黄金时期 ( 本世纪初 ): 后基因组时期我国科学家的贡献 :1965 年, 人工合成全生物活性结晶牛胰岛素 :1981 年, 人工合成具有生物活性的酵母丙氨酰 trna: 参与了人类基因组计划 (1%) 等等 ( 三 ) 生物化学与分子生物学及各专业的关系分子生物学 (Molecular Biol

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1 普通生物化学 ( 上篇 ) 绪论重点 : 生物化学的概念 研究内容 ; 生物化学的研究发展简史 ; 生物化学与分子生物学及各专业的关系 ( 一 ) 生物化学的概念 研究内容概念 : 生物化学 (Biochemistry) 介于生物与化学之间的边缘学科, 研究活细胞和有机体中存在的各种化学成分及其所参与的化学反应, 是研究生命现象化学基础的一门科学 研究内容 : 静态生物化学 : 构成生物体的基本物质 ( 生物大分子 糖类 脂类 蛋白质 核酸 ) 的结构 性质及结构与功能的关系 动态生物化学 : 构成生物体的基本化学成分在生命活动过程中的变化规律 ( 物质代谢和能量代谢 ) 信息生物化学 : 包括核酸的生物合成, 蛋白质的生物合成, 物质代谢与基因表达的调控等 现代生物化学与分子生物学研究的重点和热点 : 功能基因组学 (functional genomics); 蛋白质组学 (proteomics); 细胞信号转导 (signal transduction) 等 ( 二 ) 生物化学的研究发展简史准备和酝酿阶段 (18c 中期 -20c 初 ): 研究生物体的化学组成建立与发展阶段 (20c 初 -20c 中叶 ): 重要分子的发现和物质代谢途径的确定深入发展阶段 (20c 中叶 -20c 末 ): 分子生物学时期

2 黄金时期 ( 本世纪初 ): 后基因组时期我国科学家的贡献 :1965 年, 人工合成全生物活性结晶牛胰岛素 :1981 年, 人工合成具有生物活性的酵母丙氨酰 trna: 参与了人类基因组计划 (1%) 等等 ( 三 ) 生物化学与分子生物学及各专业的关系分子生物学 (Molecular Biology): 生物化学学科的重要组成部分, 是从分子水平认识和研究生命现象的科学 生物学各学科 : 生物化学是生物学各学科的最基础的学科, 生物化学的进步极大地推动了生物学各学科的发展 化学是学习生物化学不可缺少的基础课程 随着生物学研究的深入, 物理学 数学及信息学也渗透到生物化学中 蛋白质化学重点 : 蛋白质组成 结构 性质及蛋白质的结构与功能的关系 ; 蛋白质的分离 纯化和鉴定 蛋白质 : 构成生物体的基本成分, 生命活动的执行者, 生命的物质基础. 蛋白质的生物学功能 : 生物催化 ; 代谢调节 ; 免疫保护 ; 物质转运和贮存 ; 运动与支持 ; 生长 繁殖 遗传和变异 ; 生物膜的功能和受体等 蛋白质的分类 : 组成 : 单纯蛋白质和结合蛋白质肽链数目 : 单体蛋白质和寡聚或多体蛋白质功能 : 非活性蛋白 ( 保护或支持作用 ) 和活性蛋白溶解度 : 可溶性蛋白质 ( 水 稀中性盐和稀酸溶液 ) 醇溶性蛋白质(70~80% 乙醇 ) 和不溶性蛋白质分子形状 : 纤维状蛋白质 球状蛋白质和膜蛋白 ( 一 ) 蛋白质的结构

3 一 蛋白质的元素组成 :C(50~55%) H(6~8%) O(20~23%) N(15~18%) S(0~4%) P I Se 等, 其中氮元素的含量平均约 16% 凯氏 (Kjadehl) 定氮法 : 每克样品含氮克数 =100g 样品中的蛋白质含量 (g%) 二 蛋白质的结构单位 氨基酸 (amino acid) 氨基酸 : 蛋白质的基本组成单位 蛋白质氨基酸 : 编码氨基酸 ( 标准氨基酸或基本氨基酸 :20 种 ) 和非编码氨基酸 ( 非标准氨基酸 )1 氨基酸的结构通式:(1)Cα 结合 (-NH3 + ) (-COOH) H 原子和各种侧链 (R)( Pro 除外 );(2)Cα 是不对称 C, 具有手性 (Gly 除外 ), 蛋白质氨基酸都是 L- 型 2 氨基酸的分类: 来源 ( 内源 AA 和外源 AA); 营养学 ( 必需 AA 和非必需 AA); 侧链 (R) 根据 R 的化学结构 :(1) 脂肪族氨基酸 :Gly Ala Val Leu Ile Met Cys Arg Lys Asp Glu Asn Gln Ser Thr;(2) 芳香族氨基酸 :Phe Tyr; (3) 杂环氨基酸 :Trp His;( 4) 杂环亚氨基酸 :Pro 根据 R 的极性 :(1) 非极性 疏水性氨基酸 :R 为烃基 苯甲基等非极性基团 (Gly,Ala,Val,Leu,Ile,Phe,Pro);(2) 极性 中性氨基酸 :R 为羟基 (Ser,Thr,Tyr) 巯基 (Cys,Met) 酰胺基(Trp,Asn,Gln) 等极性基团 ;(3) 极性 酸性氨基酸 (Asp,Glu);( 4) 极性 碱性氨基酸 (Lys Arg His) 胱氨酸和二硫键 3. 氨基酸的理化性质 (1). 一般物理性质 : 无色或白色结晶, 熔点 >200, 不同味道 ;α 氨基酸均可溶于强酸 强碱和水, 不溶于有机溶剂

