候, 培養基之配製則不是那麼簡單 工業生產用培養基則需使用便宜的東西, 必須考慮下列的條件 1. 使單位重量之消費基質, 得到最高的生產物, 最大的菌體收率 2. 使菌體生產, 生產物之濃度達最大 3. 使生產物之生成速度達最大 4. 使副產物之產生達最小 5. 所用之原料要便宜, 品質均勻, 整年均可取得之原料 6. 使通氣攪拌 抽出 精製 廢棄物處理等之問題降到最小 故由上述觀點來看時, 工業生產培養基, 碳源則用 cane molasses beet molasses 穀物 澱粉 glucose sucrose lactose 等 氮源則用 ammonia 鹽 尿素 硝酸鹽 CSL(corn steep liquor) 大豆碎片 (flake)( 或大豆水解物 ) 屠宰場廢棄物( 血液等 ) 發酵廢棄物( 菌體或濃縮之發酵廢液等 ) 等 另一種的選擇標準是菌增殖用的種菌培養基或胞子形成培養基之組成, 此種問題則在第 6 章敘述 培養基組成與使用之發酵槽形狀也有關係, 例如 ICI 公司所開發之 SCP 生產培養基是使用 methanol 及 ammonia(maclennan Gow and Stringer, 1973) 若使用別型發酵槽時, 可能就要改用別種組成之培養基 Rhodes(1955) 為了要確保 griseofulvin 生產之最適氮源濃度, 因此要變更發酵槽之設計, 這個問題在第 7 章敘述 考慮由實驗室規模到 pilot plant, 再 scale up 到生產規模之設備的問題 實驗室用之培養基, 例如因其氧氣移動能力很低的問題, 在工業上則無法使用 高黏度的培養基則需很大的攪拌動力 (Aiba, Humphrey and Millis, 1973) 培養基不僅影響生長或物質生產, 對 ph 變化 發泡 氧化還原電位 微生物之形態等也有影響 有時也有添加 precursor 或 inhibitor 之情形 107

2 代表的培養基 表 4.1 是表示數種典型的深部培養用培養基, 但在此表中的培養基只是個例子而已, 並非絕對可應用於實際生產上 表 4.1 發酵生產培養基之例子 Itaconic acid 發酵 (Nubel and Ratajak,1962) Gibberellic acid(calam and Nixon,1960) Cane molasses( 糖濃度 ) 150g/L 無水 glucose 20g/L ZnSO4 1.0g/L MgSO4 1g/L MgSO4 7H2O 3.0g/L NH4NO3 1g/L CuSO4 5H2O 0.01g/L KH2PO4 5g/L FeSO4 7H2O 0.01g/L MnSO4 4H2O 0.01g/L ZnSO4 7H2O 0.01g/L CuSO4 5H2O 0.01g/L CSL( 固形物 ) 7.5g/L Amylase(Underkofler,1966) Glutamic acid(gore,reisman and Gardner,1968) 大豆 flake 1.85% Dextrose 270g/L Yeast extract 1.50% NH4H2PO4 2g/L Distillers dried solubles 0.76% (NH4)2HPO4 2g/L NZ-amine(casein 水解物 ) 0.65% K2SO4 2g/L Lactose 4.75% MgSO4 7H2O 0.5g/L MgSO4 7H2O 0.04% MNSO4 H2O 0.04g/L 消泡劑 (Hodag KG-1) 0.05% FeSO4 7H2O 0.02g/L Polyglycol g/L Biotin 12μg/L Penicillin 11μg/L Riboflavin(Harned,1969) Penicillin(Perlman,1970) 大豆油 20mL/L Glucose 或 molasses( 連續 feed 用 ) 10%( 對全量 ) Glycerol 20mL/L CSL 4~ 5 %( 對全量 ) 工業用 glucose 20g/L Phenyl acetate( 連續 feed 用 ) 0.5~ 0.8%( 對全量 ) CSL 12mL/L Lard( 或植物油 )( 連續添加之消泡劑 ) 0.5%( 對全量 ) Casein 12g/L ph 中和 ( ) 用酸或鹼 KH2PO4 1g/L 註 : 有關之設定則參考本文. 培養基組成實驗室中的基礎實驗,pilot plant 之檢討, 通過生產運作之整個過程, 所用之培養基的檢討是發酵研究之全部的工作 培養基之成分必須含有製造菌體或代謝生產物所需之要素, 同時要能供給生合成或維持生命力所需的能源 這是最先需考慮給予生長與生產生產物所需之化學量論 (stoichiometry) 的問題 即 109

3 發酵工程的基礎 碳源及能源 + 氮源 + 其他的必要因素 菌體 + 生產物 +CO2+H2O+ 熱此式需以定量的來表示, 依此式是可以使培養原料的浪費在最少的情形下生產生產物來檢討其培養基組成 即計算出生產所需菌體量之最低營養量 現在如要生產一定量的某種生產物所需的菌體量, 若知道的話, 就可以求出要生產一定收率之生產物所需的基質量, 這就是要生產生產物所需之培養基組成, 並非生產菌體之培養基組成, 但是培養基之所有成分要詳細求出, 事實上是不可能 若知道菌體中之 C H O N S P Mg 及 K 之含量時, 就可求出必需元素之 balance, 要求出使用菌的這些資料, 實際上也是很麻煩, 利用表 4.2 之數值導入最初設定之培養基中的 N S P Mg 及 K 之 balance, 以此決定的資料當指標即可, 其他的 Fe Zn Cu Mn Co Mo B 等微量元素也需要 依 Cooney(1981) 所做細菌菌體與培養基所含之這些元素含量的比較, 其中的幾種元素, 如 P 或 K 等一般都添加過量,Zn 或 Cu 則不足, 很多的培養基為加強其緩衝能, 故有提高 P 之濃度的情形, 這些是在設定培養基時必需考慮之重點 表 4.2 細菌 酵母 絲狀菌之元素組成 ( 乾燥菌體中之 %) 元素細菌酵母絲狀菌 (Luria,1960; (Aiba et al.,1973; (Lilly,1965; Herbert,1976; Herbert,1976) Aiba et al.,1973) Aiba et al.,1973) C H 7 7 N P S K Na Ca Mg Cl Fe 微生物中有些無法合成胺基酸或維他命, 核酸等特定營養素者, 若確實知道某些微生物的這些生長因子 (growth factor) 時, 則需添加這些純粹的物質或含有這些營養素 ( 或 precursor) 的物質 碳源是生合成的材料, 同時也用於生產能量, 在好氣條件下, 碳的需要量則依下述定義的菌體收率 (Y) 求出 110

4 如表 4.3 之例子, 例如從 glucose 所來的 Y 為 0.5 之細菌收率時, 表示 1g 的 glucose 可生成 0.5 之菌體, 假如要生產 30g/L 之菌體時, 在培養基中則需要 30/0.5=60g/L 之 glucose, 因此這時大約可推定需要 N 6.0g/L P 1.0g/L S 0.3g/L K 1.0g/L 及 Mg 0.1g/L 表 4.3 由各種碳源所求得之菌體收率 (Abbott and Clamen,1973) 碳源收率係數 Methane 0.62 n-alkane 1.03 Methanol 0.40 Ethanol 0.68 Acetic acid 0.34 Malic acid 0.36 Glucose(molasses) 0.51 在發酵工程中要生產代謝生產物時, 必需供給最適碳源, 碳源之轉換率, 其理論值與實際發酵所得到之收率, 在理論上是可以做比較分析, 但實際上對代謝系的了解有限, 因此想求出能供實用之資料是非常困難 Cooney(1979) 由實際發酵測定之化學量論來設定生合成途徑, 以此來求出 material balance 與 energy balance, 再由此求出 penicillin G 發酵之理論收率 Penicillin G 發酵之全體的化學量論則如下列所示 a2 C6H12O6 + b2 NH3 +c2o2 +d2 H2SO4 +e2 PAA n2 PenG +p2 CO2 +q2 H2O 在此 a2 b2 c2 d2 e2 n2 p2 及 q2 為係數,PAA 為 phenylacetate 上式的解為 10/6C6H12O6 + 2NH3 +1/2O2 +H2SO4 +C8H8O2 C16H18O4N2S + 2CO2 +9H2O 此例是 1 g glucose 可得到 1.1g penicillin G, 由分批式培養之單純模式的發酵試驗結果是全部糖的 28% 用於生產菌體,61% 用於維持代謝,11% 用於生產 penicillin 在流加培養時,26% 用於生產菌體,70% 用於維持代謝, 只有 4% 用於生產 penicillin 因此, 此種情形之 penicillin 的最大生產量, 每 g glucose 只能生產 0.053g, 此種理論值比實測值要高出好幾倍 另一個重要的營養素就是由通氣所提供的氧氣, 關於這個問題在第 9 章會詳述 培養基組成也會影響培養時之氧氣需求量, 例如以還原水準很高 ( 分子內含氧量較少 ) 的碳源來發酵時則需要較多的氧氣, 這個問題在第 9 章敘述 111

5 發酵工程的基礎 水水是所有發酵中重要的要素, 同時還具有各種的補助功能, 因此需要確保安定之水質的水, 而且要有大量供應的水源, 要考慮水的問題則有其 ph 鹽類以及排水等的混入的問題, 尤其是對醪化 ( 醪化即澱粉或甘藷等加水蒸煮, 再加入酵素或酸使水解等工程稱醪化 ) 工程的影響最大, 其理由是從過去的釀造工廠之建立有場所的限定, 例如啤酒等製品之品質因產地的不同會有差異就可知, 含高濃度 CaSO4 之硬水適於製造 bitter( 苦味啤酒, English Burton) 或 pilsener( 黃色啤酒 ) 之類的 larger( 釀造後經儲藏熟成之啤酒 ) 啤酒, 含高濃度碳酸之水則適於釀造如 stout( 上面發酵之黑啤酒, 英國 ) 之類的濃啤酒 目前的水經離子交換法等處理後, 添加食鹽或調整 ph 等加以改變成適於釀造不同啤酒之水質, 不像以前對地區的依賴性很大, 現在已無此種情形, 關於這方面的問題請參閱 Hough Briggs 與 Stevens(1971) 之成書 SCP 之大型連續發酵, 普通所用的水都會循環再使用, 在添加水 (feed water) 中添加補充一部份的營養成分, 再加以循環 (recycle) 使用 (Topiwara and Khosrovi,1978;Hamer,1979;Levi Shennan and Ebbon,1979) 能源 (energy source) 生長所需的能量是從氧化培養基成分或從光得來, 大部份的工業微生物都屬化學有機營養生物 (chemoorganotroph), 都以碳水化物 脂質 蛋白質等有機物當能源, 一部份的微生物則以 methane 或 methanol 當碳源, 也有同時可當能源者 (Kosaric and Zajic,1974) 碳源廣泛被使用之碳源在發酵工程上所用之碳源, 一般是用碳水化物 被用得最多的碳水化物是玉米澱粉, 也利用馬鈴薯或木薯 玉米及其他穀物, 有直接利用或切割成玉米碎片 (maize chip) 再使用者 澱粉經稀酸或酵素水解, 調製成糖漿 (syrup,sirup) 狀或固形狀之各種型式的 glucose, 酸分解時會產生造成工程不安定化的有害副產物 大麥一部份經發芽, 再經加熱處理, 則可得到所謂麥芽 (malt) 的糖與澱粉之混合物 ( 表 4.4), 大家都知道, 麥芽是製造啤酒之主原料,malt extract 也是由發芽的大麥所製造的 112