4 (2). 两性电离性质 : 氨基酸在水溶液中或在晶体状态时都以离子形式存在, 在同一个氨基酸分子上带有能解离出质子的 NH3 + 正离子和能接受质子的 COO - 负离子, 为两性电解质 结合或释放质子取决于环境 ph pi(isoelectric point): 在一定 ph 环境下, 氨基酸游离成阴 阳离子的程度及趋势相等或为兼性离子 (Zwitterion), 在电场中既不向阳极也不向阴极迁移时的 ph 值 等电点的确定 :1 酸碱滴定 ( 滴定曲线 );2 根据 pk 值 ( 等电点等于两性离子两侧 pk 值的算术平均数 ) (3). 紫外吸收性质 :Trp Tyr 和 Phe 含共轭双键苯环, 在 280nm 处有最大吸收峰 (4). 化学性质 :α-nh2 α-cooh 和 R 侧链的活性基团可发生相关化学反应 1) α-nh 2 发生的化学反应 1 与甲醛反应 : 氨基酸 α-nh 2 与甲醛反应生成二羟甲基氨基酸 甲醛滴定法 : 测定氨基酸含量 2 与 2,4- 二硝基氟苯 (DNFB 或 FDNB) 反应 :Sanger 反应,α-NH 2 的 H 原子被烃基取代的烃基化反应, 在碱性中生成二硝基苯基氨基酸 ( 黄色 ) 可用于 N 端分析 3 与 5- 二甲氨基萘磺酰氯 (DNS-Cl) 反应 :α-nh 2 的 H 原子被酰基取代 的酰基化反应, 在碱性中生成 5- 二甲氨基萘磺酰氨基酸 (DNS- 氨基酸 : 荧光 ) 取代 DNFB 测定蛋白质 N 端氨基酸, 用于多肽分析 4 与异硫氰酸苯酯 (PITC) 反应 :Edman 降解,α-NH 2 的 H 原子被烃基取代的烃基化反应, 在碱性中生成苯氨基硫甲酰氨基酸 (PTC- 氨基酸 ), 无水 HF 中生成苯乙内酰硫脲衍生物 (PTH-

5 氨基酸 : 无色 ) 重复测定多肽链 N 端氨基酸排列顺序, 是氨基酸自动分析的基 础 5 脱氨基反应 : 生物体内氨基酸分解代谢的重要方式之一 2)α-COOH 发生的 化学反应 1 成酯和成盐反应 : 羧基的化学性质被掩蔽, 氨基的化学性质突出地显 示出来 2 成酰氯反应 : 氨基酸的羧基活化, 易与另一氨基酸的氨基结合 3 成 酰胺反应 :Asp(Glu) 转化成 Asn(Gln) 4 脱羧反应 : 生物体内氨基酸分解代谢的重要方式之一 3)α-NH2 和 α-cooh 共同参与的化学反应 1 与茚三酮反应 : 氨基酸与茚三酮在 弱酸性溶液中加热可产生有色化合物, 含游离 α- 氨基的氨基酸和肽类生成蓝紫色 化合物, 脯氨酸 (Pro) 生成黄色化合物 较灵敏, 颜色深浅可定量 2 成肽反应 4) R 侧链的活性基团发生的化学反应 氨基酸以肽键共价连接形成线性序列 多肽链, 多肽链折叠形成蛋白质特殊的 构象 (conformation) 蛋白质有四种结构层次 : 一级结构 (primary structure ); 二级结构 (secondary structure ); 三级结构 (tertiary structure ); 四级结构 (quaternary structure ) ( 不总是有 ) 三 蛋白质的一级结构 : 化学结构, 即蛋白质分子中氨基酸的线性序列 肽 : 氨 基酸通过肽键相连而形成的化合物 (1) 概念 : 肽键 ( 酰胺键 ): 一个氨基酸的 α- 羧基与另一氨基酸的 α- 氨基脱水缩合形成的键 N- 端 : 肽链有游离的氨基的一端 C- 端 : 肽链有游离的羧基一端氨基酸残基 (amino acid residues): 肽链中的每个氨基酸部分 多肽链主链 (main chain of polypeptide chain ): 由肽键连接各氨基酸残基形成

6 的长链骨架多肽链侧链 (side chain): 蛋白质多肽链中的各氨基酸侧链基团寡肽 (oligopeptide)(20 个以下氨基酸残基 ) 多肽 (polypeptide )( 多于 20 个氨基酸残基 ) 蛋白质 : 由一条或几条多肽链组成的生物大分子 (2) 肽的书写格式 : 游离 α- 氨基在左, 游离 α- 羧基在右, 氨基酸之间用 - 表示肽键 化学名称 : 某氨 酰某氨酰某氨酰 某氨酰某氨酸 (3) 重要的多肽 生物活性肽 ( 含量极少, 很难纯化, 具有重要的商业价值 )1 谷胱甘肽 (glutathione,gsh): 谷氨酰 - 半胱氨酰 - 甘氨酸 ( 三肽 )2 多肽类激素 : 促甲状腺素释放激素 ( 焦谷氨酰组氨酰脯酰胺 );Met- 脑啡肽 (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met); Leu- 脑啡肽 (Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu); 催产素 (9 肽 ); 升压素 (9 肽 ); 促肾上腺皮质激素 (ACTH:39 肽 ); 胰高血糖素 ( 胰岛 α- 细胞分泌 29 肽 ) 3 多肽类抗生素等等 一级结构 (primary structure): 就是蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序, 即氨基酸的线性序列 一级结构中包含共价键 (covalent bonds): 肽键 (peptide bond) 和二硫键 (disulfide bond) 一级结构是蛋白质的基本结构, 决定着蛋白质的空间结构 3 一级结构测定步骤 (1) 纯化样品,N- 端或 C- 端末端分析, 测定由几条肽链组成 N- 末端氨基酸的分析 :Sanger 法 (2,4- 二硝基氟苯与 N 端氨基进行烷化反应, 生成二硝基苯衍生物, 酸水解得到黄色 DNP- 氨基酸, 可用乙醚抽提再进行色谱分 析 ); 丹磺酰氯法 ( 有很强荧光, 灵敏度高 );Edman 法 ( 苯异硫腈 (PITC) 与 氨 基反应生成 PTC- 多肽, 酸水解后得到 PTH- 氨基酸, 后者可用乙酸乙酯抽提后进行