6 表 4.4 麥芽 (malt) 之碳水化物組成 ( 表示總量中之乾物 %)(Harris,1962) 澱粉 蔗糖 3-5 還原糖 3-4 其他的糖 2 Hemicellulose 6-8 Cellulose 5 蔗糖是來自甘蔗或甜菜, 當發酵原料者, 一般都使用在製造砂糖工廠中, 取走砂糖結晶後之母液, 其純度非常低之 cane molasses 或 beet molasses( 表 4.5) 表 4.5.Beet molasses,cane molasses 之分析值 ( 表示重量 / 容量 %)(Rhodes and Fletcher,1966) Beet molasses Cane molasses 蔗糖 Raffinose 轉化糖 剩餘的為非糖成分 乳糖或粗乳糖 ( 乳清粉末,whey) 在後面連續流加法的地方敘述, 現在幾乎沒有使用 但是乳清 (whey) 仍然當做生產菌體之基質在應用 (Meyrath and Bayer,1979) 橄欖油 玉米油 棉子油 亞麻仁油 大豆油等植物油, 有下面二種理由可說明其含有碳源, 第一, 主要含有 oleic acid linoleic acid linolenic acid 等高純度的碳水化物 ; 第二, 如後面所詳述的, 因其具有降低表面張力的作用, 而具有消泡劑的機能 CSL(corn steep liquor; 表 4.6) 是抽出玉米澱粉時之副產物, 基本上是當氮源使用, 含有乳酸 少量的還原糖 以及各種的多醣類, 使用如大豆 flake 之植物起源的氮源者, 都會含有碳水化物 藥劑培養基 (Pharma media) 中, 非主成分的東西中也含有大量的碳水化物 生產疫苗 (vaccine) 之培養基所用的小牛血清 albumin beef meat NZ-case 等蛋白質也當碳源使用 (Van Hemert, 1979) 從碳的含有率來看, 每個碳的單價較高的 alcohol 有機酸 烷屬烴(alkane) 等碳化合物, 最近也漸受重視 這些化 113

7 發酵工程的基礎 合物均可取得高純度的東西, 在發酵後之抽出分離工程比較簡單為其優點 Methane methanol n-alkane 等是生產菌體之原料 (Hamer,1979; Levi 等,1979) ICI 公司以 methanol 培養 Methylophilus methylotrophus 來生產 SCP 以 n-alkane 當有機酸 胺基酸 vitamin 或其補欠分子 (prosthetic group, 複合蛋白之非蛋白部分 ), 碳水化物 核酸 抗生物質 酵素 蛋白質等之發酵原料 (Fukui and Tanaka,1980) 表 4.6 Corn steep liquor 之成分分析 (Belik et al.,1957;misecka and Zelinka,1959;Rhodes and Fletcher,1966) 總固形物 51% w/v 酸度 ( 乳酸 ) 15% w/v 遊離還原糖 5.6% w/v 加水分解後之遊離還原糖 6.8% w/v 總氮 4% w/v 胺基態氮 (N%) Alanine 25 Arginine 8 Glutamic acid 8 Leucine 6 Proline 5 Isoleucine 3.5 Threonine 3.5 Valine 3.5 Phenylalanine 2.0 Methionine 1.0 Cysteine 1.0 灰份 1.25% w/v K 20% P 1-5% Na 0.3-1% Mg % Fe % Cu Ca % Zn % Pb Ag % Cr Vitamin Thiamine(B1) 41-49μg/g Biotin μg/g Ca-pantothenate μg/g Folic acid μg/g Nicotinic acid amide 30-40μg/g Riboflavin(B2) μg/g 114

8 含 niacin 及 pyridoxine 選擇碳源之基準發酵工程的生產物是升麼, 需要使用何種碳源之相關性, 尤其生產物直接由同化碳源所製造的情形, 更具有密切的關係 Ethanol 或 SCP 的情形, 原料費佔成本的 60~77%, 製品之販賣價格會受到碳源價格的影響 (Whitaker, 1973;Moo-Young,1977) 依發酵內容的不同, 有時需將碳水化物原料中所含之不純物除去的情形, 例如 citric acid 發酵, 以砂糖以外的碳水化物來製造時, 需用各種方法, 事先將其中所含的金屬離子除去 (Karrow and Waksman,1947;Woodward Snell and Nicholls,1949;Smith 等,1974) 碳源等原料之選擇, 與政府之政策也有關, 例如 EC 各國鼓勵使用甜菜糖或 beet molasses, 價格也受到政府的控制, 輸入之 cane molasses 的價格與品質經常被抽查, 這是決定輸入價格的依據 日本的國產 beet molasses 的價格不得高於輸入 cane molasses 的價格 飲料品受各國, 或地方行政區之法律約束的地方很多,Ale( 英國產之色淡, 苦味濃之啤酒 ) 公之 the Manx Brewer Act (1874) 規定啤酒的釀造, 不得使用 malt 砂糖及 hop 以外的原料來製造 德國聯邦共和國也有類似的法律規定 Scotch malt whisky 的製造不得使用大麥 malt 水 酵母菌以外的東西來製造 法國則規定只有在某特定地方的釀造所製成的 wine, 才能命其特定的名稱 培養基的調製方法, 尤其在殺菌時會影響碳水化物在各發酵工程中的安定性, 因此糖之殺菌常有分開殺菌的情形, 此乃因糖會與 ammonia ion 或胺基酸反應生成黑色的氮化合物, 此種氮化合物會抑制微生物的生長 澱粉在殺菌工程之加熱時, 會引起糊化而提高其黏度, 因此除加工澱粉之外, 其餘使用澱粉的濃度均要在 2% 以下 (Solomons,1969) 碳源對生產物生成之影響碳源的利用速度會影響菌體生產, 一次代謝生產物 二次代謝生產物等之生成 能快速在高濃度糖之培養基中生長者, 對基質之消費速度也會很快, 此種情形就會降低二次代謝生產物之生產性, 此種現象, 在 griseofulvin (Rhodes, 1963) penicillin (Pirt and Righelato, 1967) siomycin (Kimura, 1967) bacitracin (Weinberg, 1967) actinomycin (Marshall 等,1968) streptomycin (Inamine 等,1969) 等之生產上就有此種現象 因此 115

9 發酵工程的基礎 在此種情形下則使用 lactose 之類利用速度較慢的糖來改善管理 (Johnson, 1952), 現在則採用如第二章所所述之糖的連續流加或半連續流加法來管理 氮源通常被使用之氮源大部份的工業微生物都能利用有機或無機之任一種的氮源 無機態氮源是以 ammonia gas ammonia 鹽 硝酸態氮等之型式供給 使用硫安時, 氮離子被菌消費掉後會殘留硫酸離子, 使培養液呈酸性化 使用 ammonia gas 或硝酸態氮時, 培養系會有傾向鹼性的情形 使用硝酸氨時, 在培養初期, ammonia 被消費, 而硝酸的消費會受抑制, 而使培養液呈酸性化, 但很快的 ammonia 被消費掉之後就會轉換成開始消費硝酸態氮, 培養液則轉變成傾向鹼性 (Morton and MacMillan, 1954) 此種情形之例外則在 Gibberella fujikuroi 的代謝中發現 (Borrow 等, ), 在硝酸離子存在條件下, 該菌對 ammonia 之利用在 ph 2.8~3.0 時就會受到抑制,pH 上升時才能再開始利用 ammonia, 在此之前則會繼續利用硝酸離子 有機態氮則以胺基酸 蛋白質或尿素之形式供給, 普通供給有機態氮時會加速菌的生長 自然界中的菌, 在生長上對胺基酸幾乎都不會有要求性 工業微生物有時不添加純胺基酸則不可以的, 在胺基酸發酵中, 培養營養要求性突變株時才會有的現象, 但是 lysine 發酵時則以大豆水解物代替高價的 methionine 及 threonine 也可以 (Nakayama,1972a) 在製造醫藥用疫苗 (vaccine) 時所用之培養基, 則需使用完全不含蛋白質之完全合成胺基酸培養基 (Rhodes and Fletcher,1966;Van Hemert,1974) 胺基酸可使用平常不很均質而且容易取得之天然有機氮複合體, 即以蛋白質的形式供給, 例如使用 CSL 大豆或大豆碎片(flake) 花生粉 (peanuts meal) 綿子 meal distillers solubles casein 水解物 屠宰場廢棄物 魚粉 酵母抽出物等 選擇氮源之基準將硝酸態氮還原成氨態氮之硝酸還原酵素 (nitrate reductase), 在 ammonia 存在下會受到 repression(brown MacDonald-Brown and Meers, 1974), 因此氮源多使用 ammonia 或其鹽類 氨離子一般認為會抑制絲狀菌對胺基酸之吸收或透過 (Whitaker,1976) Ammonia 對 Aspergillus nidulans 116

10 之 alkali protease 或中性 protease 生成有調節作用 (Cohen,1973), 因此若使用混合氮源時, 各種氮化合物則與各種的代謝調節有關, 一種氮化合物完全利用掉之後再利用另一種氮化合物, 進行所謂的選擇利用 氮源也會影響發酵的型 (pattern), 例如氮化合物之利用速度很快則抗生物質之生產就會被抑制, 生產聚烯 (polyenes) 系抗生物質則以營養素平衡良好的大豆 flake 做為其良好的氮源, 其理由是良質的蛋白質, 磷的含量很少, 同時水解速度很慢等, 因此使形成類似 trophophase 之生理條件來促進在 idiophase 的抗生物質生產 (Martin and McDaniel,1977) 在生產 gibberellin 時, 培養基中的氮源種類會決定生產那一類型的 gibberellin, 會影響生成之 gibberellin 類型的比例 (Jerrerys,1970) 其他在各工程上之特徵, 氮源會有選擇性的影響 Rhodes(1963) 說, 生產 griseofulvin 之最適氮源濃度會隨種菌或發酵槽之型式的不同而不同, 這些事實對各種發酵用培養基的開發是必需加以注意考慮的問題, 各種發酵所開發之最好的氮源則如表 4.7 所示 表 4.7 二次代謝生產物生產之最適氮源 二次代謝生產物 主氮源 文獻 Penicillin CSL Moyer and Coghill(1946) Bacitracin Peanut meal Inskeep et al.(1951) Riboflavin Gelatin 水解物 Malzahn et al.(1959) Novobiocin Distillers solubles Hoeksema and Smith(1961) Rifamycin Pharmamedia Sensi and Thiemann(1967) 大豆 flake,(nh4)2so4 Gibberellin Ammonium 鹽及植物蛋白質 Jefferys(1970) Butyrosine 乾燥牛血液或 hemoglobin 與 (NH4)2SO4 Claridge et al.(1974) Polyene 大豆 flake Martin and MacDaniel(1977) 礦物質 (mineral) 大部份的發酵生產培養基需要有 Mg 磷酸 K 硫酸 Ca Cl 等, 各別的要求量也不同, 需各別給予添加 Co Cu Fe Mn Mo Zn 等也需要, 這些的需要量是微量, 普通由培養基的其他成分帶入 ( 因存在於其他的培養基成分中 ) 表 4.6 是 CSL 的分析值, 表 4.8 是 pharmamedia 之分析值 由此種分析值來看, 這些原料有必要時常加以分析來確認其內容是可以理解的 以試藥及純水所配成之完全合成培養基, 則需添加這些微量元素, 這些微量元素之供給型態與添加濃度的範圍則如表 4.9 所示 如本章開始所述, penicillin 或 cephalosporin 所需的 S, 或 chlorotetracycline 所需 117