7 鉴定 ); 氨肽酶法 ( 外肽酶 : 肽链外切酶 )C- 末端氨基酸的分析 : 羧肽酶法 ( 羧肽酶 A 水解脂肪或芳香族氨基酸的 C- 末端, 羧肽酶 B 水解碱性氨基酸的 C- 末端 ); 与苯甲醛沉淀等 (2) 拆分二硫键 : 还原法 ( 含巯基化合物 (-SH) 如 2 巯基乙醇使 -S S- 还原产生两个半胱氨酸残基 (Cys-SH), 烷化剂 ( 如碘乙酸 ) 修饰 -SH, 阻止二硫键再生成 ); 氧化法 ( 过甲酸使 -S S- 氧化断裂, 生成半胱氨磺酸 ) (3) 氨基酸组成分析 : 水解样品, 氨基酸自动分析仪测定 酸水解法 :6mol/L HCl110 加热回流 16~24h, 完全水解,Trp 被破坏,Gln,Asn 酰胺基水解变成 Glu,Asp(Glx,Asx) 近年来用甲基磺酸代替盐酸 碱水解法 : 6mol/L NaOH 煮沸 6h, 完全水解, 消旋,Ser Thr Arg Lys 和 Cys 破坏 (4) 多肽链的部分断裂和肽段分离 : 将蛋白质分解为若干个一定长度的小片段 ( 至少两种不同方法水解成两套肽段 ) 酶水解法 : 内肽酶 ( 肽链内切酶 ) 胰蛋白酶法 : 水解 Lys 或 Arg 的羧基形成的肽键糜蛋白酶 ( 胰凝乳蛋白酶 ) 法 : 水解 Phe Trp 和 Tyr 等疏水氨基酸的羧基形成的肽键胃蛋白酶法 : 被断裂键两侧的残基都是疏水性氨基酸如 :--Phe---Phe-- 化学法 CNBr 法 : 裂解由 Met 羧基形成的肽键 (5) 测定每条小肽片段中的氨基酸排列顺序 ( 通常用 Edman 降解法 ) (6) 推断蛋白质的氨基酸排列顺序 ( 重叠肽拼凑 ) (7) 确定二硫键和酰胺基的位置

8 四 蛋白质的空间结构 ( 构象 :conformation): 高级结构, 蛋白质分子中所有 原子在三维空间的排列分布和肽链的走向 构象决定着蛋白质的分子形状 理化 性质和生物学活性 1 蛋白质的二级结构 (secondary structure): 多肽链本身的折叠和盘绕方式, 是空间结构单元 (1) 肽键平面 ( 酰胺平面 : 肽单元 ): 肽键 -CO-NH- 的碳与氮之间有部分双键性质, 不能自由转动,2 个 Cα 在肽键的异侧 ( 反式构型 ), 与肽键相关的 6 个原子 ( 肽键 -CO-NH- 中的 4 个原子和它相邻的两个 α- 碳原子 ) 形成一个刚性平面 N-C a 键和 C a -C 键是单键,N-C a 键 ( φ) 和 C a -C 键 ( ψ) 可 ( ) 旋转, 二面角 (φ,ψ) 决定了相邻肽平面的相对空间位置 一个蛋白质的构象 取决于肽单位绕 N-C a 键和 C a -N 键的旋转, 旋转受到肽链的主链和相邻残基的侧 链原子之间的立体干扰的限制 (2) 二级结构的型式 1) α- 螺旋 (α-helix): 肽平面通过 α 碳原子旋转, 使碳链主链沿中心轴盘曲成稳定的右手螺旋构象 许多纤维蛋白和球蛋白存在 结构要点 : 一般为右手螺旋,φ=-57,ψ=-47, 每个螺旋圈含 3.6 个氨基酸残基, 螺旋间距离 ( 螺距 ) 为 0.54nm, 每个残基沿轴旋转 100, 上升 0.15nm; 螺旋圈之间通过氢键维持结构稳定, 第 N 个氨基酸残基的羰基氧与第 N+4 个氨基酸残基的氨基氢形成氢键, 氢键的走向平行于螺旋轴 ;R 侧链基团伸向螺旋的 外侧, 其大小 形状及电荷等是影响此结构形成的主要因素 表示 :n s 螺旋 例如 : 螺旋,310 螺旋和 螺旋 (π- 螺旋 ) 2) β - 折叠片层 (β-pleated sheet): 肽链按层排列, 以肽键平面为单位折叠成锯齿状的一种较伸展片层结构 许多纤维蛋白和球蛋白存在 结构要点 : 肽链较伸展, 每个残基大约占 0.32~ 0.34nm, 肽键的平面性使多肽折叠成片, 遇 Cα 发生折叠, 形成锯齿状结构, 氨 基酸 R 侧链交错位于折叠片的上面和下面, 两个残基形成一个重复单位 ; 肽链按层排列, 两条或多条肽链片段平行排列, 形成片层结构, 相邻多肽链的走向可以是顺向平行 ( 平行 ) 或反向平行 ( 反平行 ); 相邻肽链上所有的羰基氧和氨基氢形成链间氢键维持结构的稳定性 平行 (Parallel):φ=-119,ψ=+113 ; 重复单位 0.65nm 反平行 (Anti-parallel):φ=-140,ψ=+135 ; 重复 单位 0.70nm 3) β- 转角 (β-turn): 多肽链反转方向 180 的回折形成发夹形 状 球蛋白存在 结构要点 : 常位于三维结构的表面 ; 一般由四个氨基酸组成, 常见氨基酸 : Pro,Gly,Asp,Asn,Trp; 以氢键维持稳定, 第 1 个氨基酸残基的 C=O 与第 4 个残基的 N-H 之间形成氢键 4) 不规则卷曲 (random coil): 没有确定规律性的松散肽链结构 2 蛋白质的三级结构 (tertiary structure) (1) 超二级结构 (super-secondary structure): 三级结构的 建筑模块 1)