11 發酵工程的基礎 的 Cl, 由生產物中所含的這些元素的量, 依比例計算出培養基中的需要量, 是可以求出的 表 4.8 Pharmamedia 之組成 (Traders Protein Division) 組成 量 總固形物 98% 碳水化物 24.1% 還原糖 1.2% 非還原糖 1.2% 蛋白質 56% 胺基態氮 4.7% 胺基酸組成 Lysine 3.0% Leucine 3.5% Isoleucine 2.9% Threonine 2.9% Valine 4.0% Phenylalanine 4.9% Tryptophan 0.5% Methionine 1.6% Cysteine 1.4% Aspartic acid 7.5% Serine 17.4% Proline 3.8% Glycine 3.7% Alanine 3.8% Tyrosine 3.1% Histidine 2.2% Arginine 7.1% Mineral Ca 2,360ppm Cl 486ppm P 12,200ppm Fe 103ppm S 780ppm Mg 6,800ppm K 14,300ppm 脂肪 5.5% Vitamin Ascorbic acid 45.6mg/Kg Thiamine 15.7mg/Kg Riboflavin 10.8mg/Kg Niacin 59.7mg/Kg Pantothenic acid 43.2mg/Kg Choline 3,240mg/Kg 表 4.9 無機成分之濃度範圍 (g/l) 成分 濃度範圍 *KH2PO MgSO4 7H2O KCl CaCO FeSO4 4H2O ZnSO4 8H2O MnSO4 H2O CuSO4 5H2O Na2MoO4 2H2O * 以動植物來源之天然物所調製的培 養基則含有相當多的磷 118

12 Pyridoxine Biotin Folic acid Inositol 11.9mg/Kg 0.4mg/Kg 1.8mg/Kg mg/Kg 在部份的發酵中, 礦物質的添加量則非常重要, 有些二次代謝生產物的生產比在增殖期時之無機磷的容許量要少得很多, 需要少到在 trophophase 終了時能完全消費掉的程度, 此種濃度之無機磷的抑制作用, 在 bacitracin citric acid ( 表面培養 ) ergot, monomycin novobiocin oxytetracycline polyene ristomycin rifamycin Y streptomycin vancomycin viomycin 等則有此種現象 (Sensi and Thieman, 1967 ; Demain, 1968 ; Weinberg, 1974 ; Liu McDanieland Schaffner, 1975) 的報告 Pyrrolnitrin(Arima, 1965), bicyclomycin(miyoshi,1972),thiopeptin (Miyairi 等,1970) 等則需高濃度的磷酸 Streptomyces jamaicensis 在磷酸濃度 0.1mM 及 0.4mM 時會分別製造二種 monomycin (Hall and Hassall, 1970) 1950 年 Garner 說, 發酵培養基中之 Ca 的作用是將過量的磷酸使沉澱除去, 有此種效果的 Ca 能間接的提高 streptomycin 的收率 Weinberg (1970) 從生物學的觀點來看原子番號 23~30 (V Cr Mn Fe Co Ni Cu Zn), 42(Mo) 等九種元素,Mn Fe Zn 等會影響二次代謝生產物, 被研究得較多之二次代謝生產物代謝系中, 發現生產物收率會與 key metal 之濃度的對數成比例, 此種直線性關係, 在菌生長不足的濃度或過量發生抑制的濃度下, 此種關係就不能成立 在高於菌的最大生長所需的微量金屬濃度, 會對一次代謝生產物或二次代謝生產物的蓄積造成影響的如表 4.10 所示 表 4.10 微量元素對一次代謝生產物 二次代謝生產物生產之影響 發酵生產物微量元素文獻 Bacitracin Mn Weinberg and Tonnis(1966) Riboflavin Fe Co Hickey(1945) Fe Tanner et al.(1945) Protease Mn Mizusawa et al.(1966) Actinomycin Fe Zn Katz et al.(1958) Chloramphenicol Fe Zn Galliccgio et al.(1958) Neomycin Fn Zn Majumdar and Majumdar(1965) Citric acid Fe Mn Zn Shu and Johnson(1948) Penicillin Fe Zn Cu Foster et al.(1943) Koffler et al.(1947) 119