9 模体或模序 (motif): 在空间上靠近的二级结构单元彼此相互作用, 形成的有规则的 在空间上能辨认的二级结构组合体 常见类型 :αα βββ βαβ 等 2) 结构域 (domain): 球状蛋白质的折叠单位 在模体或模序的基础上进一步绕曲折叠形成的具有部分生物功能的紧密的近似球形的空间结构区域 对于较大的蛋白质分子或亚基, 多肽链往往由两个以上结构域缔合而成三级结构 (2) 蛋白质的三级结构 (tertiary structure): 多肽链上的所有原子 ( 包括主链和侧链 ) 在三维空间的分布 结构特点 : 大多数可离子化的残基都位于分子表面, 疏水氨基酸残基大部分埋藏在分子内部 ( 特别是一些疏水性强的氨基酸 ), 多肽链高度折叠成紧密球形或椭 球形结构. 稳定维系三级结构的作用力有 : 氢键 离子键 疏水键 二硫键和配 位键 三级结构对于蛋白质的分子形状和生物学活性非常重要 肌红蛋白 (Myoglobin ), 丙糖磷酸异构酶等 3 蛋白质的四级结构 (quaternary structure): 两个以上多肽亚基 (subunit)( 非共价键连接 ) 在蛋白质分子内的空间排布和相互关系 亚基或亚单位 (subunit): 每一条具有独立三级结构的多肽链 血红蛋白 (Hemoglobin) 五 蛋白质分子中的共价键与次级键 1 共价键 : 肽键, 二硫键 2 次级键 : 氢键, 疏水键, 盐键, 范德华力维持蛋白质空间结构的化学键 : 氢键, 疏水键, 盐键, 范德华力, 二硫键, 配位键 六 蛋白质的折叠 (protein folding): 伸展的肽链形成特定的三维结构, 使无活性的分子成为具有特定生物学功能的蛋白质 参与体内多肽链折叠的蛋白质分子伴侣 (molecular chaperone): 帮助其他含多肽结构的物质在体内进行正确的非共价的组装的蛋白质 酶 : 蛋白质二硫键异构酶, 肽基脯氨酸顺 - 反异构酶等 七 胶原蛋白 (collagen): 原胶原蛋白分子头尾相连, 交错排列, 分子间共价 交连, 形成特征性的带状纤维束 原胶原蛋白 :3 条左手螺旋多肽链相互缠绕形成右手超螺旋分子, 长 300nm, 直径为 1.5nm; 靠链间氢键以及螺旋和超螺旋的反向盘绕维持超螺旋结构稳定性 胶原链 : 每一圈螺旋含 3 个氨基酸残基, 每一个氨基酸残基轴向距离为 0.31nm, 螺距为 0.94nm; 三联体序列 -Gly-Pro-Hyp- 常重复出现 ( 二 ) 蛋白质结构与功能的关系一 蛋白质一级结构与构象和功能的关系 1. 一级结构不同, 生物学功能各异 : 加压素和催产素 2. 一级结构的关键部分相同. 其功能也相同 : 同源蛋白 3. 一级结构的关键部分变化, 生物学活性改变或丧失 4 一级结构的变化与疾病的关系 : 镰刀状红细胞性贫血 (Sickle cell anemia) ( 二 ) 蛋白质构象与功能的关系 1 酶原的激活 空间构象的改变 2 蛋白质的变构现象 别构效应 (allosterism) 别 ( 变 ) 构作用 : 含亚基的蛋白质由于一个亚基的构象改变而引起其余亚基和整个分子构象 性质和功能发生改变的作用 别构效应 (allosterism): 因别构而产生的效应称别构效应 别构蛋白 : 具有别构效应的蛋白质

10 血红蛋白正协同效应 (positive cooperativity): 第一个氧分子与一个亚基结合, 使余下的 3 个亚基的血红素更容易与其它的氧分子结合 结合每一氧分子都会使血红蛋白对氧的亲和性增加, 这种互相作用的结合现象称之结合的正协同性 波尔效应 (Bohr effect): CO2 浓度的增加降低细胞内的 ph, 血红蛋白结合 H+ 和 CO2 使得血红蛋白对氧亲和力下降, 血红蛋白的 P50 升高 ( 三 ) 蛋白质的理化性质及其分离纯化一 蛋白质的理化性质 1 蛋白质两性解离特性 : 蛋白质具有可解离 H + 的酸性基团和结合 H + 的碱性基团, 具有两性解离特性, 在溶液中起酸碱缓冲作用 (1) 等电点 (pi): 使某一蛋白质所带正负电荷相等时的溶液 ph 值称为该蛋白质的等电点 ph<pi, 蛋白质带正电 ;ph>pi, 蛋白质带负电, 体内蛋白质的 pi 大多为 5 左右, 故生理条件下一般以负离子形式存在 ; 等电点 ph 时为两性离子 (2) 各蛋白质的一级结构不同,pI 不同, 荷电种类和数量也不同 (3) 应用 : 等电点沉淀 离子交换层析和电泳 电泳 : 带电颗粒在电场中移动的现象 离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography 简称为 IEC): 是依据流动相中的组分离子与离子交换剂 ( 固定相 ) 上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法 阴离子交换层析基本分离过程 : 1 阴离子交换剂装柱平衡 (R X+Y-) 2 加样 ( 待分离溶液 : 可能有正电基团 负电基团和中性基团 ): 负电基团 (A-) 与平衡离子 (Y-) 进行可逆置换, 结合到离子交换剂上 (R X+A-) 正电基团和中性基团不能与离子交换剂结合, 随流动相流出而被去除 3 洗脱 ; 洗脱液中的离子与结合在离子交换剂上的各种负电基团 (A-) 进行置换, 各种负电基团 (A-) 按其与离子交换剂结合力从小到大的顺序逐步被洗脱下来, 随洗脱液流出 2 蛋白质的亲水特性 (1) 球状的水溶性蛋白亲水基团分布于分子表面, 疏水基团由疏水作用聚合在分子内部 (2) 分子表面的亲水基团与周围水分子结合形成水化层 ( 水膜 ) (3) 分子表面的亲水基团可结合或释放 H +, 带一定电荷, 水溶液中蛋白质颗粒 带相同电荷 3 蛋白质的胶体性质 : 蛋白质水溶液是稳定的胶体溶液, 具有胶体溶液的特点 蛋白质胶体溶液稳定的原因 : 1) 胶体颗粒直径 ;2) 表面形成水膜 ( 水化层 );3) 带相同电荷 4 蛋白质的沉淀反应 : 破坏胶体溶液稳定的因素 (1) 中性盐沉淀反应 : 高盐破坏水膜 中和电荷, 蛋白质聚集沉淀 盐析, 蛋白质不变性 盐溶作用 : 稀盐使蛋白质表面同性电荷增加, 增加蛋白质分子间的排斥, 同时与水分子间的作用增强, 而增加溶解性 分级 ( 段 ) 盐析 : 不同蛋白质盐析的盐浓度不同, 用不同盐浓度分级沉淀蛋白质

11 (2) 有机溶剂沉淀反应 : 用与水互溶的乙醇 丙酮等夺取水膜, 等电点时加入更易沉淀, 易引起变性 ( 与有机溶剂浓度 作用时间和沉淀温度有关 ) (3) 重金属盐沉淀反应 : 蛋白质在体内一般为负离子, 可与 Cu 2 +,Hg 2+,Ag + 和 Pb 2+ 等结合为不溶性蛋白盐而沉淀 (4) 生物碱试剂的沉淀反应 : 蛋白质在 ph<pi 时带正电荷, 可与苦味酸 磷钨酸 鞣酸 三氯醋酸 磺基水杨酸等结合沉淀 (5) 加热沉淀反应 : 蛋白质热变性沉淀, 等电点时最易沉淀 凝固 : 变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象 5 蛋白质的变性与复性 (1) 蛋白质变性 : 概念 : 在理化因素作用下, 蛋白质分子内的二硫键和非共价键被破坏, 分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化, 天然构象发生变化, 引起蛋白质理化性质和活性的改变 ( 原有性质发生部分或全部丧失 ) 变性本质 : 空间构象的改变或破坏 变性特征 : 1) 生物活性丧失 ( 主要标志 ) 2) 理化性质改变 : 1 分子形状改变, 肽链松散伸展, 反应基团增加, 易被水解, 易被酶消化 2 蛋白质变性后亲水基团被掩埋, 溶解度降低 失去水膜, 易形成沉淀析出 ; 但若溶液 ph 与蛋白质的 pi 差别较大, 蛋白质仍不易沉淀 3 球状蛋白质的不对称性增加 粘度增加 扩散系数降低, 某些蛋白质结晶能力丧失 (2) 蛋白质复性 : 有些蛋白质的变性作用是可逆的, 其变性如不超过一定限度, 经适当处理后, 可重新变为天然蛋白质 6 蛋白质的其它特性 (1) 紫外吸收特性 :Trp Tyr Phe 等氨基酸残基可特异地吸收紫外光 :λ max=280nm (2) 颜色反应双缩脲反应 : 肽键与碱性铜溶液产生兰色络合物, 肽键越多颜色越深 用于蛋白质定性定量和检测蛋白质水解程度 酚试剂反应 : 碱性条件下,Tyr 和 Trp 可与含磷钨酸 - 磷钼酸的酚试剂化合物生成兰色物, 兰色强度与蛋白质量成正比, 测定蛋白质常用方法 米伦反应 黄色反应 乙醛酸反应 (Hopking-Cole 反应 坂口反应 (Sakaguchi 反应 ) 茚三酮反应等 二 蛋白质的分离纯化蛋白质研究基本步骤 : 一般温和物理方法 ( 盐析 透析 电泳 层析和超速离心等 ) 提取和纯化蛋白质 ; 测定氨基酸组成, 分析氨基酸顺序 ; 确定空间结构 (X 射线衍射法 NMR 或生物学软件推测 ) 并进行生物学活性的鉴定 1 生物大分子的制备 (1) 生物大分子制备的特点 ( 与化学产品的分离制备比较 ) 1) 许多生物大分子含量微, 耗用生物材料多 ;2) 分离纯化的步骤多, 流程长 ;

12 3) 分离纯化方法差别大, 没有标准方法 ;4) 生物大分子极易失活, 分离纯化时要选用最适宜的环境和条件防止失活 ;5) 制备中各种参数的综合影响, 很难准确估计和判断, 实验的重复性较差 ;6) 制备过程复杂困难, 更需百折不挠的钻研精神 (2) 生物大分子制备的基本步骤 1) 确定制备目的和要求 ;2) 掌握目的产物的物理化学性质 ;3) 建立相应的可靠的分析测定方法 ;4) 生物材料的破碎和预处理 ;5) 选择和探索分离纯化方案 ; 6) 纯度鉴定 ;7) 产物的浓缩, 干燥和保存 2 蛋白质的制备 (1) 前处理 : 1) 选择适当的生物材料 ( 适合制备的目的和要求 ; 尽可能保持新鲜 ) 2) 加工处理 : 动物组织除结缔组织 脂肪等非活性部分, 绞碎 ; 植物去壳 除脂 ; 微生物材料及时将菌体与发酵液分开 3) 破碎细胞 1 机械法 : 研磨 ; 组织捣碎器 2 物理法 : 反复冻融法 ; 超声波 ; 压榨法 ; 冷热交替法 3 化学与生物化学方法 : 自溶法 ; 溶胀法 ; 酶解法 ; 有机溶剂处理法 4) 提取蛋白质 : 目的蛋白保持天然状态充分释放到溶剂中 1 水溶液 : 稀盐溶液和缓冲液 通常 0 ~5 使用 0.02mol/L~0.05mol/L 缓冲液或 0.09mol/L~0.15mol/LNaCl 溶液 ph=6~8( 偏离等电点的两侧 ) 提取蛋白质和酶 加入抑制剂或调节提取液的 ph 离子强度或极性使蛋白酶或核酸酶失活 ; 加入少量巯基乙醇或半胱氨酸防止巯基氧化 2 有机溶剂 : 乙醇 丙酮 异丙醇 正丁醇等 (2) 分离纯化 : 依据目的蛋白与杂质之间的物理化学和生物学性质上的差异, 选择正确的分离纯化方法 ( 分离纯化方案 ) 1) 分离纯化方法 1 以分子大小和形态的差异为依据的方法 : 差速离心 区带离心 超滤 透析和凝胶过滤等 2 以溶解度的差异为依据的方法 : 盐析 萃取 分配层析 选择性沉淀和结晶等 3 以电荷差异为依据的方法 : 电泳 电渗析 等电点沉淀 吸附层析和离子交换层析等 4 以生物学功能专一性为依据的方法 : 亲和层析等 2) 早期和晚期的分离纯化方法 1 早期分离纯化 ( 粗分级 ): 除去大部分与目的产物物理化学性质差异大的杂质 方法 : 吸附 ; 萃取 ; 沉淀法 ( 热变性 盐析 有机溶剂沉淀等 ); 离子交换 ; 亲和层析等 快速 粗放 ; 能较大地缩小体积 ; 分辨力不太高 ; 负荷能力大 2 晚期分离纯化 ( 细分级 ): 除去与目的产物物理化学性质差异小的杂质 方法 : 吸附层析 盐析 凝胶过滤 离子交换层析 亲和层析 等电聚焦制备电泳 制备 HPLC 等 3) 蛋白质含量测定与纯度鉴定 : 1 含量测定 : 凯氏定氮法 双缩脲法 Folin- 酚试剂法 (Lowry 法, 标准测定方法 ) 紫外吸收法 染料 ( 考马斯亮蓝 ) 结合法 胶体金法 2 均一性的鉴定 : 电泳 离心沉降 HPLC 和溶解度分析等 ( 同时采用 2~3 种不同的纯度鉴定法确定 ) (3) 样品浓缩 干燥和保存 :