13 發酵工程的基礎 Griseofulvin Zn Grove(1967) Patulin Fe Zn Brack(1947) 氯在絲狀菌的代謝中並無營養素的作用 (Foster,1949), 但是好鹽菌中也有需要氯者 (Larsen,1962), 會代謝生產含氯化合物之微生物, 其生合成是不會往生產不含氯的物質, 此種發酵的例子, 有如 chlorotetracycline 發酵與 griseofulvin 發酵 Griseofulvin 發酵時, 最適氯濃度是相當於 0.1% 之 KCl 濃度 (Rhodes 等,1955), 以共同存在氮源之有機化合物中來供給也可以 Birkinshaw(1963) 說含氯的發酵生產物有 caldriomycin nornidulin mollisin 等 Vitamin 天然的碳源, 氮源中都含有大部份微生物生長所需的 vitamin, vitamin 含量很少時, 改變原料之配合率來防止 vitamin 供給量之不足 (Rhodes and Fletcher,1966), 不足的 vitamin 若只有一種的話, 則不用便宜, 而且需要大量之天然原料才夠供給之 vitamin 複合體, 反而使用純的 vitamin 會更經濟 在醋的釀造用培養基中有添加 Ca-pantothenate 的情形 (Beaman, 1967) Glutamic acid 發酵則需要 biotin( 參考第 3 章 ), 有些菌株則對 vitamin B1 有要求性 (Kinoshita 等,1972) 培養基的再利用生產 SCP 用之大型連續發酵槽則設計成能循環再利用其流加液的形式 (Topiwala and Khosvori,1978;Hamer,1979;Levi 等,1979) 再利用之流加液則需再補充營養素, 因此從培養液中分離菌體所使用之凝集劑, 同時考慮再利用時需補充營養素的關係, 所使用之凝集劑則使用磷酸系列的凝集劑, 此種培養基的循環再利用, 在經濟上, 成本上都是有利的, 但是在此種工程中, 所不希望產生的代謝生產物, 在循環系中會慢慢的蓄積增加為其問題 緩衝液要達到最大生產性, 對 ph 的控制是非常重要, 添加在培養基中的各種化合物除提供菌的營養外, 同時也提供培養基之緩衝能, 發酵液中添加 CaCO3 時, 大約可使 ph 維持在 7.0,pH 下降時則會使 CaCO3 溶解使 ph 上昇, 反 120

14 之菌產生酸則使 ph 下降, 磷酸是培養基的一種重要的營養成分, 對於緩衝能的形成, 也具有重要的功能 培養基的緩衝能也會受培養基中所含之蛋白質,peptide 或 CSL 中所含之胺基酸的影響 培養基的 C/N 比對 ph 的控制也是很重要的因素, 不論如何, 培養系的 ph, 可藉由添加 ammonia NaOH H2SO4 等加以控制 ( 參閱第 8 章 ) Precursor 或代謝調解劑的添加 培養基成分中, 具有促進菌生長之物質, 即具有調節生成生產物之物質, 這些稱為 precursor inhibitor inducer 等, 全部都是應用於提高發酵生產性 Precursor 在一部份的發酵中, 添加某些物質, 使其直接轉變成其生產物 Penicillin 在發酵開始初期為提高其生產性, 就以此種方法在檢討 (Moyer and Coghill, ) 檢討能進入 penicillin 母核之側鏈部份之分子的大小 最初增加 CSL 的添加量, 則使 penicillin 的生產量從 20 unit/ml 提高到 100 unit/ml, 認為能進入側鏈部份之分子較大的較好, 但是隨後的研究發現,CSL 中所含的 phenyl ethylamine, 對 penicillin 母核作用, 而選擇的製造 benzyl penicillin(penicillin G) Penicillin 的活性則在側鏈部份之構造上, 已知在發酵生成 penicillin 的律速階段是在合成這個側鏈的部份, 因此在進行發酵時, 培養基中一般都添加 phenylacetate 之類的側鏈 precursor Smith 及 Bide (1948) 在培養基中添加 phenylacetate 及其誘導體, 不僅使 penicillin 的生產性提高三倍, 同時也使其他利用 penicillin 母核之 benzyl penicillin 的生成比率, 由原有的 0 提高到 93% Phenylacetate 現在也廣泛的被當做生產 penicillin 的 precursor, 在工業上幾種重要的 precursor 則如表 4.11 所示 表 4.11 發酵所用之 precursor Precursor 發酵生產物 微生物 文獻 Phenylacetate 及 其關連化合物 Penicillin G Penicillium chrysogenum Moyer and Coghill(1947) Phenoxyacetate Penicillin V Penicillium chrysogenum Soper et al.(1948) 氯化物 Chlorotetracycline Streptomyces aureofaciens Van Dyck and de Somer(1952) 氯化物 Griseofulvin Penicillium griseofulvin Rhodes et al.(1955) *Propionic acid Riboflavin Lactobacillus bulgaricus Smiley and Stone(1955) 氰化物 Vitamin B12 Propionibacterium, 121

15 發酵工程的基礎 Streptomyces spp. Mervyn and Smith(1964) β-ionone Carotenoid Phycomyces blakesleeanus Reyes et al.(1964) α-aminobutyrate L-Isoleucine Bacillus subtilis Nakayama(1972b) D-threonine L-Isoleucine Serratia marcescens Anthranilic acid L-Tryptophan Hansenula anomala Glycine L-Serine Corynebacterium glycinophilum * 依別的方法之收率沒有很大差異 Inhibitor 添加某種抑制劑, 使特定的物質蓄積, 使普通會被代謝的東西而成為代謝中間體蓄積 如由微生物生產 glycerol (Eoff Linder and Beyer, 1919) Glycerol 生產是在酒精發酵中, 將 acetoaldehyde 排除到反應系外即可, 即在培養液 (broth) 中添加亞硫酸氫鈉, 乙醛 (acetoaldehyde) 就會形成 acetoaldehyde- 亞硫酸氫鈉複合體 CH3CH = 0 + Na + HSO3 - CH3CH OH SO3 -Na + 一旦形成此種複合體時,acetoaldehyde 就會與 NADH 之氧化還原無關, dihydroxy acetone phosphate 就成為 glycolysis 中產生之氫的受容體 (acceptor), 結果就會生成 glycerol-3-phosphate, 而產生 glycerol 發酵上被使用的 inhibitor 如表 4.12 所示 很多的情形,inhibitor 會提高目的生產物之發酵收率, 減少生成不需要之副產物 氯化作用之抑制劑, 例如在 tetracycline 發酵中添加溴化物, 是否會抑制 chlorotetracycline 之副生, 則有許多的研究 (Gourevitch 等, 1956 ; Lepetit S. p. A.,1957; Goodman 等,1959;Lein 等,1959;Szumski, 1959) 表 4.12 發酵所用之 inhibitor 發酵生產物 Inhibitor 主要效果微生物文獻 Glycerol 亞硫酸氫鈉抑制 acetoaldehyde 生成 Saccharomyces cerevisiae Eoff et al.(1919) Tetracycline 臭化物 抑制 chlorotetracycline Streptomyces aureofaciens Leptit(1957) 生成 Glutamic acid Penicillin 細胞膜透過性 Micrococcus glutamicus Phillips and Somerson(1960) Citric acid Alkali 金屬 / 磷酸 抑制 oxalic acid 生成 Aspergillus niger Batti(1967) ph 2.0 以下 122