13 浓缩 : 减压加温蒸发浓缩 ; 空气流动蒸发浓缩 ; 冷冻干燥法 ; 吸收法 ; 超滤法 ; 透析法等 干燥 : 冷冻或真空干燥, 然后分装并写明标签 保存 : 保存 ( 液态样品不能太稀, 一般需加入防腐剂和稳定剂 ) 小结 习题 酶化学 重点 : 酶的结构与功能关系 ; 酶的动力学基础 ( 一 ) 酶通论每一种生命过程必需生物催化剂 (Biocatalysts) 一 酶的研究历史 : 1 酶的发现和提出 ;2 提出酶促动力学原理 米氏学说 ;3 确立蛋白质本质 ; 4 RNA 具有催化作用 二 酶的概念及作用特点 1 概念 : 生物活细胞产生的 具有催化能力的以蛋白质为主要成分的生物催化剂 (Biocatalysts) 酶促反应 (Enzymatic reaction): 酶催化的生物化学反应 底物 (substrate): 由酶催化, 发生化学变化的物质 2 酶的作用特点 (1) 与一般催化剂的共性 (2) 生物催化剂的特性 1) 高效性 : 显著降低化学反应的活化能, 提高反应速度 倍 ( 非酶 催化剂 ) 或 倍 ( 非催化反应 ) 2) 专一性 : 又称特异性, 是指酶对底物严格的选择性 酶只作用于某一种或某一类特定的底物 1 结构专一性 : 绝对专一性 (Absolute specificity): 只作用于一个特定的底物 例如 : 脲酶 麦芽糖酶 淀粉酶等相对专一性 (Relative Specificity): 作用于一类化合物或一类化学键族 (group) 专一性 : 对键两端的基团要求的程度不同, 只对其中一个基团要求严格 键 (Bond) 专一性 : 对于键两端的基团没有严格的要求 2 立体化学 ( 异构 ) 专一性 : 旋光异构专一性 : 选择性催化旋光异构体的一种 几何异构专一性 (geometrical specificity): 选择性催化几何异构体的一种构型潜 ( 前 ) 手性专一性 3) 反应条件温和 : 常温 常压和接近中性酸碱度水溶液中进行

14 4) 酶易失活 : 使蛋白质变性的因素 ( 如强酸 强碱高温等 ) 能使酶变性失去活 性 5) 酶活力可调节控制 : 酶和代谢物的区域化分布 ; 变构调节 共价修饰调节和酶原激活 ; 酶含量的调节 ( 诱导 阻遏和降解 ); 激素调节等 6) 某些酶催化活力与辅酶 辅基及金属离子有关 7) 酶促反应无副反应三 酶的化学本质 1 大多数酶是蛋白质 : 酶水解的产物是氨基酸 ; 使蛋白质变性的因素也能使酶变性 ; 酶具有两性解离和等电点性质 ; 不能透过半透膜 ; 和蛋白质具有相同的颜色反应 2 Ribozyme( 核酶 ): 有催化活性的天然 RNA 四 酶的化学组成 1 单纯酶 (simple enzyme): 氨基酸 2 结合酶 (Conjugated enzyme): 全酶 (holoenzyme) 酶蛋白 (apoenzyme): 脱辅酶 (apoprotein), 氨基酸, 决定酶的专一性辅因子 (cofactor): 金属离子或有机小分子化合物, 作为电子 原子或某些化学基团的载体, 决定酶的催化性 辅基 (prosthetic group): 与酶蛋白以共价紧密结合, 不容易被透析或超滤法除去, 如黄素和生物素等 辅酶 (coenzyme): 与酶蛋白以非共价键疏松结合, 容易被透析或超滤法除去, 如 TPP NAD 等 五 酶的结构组成 1 单体酶 (monomeric enzyme): 一条肽链或几条肽链共价缔合, 最高结构为三级结构 2 寡聚酶 (oligomeric enzyme): 两个或两个以上亚基以非共价键结合, 最高结构为四级结构 3 多酶复合物 (multienzyme system): 几个功能相关, 不同种类的酶以非共价键彼此聚合而成的复合物游离可溶型 可溶型多酶复合体和膜结合多酶复合体 4 多功能酶 (multifunctional enzyme) 或串联酶 (tandem enzyme) 六 酶的命名 1 习惯命名法 : (1) 根据催化底物命名 ( 蛋白酶 ; 淀粉酶 ) (2) 根据催化反应的性质命名 ( 水解酶 ; 转氨酶 ; 裂解酶等 ) (3) 结合上述两个原则命名 ( 琥珀酸脱氢酶 ) (4) 在这些命名基础上加上酶的来源或其它特点缺点 : 一酶多名, 一名多酶, 写出反应难 2 国际系统命名法 : 底物名称 ( 构型 )+ 反应性质 + 酶 底物全部列出, 用冒号 (:) 分隔 水解反应的底物水和反应类型可省去 七 酶的分类国际系统分类法 : 1961 年国际酶学委员会 (Enzyme Committee, EC) 根据酶所催化的反应类型和机理, 分成 6 大类 :

15 1 氧化 - 还原酶类 (Oxido-reductases): 催化氧化 - 还原反应, 主要是氢的转移或电子传递的反应 (1) 脱氢酶类 (dehydrogenase): 催化直接从底物上脱氢的反应 (2) 氧化酶类 (Oxidase) (3) 过氧化物酶 (4) 加氧酶 ( 双加氧酶和单加氧酶 ) 2 转移 ( 移换 ) 酶类 (Transferases): 催化化合物中某些基团的转移 根据基团分成 8 个亚类 : 转移碳基 酮基或醛基 酰基 糖基 烃基 含氮基 含磷基和含硫基的酶 3 水解酶类 (hydrolases): 催化底物的加水分解反应 4 裂合 ( 裂解 ) 酶类 (Lyase): 催化从底物分子中非水解性移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应 主要包括醛缩酶 水化酶 ( 脱水酶 ) 及脱氨酶等 5 异构酶类 (Isomerases): 催化各种同分异构体的相互转化 常见的有消旋和变旋 醛酮异构 顺反异构和变位酶类 6 合成酶类 (Ligases or Synthetases): 连接酶, 与 ATP 分解反应相偶联催化 C-C C-O C-N 以及 C-S 键的形成反应 酶的编号 ( 身份证号码 ):EC 酶大类号. 亚类号. 亚亚类号. 序号 Ribozyme( 核酶 ): 具有催化功能的 RNA 分子种类 : 自催化核酶 催化分子内反应 ; 分子间催化核酶 Abzyme( 抗体酶 ): 具有酶活性的抗体 ( 二 ) 酶的结构 一 酶分子结构 : 一般球状蛋白, 具有一 二 三 四级结构 二 酶的活性中心 (active center) 1 概念 : 酶分子中直接与底物结合, 并和酶催化作用直接有关的部位 2 酶活性部位的主要特征 (1) 占据的空间很小 ; (2) 位于酶分子的特定空间结构区域 : 酶蛋白的两个结构域或亚基之间的裂隙 (clefts 或 crevices), 或分子表面的凹槽 ; (3) 三维空间结构, 一条或几条多肽链上空间位置比较靠近的氨基酸残基或其基团组成, 包括 : COOH NH2 OH SH 和咪唑基等, 辅助因子参与活性中心 ; (4) 含有结合底物部位和参与催化底物转化为产物的催化部位 ; (5) 结合底物的特异性取决于活性部位中精确的原子排列 ; (6) 底物大都是通过相对弱的力与酶结合 3 酶活性的必需基团 (essential group) (1) 概念 : 多肽链上间接或直接与酶催化活性相关的某些功能基团 (2) 类型 : 1 活性中心必需基团结合基团 (binding group): 专一性催化基团 (catalytic group): 催化性质 2 活性中心外必需基团 : 稳定酶分子的构象

16 ( 三 ) 酶促反应的机制 一 酶促反应的能力学基础 : 酶降低化学反应活化能, 使活化分子数增多 酶促化学反应自由能方程式 :ΔG=ΔH-TΔS 二 中间产物学说 : 酶 - 底物复合物酶与底物结合特点 : (1) 酶活性中心与底物结合 ;(2) 可逆的 非共价的结合 ; (3) 诱导契合 (induced fit) 模式 酶与底物的过渡态互补, 亲合力最强, 释放出结合能, 使 ES 的过渡态能级降低, 有利于底物分子跨越能垒, 加速酶促反应速度 三 诱导契合假说 (induced-fit hypothesis): 1958,Koshland, 酶活性中心的结构是柔性的, 当底物与酶分子结合时, 底物分子诱导酶蛋白的构象发生了有利于与底物结合的变化, 使反应所需的催化基团和结合基团正确地排列和定向, 转入有效的作用位置, 使酶与底物完全吻合, 契合形成中间产物酶 - 底物复合物 锁钥学说 : 酶和底物的关系就象锁与钥匙那样的刚性关系, 酶活性中心结构与底物的结构互相吻合, 紧密结合成中间络合物 四 使酶具有高催化效率的因素 1 邻近定向效应 : 酶与底物结合成中间产物过程中, 底物分子从稀溶液中密集到活性中心区, 并使活性中心的催化基团与底物的反应基团之间正确定向排列所产生的效应 2 张力 与 形变 : 酶与底物结合, 底物分子也会发生扭曲变形, 使底物分子的某些键的键能减弱, 产生键扭曲, 降低了反应活化能 3 酸 - 碱催化 : 通过暂时提供或接受一个质子稳定过渡态 功能基团有氨基 羧基 咪唑基 巯基和酚基等 4 共价催化 : 酶分子上的活性基团与底物以共价键结合, 形成过渡态 亲核催化 : 带有多电子的原子如 O S 和 N 提供电子攻击底物上相对带正电子的原子 ( 如羰基碳 ) 亲电催化 : 亲电试剂 ( 具有接受电子对的原子 ) 引起的催化反应, 是亲核催化的反过程 5 表面效应 (surface effect): 疏水性 口袋 效应酶活动中心微环境是疏水性的, 有利于多种催化方式的进行 多元催化 (multielement catalysis): 多个基元催化形式协同作用 ( 四 ) 酶促反应的动力学 酶促反应动力学 : 研究酶促反应速度及其影响因素 酶促反应速度 : 单位时间内底物减少或产物增加的速度, 常用初速度来衡量 影响酶促反应速度的因素 : 一 底物浓度对酶促反应速度的影响 1 底物浓度与反应速度关系曲线 : 矩形双曲线一级反应 : 当 [S] 很低时,[S] 与 v 成比例混合级反应 : 当 [S] 较高时,[S] 与 v 不成比例零级反应 : 当 [S] 很高时,[S],v 不变, 达到最大反应速度

17 2 中间产物学说解释 : 底物浓度很低时, 有酶与底物结合, 随着底物浓度的增加, 中间络合物的浓度不断增高 底物浓度较高时, 酶饱和, 增加底物浓度无更多的中间产物生成, 反应速度不再随底物浓度的增加而增加, 达到最大反应速度 3 米 曼氏方程 (Michaelis-Menten equation): V=Vmax.[S]/(Km+[S]) (1) 成立条件 : 初速度为标准 ; 单底物 ; 稳态 (steady state) (2) 推导方程 : 稳态时,ES 生成速度 =ES 分解速度,k1([E]-[ES])[S]=k2[ES]+k3[ES] (3) 米- 曼氏方程解释 : 当 [S] Km 时,v=(Vmax/Km)[S], 即 v 正比于 [S] 当 [S] Km 时,v Vmax, 即 [S] 而 v 不变 (4) Km 与 Vmax 的意义 1) Km 的意义 1 最大反应速度一半时的底物浓度 2 酶的特征性常数之一,Km 值范围在 mol/l 3k2 k3,km 可表示酶对底物的亲和力大小,Km 与酶对底物亲和力大小成反 比 4 推测正确测定酶活力时所需的底物浓度 5 推断某一代谢物在体内可能的代 谢途径, 决定于 km 最小的酶 2)Vmax 的意义 : 酶完全被底物饱和时的反应速度, 与酶浓度呈正比 :Vm=K3[ES]=K3[E] (5) Km 值与 Vmax 值测定 1 v 与 [S] 的关系曲线 2 双倒数作图法又称林 - 贝氏 (Lineweaver-Burk) 作图法 1/V=Km/Vmax.1/[S]+1/Vmax 斜率 =Km/Vmax; 纵轴截距 1/Vmax; 横轴截距 -1/Km 二 酶浓度对反应速度的影响 : 反应速度与酶浓度成正比 v=k3[e][s]/km+[s] 当 [S] v=k3[e] [E], 式中 Km 忽略不计 三 温度对酶促反应速度的影响两种不同影响 : 1. 温度升高, 反应速度加快 ; 2. 温度升高, 热变性速度加快 酶活性与反应温度的关系曲线 : 一般钟形最适温度 : 酶活性最高时的温度, 也即酶促反应速度最大时的温度 四 ph 对酶促反应速度的影响