16 Valine 各種抑制劑 各種的抑制效果 Brevibacterium roseum Uemura et al. (1972) Rifamycin B Diethylbarbituric 阻礙其他的 Nocardia mediterranei Lancini and acid rifamycin 生成 White(1973) Inhibitor 也會影響細胞壁之構造, 提高膜透過性, 促進生產物向細胞外的分泌 Glutamic acid 發酵, 就因為如此, 故使用 penicillin 或界面活性劑 (Phillips and Somerson,1960) Inducer 在工業上有價值的酵素幾乎都屬誘導酵素, 誘導酵素是在培養基中含有酵素之基質或其類緣化合物等 inducer ( 誘導酵素之基質 ) 時才會生成的酵素, 因此, 以生產微生物酵素為目的之培養基, 要添加各種特殊的 inducer 關於 inducer, 有 Davies (1963) 之廣範圍的解說, 酵素製造公司, 未發表生產用之 inducer, 表 4.13 中只表示其中一部份, 一般的 inducer 而已 表 4.13 工業上重要的酵素 inducer 例子 酵素 Inducer 微生物 文獻 α-amylasestarch Starch Aspergillus spp. Windish and Mhatre(1965) Maltose Bacillus subtilis Pullulanase Maltose Aerobacter aerogenes Wallenfels et al.(1966) α-mannosidase 酵母 mannan Streptomyces griseus Inamine et al.(1969) Penicillin acylase Phenylacetate Escherichia coli Carrington(1971) Protease 各種蛋白質 Bacillus spp. Keay(1971) Streptococcus spp. Aunstrup(1974) Streptomyces spp. Aspergillus spp. Mucor spp. Cellulase Cellulose Trichoderma viride Reese(1972) Pectinase Pectin Aspergillus spp. Fogarty and Ward(1974) (beet 纖維, 蘋果渣, 柑桔皮 ) 最適培養基組成是獲得良好發酵成績的基本, 依 Aunstrup (1974) 說, protease 生產培養基, 蛋白質濃度要高, 碳水化物濃度不能過高, 因碳水化物常常會引起 catabolite repression (Davies,1963;Inamine Lago and Demain,1969;Reese,1972) 在整個發酵過程中要維持低濃度時, 可在發酵途中再以添加碳水化物的方式來添加使維持在低濃度, 有各種酵素利用此種方式來獲得高生產性的報告 (Guntelberg,1954;Davies,1963; 123

17 發酵工程的基礎 Kalabokias,1972;Reese,1972) 改變 inducer 用法之例子是在生產 streptomycin 中, 使用酵母 mannan 的方法 (Inamine Lago and Demain,1969), 該發酵是在發酵中使 streptomycin 變化而生成 mannosidostreptomycin,mannosidostreptomycin 的活性只有 streptomycin 之 20% 左右, 是不要的副產物 添加酵母 mannan 時, 使 streptomycin 生產菌 Streptomyces griseus 生成 α-mannosidase, 而會分解 mannosidostreptomycin 生成 streptomycin 氧氣要求氧氣並非開始就添加於培養基成分中的東西, 是營養素之一的重要基本基質之一, 氧氣要如何供給在控制生長速度或物質生產上是特別的重要, 關於這點在第九章有詳述 與氧氣供給有關之培養基的問題有下列 1. 快速代謝 : 在代謝速度很快, 而且糖的濃度很高時, 就會提高對氧氣的要求量, 氧氣的供給就會不足, 結果就變成氧氣律速培養 2. 流動學 (rheology): 培養基成分中之各成分對培養基粘度的影響, 結果就會影響通氣攪拌 3. 消泡 : 所使用之消泡劑很多都屬界面活性劑, 會降低氧氣移動速度, 這個問題在別項中討論 快速代謝營養素的變化也會改變氧氣移動速度 (Finn,1954) 例如 Penicillium chrysogenum 對 glucose 之利用速度比 lactose 或 sucrose 要快, 以 glucose 為主要碳源時, 對氧氣要求速度較高 (Johnson,1946), 因此假如利用速度太快, 可能造成氧氣不足時, 將培養基中之主原料, 開始就降低其濃度, 然後在發酵中連續的或半連續的流加基質的方法, 來避開氧氣的律速 ( 參照本章次節及第 2 章 ) 改用 lactose 或澱粉等碳水化物, 或改用蛋白質來取代這些碳水化物等, 利用速度就不會很快, 改用對氧氣要求速度較小的培養基成分也是避開氧氣律速的一種方法 Rheology 124

18 Deindoerfer 與 West(1960) 檢討會改變粘度之培養基成分, 澱粉或其他多醣類之高分子化合物, 在發酵工程中會影響其 rheology(tuffile and Pinho,1970) 多醣類被分解則液體粘度會發生變化 微生物所生產的多醣類也會有某種影響 (Banks Mantle and Syczyrbak,1974;Leduy Marsan and Coupal,1974) 此種問題在第 9 章會詳述 濃度限制 1900 年代開始, 在生產麵包酵母時, 所使用之培養基的 molasses 濃度, 不論如何注意控制,molasses 過量時, 立刻造成生長過剩, 造成氧氣的供給來不及, 呈缺氧狀態而引起嫌氣發酵, 結果則以生產 ethanol 來代替生產菌體 因此開始時則以低濃度的培養基出發, 然後再追加基質的培養法, 從 1915 年 ~1920 年之間導入此種培養法 (Reed and Peppler,1973) 不論是分批流加或連續流加, 此種想法目前在很多的發酵工程中仍被採用, 這是使發酵管理良好, 使培養基有效利用之手段 ( 表 4.14) 表 4.14 分批流加 連續流加之發酵工程 生產物流加 (feed) 文獻 酵母 Molasses, 氮源,P 及 Mg Harrison(1971) Reed and Peppler(1973) Glycerol 糖,NaHSO4 Eoff,Linder and Beyer(1919) Acetone butanol 糖液之添加與除去 Soc.Richard et al.(1921) Riboflavin 碳水化物 Moss and Klein(1946) Penicillin Glucose 與 ammonia Hosler and Johnson(1953) Novoviocin 各種碳源及氮源 Smith(1956) Griseofulvin 碳水化物 Hockkenhull(1959) Rifamycin Glucose, 脂肪酸 Pan et al.(1959) Gibberellin Glucose Borrow et al.(1960) Vitamin B12 Glucose Becher et al.(1961) Tetracycline Glucose Avanzini(1963) Citric acid 碳水化物,ammonia Shepherd(1963) SCP Methanol Harrison et al.(1972) Candicidin Glucose Martin and McDaniel(1975) Streptomycin Glucose, 硫安 Singh et al.(1976) Cephalosporin 新鮮的培養基 Trilli et al.(1977) 125

19 發酵工程的基礎 培養基之流加法只參考有限的分析結果來實施, 流加液的適時添加並非依培養系之需要性來決定, 是依據預先訂好的進度來進行 後來可耐蒸氣殺菌之 ph 電極或溶氧電極已被開發出來 ( 第 8 章 ), 發酵槽裝上自動偵測器之流加技術已經可以應用 Hockenhull (1959) 開發出以添加碳水化物來控制 ph 之改良型 griseofulvin 發酵, 此種發酵是在調整碳水化物的添加, 據說也可使 ph 變化達到近似理想的模式 同樣的在 penicillin 發酵也開發使用 ph(pan 等,1972) 或溶氧濃度 (Squires,1972) 之偵測器, 一面偵測一面添加 glucose 的方法 消泡發泡使很多發酵工程發生問題, 原因很多是因培養基中的蛋白質, 使氣相與培養液的界面變性, 形成不易破壞之薄膜, 發泡是使培養液中的菌體流出, 結果會引起菌體的 autolysis, 因溶菌所生成之蛋白質, 要使泡沫安定化的關係, 而使泡沫變得更多 假如泡沫不加以控制時,air filter 就會弄濕, 可能就有遭受雜菌污染的危險, 同時因 siphon 現象的作用有使培養液流失的危險 Hall 等 (1973) 將發酵之發泡分成下列 5 類型 1. 在發酵之全期間都會發泡者 2. 發酵初期, 會減少發泡, 隨後就呈一定者 3. 發酵初期, 只微量減少發泡, 隨後又會增加者 4. 最初不太會發泡, 但漸漸會激烈發泡者 5. 上述的發泡類型, 有 2 種類型同時發生之複雜的發泡 對於激烈發泡的對策有下列二種方法 (Hall 等,1973) 1. 培養基成分之一部份經前處理去除不純物, 修正 ph 溫度 通氣攪拌等之物理條件 但是這是假定發泡之原因在培養基成分上, 而不在代謝產物之情形, 故所適用之範圍是非常有限 2. 發泡無法抑制時, 則需使用消泡劑, 這是一般的方法 消泡劑是屬界面活性劑, 降低泡沫之表面張力, 然後再發生將發泡的原因物質給予置換, 如此來達到抑制發泡的作用, 消泡劑本身不會發生泡沫 (Solomons,1967) 理想的消泡劑需具備下列性質 1. 容易分散, 能立刻與泡沫發生作用 126

20 2. 低濃度就會有效 3. 使用後能長時間的抑制泡沫發生 4. 對微生物無毒性 5. 對人體 動物無毒性 6. 對抽出分離工程上不會發生問題 7. 搬運時不會有危險 8. 價廉 9. 不影響氧氣移動速度 10. 對熱要安定 下列的化合物大約能滿足上述的條件, 對各種發酵工程會有安定的作用 (Solomons,1969) 1.Alcoho 類 :Stearyl decanol Octyl decanol 2.Ester 3. 脂肪酸及其誘導體 (glyceride): 綿子油 亞麻仁油 大豆油 橄欖油 篦麻油 4.Silicone 5.Sulfonic acid 6. 其他 :Alkaterge C oxazoline propylene glycol 這些消泡劑是在發酵發泡時才添加, 很多的消泡劑對水的溶解度很低, 猪油 (lard) liquid paraffin 篦麻油等常被當 carrier 使用, 來提高其水溶性, 這些 carrier 有時會被利用, 有可能對發酵造成某些影響 (Solomons,1967) 如上所述, 在控制發酵時有需要消泡劑, 但大部份的消泡劑都會使氧氣移動速度降低 50%, 故添加時需採用需要量的最低限 (Solomons and Perkins,1958;Phillips 等,1960;Bull and Kempe,1971) 假如消泡劑之添加對氧氣供給會帶給決定性的影響時, 則需考慮檢討以機械消泡裝置來消泡 127

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