18 ph 对酶作用的影响 : 1 影响酶活性基团 底物的解离 ;2 过酸 过碱使酶变性失活 酶活性与 ph 的关系曲线 : 一般钟形最适 ph: 酶活性最高时的 ph, 也即酶促反应速度最大时的 ph 最适温度 最适 ph 不是酶的特征常数, 会受到酶的浓度 底物以及缓冲液的种类等因素的影响 五 抑制剂对酶促反应速度的影响抑制剂 : 改变酶的必需基团或活性部位基团的化学性质, 间接或直接地影响酶的活性中心, 使酶活性降低甚至失活但不引起酶蛋白变性的物质 抑制作用 : 使酶活性降低或丧失 抑制程度 : 由酶与抑制剂之间的亲和力大小 抑制剂的浓度以及底物的浓度决定 1 不可逆抑制 (irreversible inhibition) 与酶的必需基团共价结合, 使酶丧失活性, 不能用透析超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性 2 可逆抑制 (reversible inhibition) 与酶以非共价键疏松结合使酶活性降低或丧失, 能够通过透析 超滤等物理方法除去抑制剂使酶恢复活性 (1) 竞争性抑制 (competitive inhibition) 特点 : 1I 与 S 分子结构相似 ; 2 抑制剂和底物竞争酶的活性中心结合部位 3Vmax 不变, 表观 Km 增大 ; 4 抑制程度取决于 I 与 E 的亲和力, 以及 [I] 和 [S] 的相对浓度比例 增加 [S] 浓度可以解除抑制 (2) 非竞争性抑制 (non-competitive inhibition) 特点 : 1I 与 S 分子结构不同 ; 2Vmax 减小, 表观 Km 不变 ; 3 抑制程度取决于 [I] 大小 (3) 反竞争性抑制 (uncompetitive inhibition) 特点 : 1I 与 S 分子结构不同,I 只与 ES 结合 2Vmax 和表观 Km 都减小 ; 3 抑制程度取决于 [I] 和 [ES] 二者的浓度 六 激活剂对酶促反应速度的影响激活剂 : 使酶活性由无变有或增加的物质 必需激活剂 : 使酶活性由无变有 例如 :Mg 2+ 对己糖激酶 非必需激活剂 : 使酶活性显著增加 例如 :Cl - 对淀粉酶 激活作用 : 使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加 ( 五 ) 酶的调节 一 酶活性的调节 : 共价调节 :

19 1 酶原激活酶原 (zymogen): 在细胞内合成或初分泌时无活性的酶的前体 (1) 概念 : 在特定条件下, 酶原被水解一个或几个特定肽段致使酶分子构象发生重塑, 表现出酶活性的过程 实质 : 酶活性部位形成和暴露的过程 例 : 胰蛋白酶原的激活过程 ; 肠激酶启动的酶原激活 (2) 酶原与酶原激活的生理意义 1) 保护分泌此酶组织器官免受酶的水解破坏 ; 2) 保证酶在特定时空发挥催化作用 ; 4) 酶原可作为酶的储存形式 2 酶的可逆共价修饰 (covalent modification) (1) 概念 : 在其他酶的催化下, 酶分子上特定基团与某种化学基团发生可逆性共价结合, 从而改变酶的活性 可逆共价修饰酶 : 能可逆共价修饰的酶 (2) 共价修饰基团类型 : 磷酸化 / 去磷酸化 乙酰化 / 去乙酰化 甲基化 / 去甲基化 腺苷化 / 去腺苷化等 例 : 肌肉中磷酸化酶的磷酸化和去磷酸化过程 : (3) 酶促化学修饰对酶活性的调节例 : 糖原磷酸化酶 : 磷酸化激活 ( 磷酸化酶 a)/ 脱磷酸化抑制 ( 磷酸化酶 b); 糖原合成酶 : 磷酸化抑制 / 脱磷酸化激活 (4) 激素启动的磷酸化级联机制 : 激素 + 受体 腺苷酸环化酶活化 camp 别构激活蛋白激酶 A 有活性磷酸化酶激酶 ( 磷酸化 ) 有活性磷酸化酶 a( 磷酸化酶 b 磷酸化 ) 非共价调节 : 3 酶的变构调节 (allosteric regulation) (1) 别构酶 (allosteric enzyme): 具有类似血红蛋白那样的别构效应的酶 特点 :1 一般是寡聚酶 ;2 具有别构效应 ;3v 对 [S] 不呈直角双曲线, 是 S 形曲线 (2) 变构调节 : 酶的别构部位与变构剂结合, 引起酶活性部位的构象改变从而改变酶的活性 1) 别构抑制 : 负变构剂与酶的别构部位结合而引起酶活性下降 反馈抑制 : 代谢过程中局部反应产物对催化该反应的酶起抑制作用 反馈抑制可认为是可逆抑制 2) 别构激活 : 正变构剂与酶的别构部位结合而引起酶活性增加 例如 :camp 激活蛋白激酶 A 限速酶 : 控制着整个代谢通路进行速度的酶 在一个连续的反应链中反应速度最慢的那一步反应的酶, 可通过化学修饰和别构效应调节此酶活性 二 酶含量的调节 1 酶蛋白合成的诱导和阻遏 转录水平 (1) 诱导作用 (induction) 和诱导剂 (inducer) (2) 阻遏作用 (repression) 和辅阻遏剂 (corepressor) 2 酶蛋白降解的调控 (1) 无选择性蛋白降解 : 溶酶体 (2) 选择性蛋白降解 :ATP+ 泛肽 + 泛肽结合降解酶三 同工酶 (ioenzyme)

20 1 概念 : 催化相同化学反应, 但在蛋白质分子的结构 理化性质和免疫性能等方面都存在明显差异的一组酶 2 本质 : 同一种属中由不同基因或等位基因编码的多肽链所组成的单体 纯聚体或杂合体 3 存在 : 同一个体的不同或相同组织的同一细胞中, 对代谢调节有重要意义 例如 : 乳酸脱氢酶 (LDH) 同工酶 ( 六 ) 酶的制备与活力测定一 酶活力测定 酶活性 : 酶催化某一化学反应的能力, 以酶促反应速度来衡量 酶活性单位 : 指酶促反应在单位时间 (s,min,h) 内生成一定量 (mg, μg, μmol) 的产物或消耗一定量的底物所需的酶量 一个国际单位 (IU,1976 年 ): 在特定条件下 ( 最适的反应条件 :25 ),1min 内催化 1 mol 底物转化为产物所需的酶量定为一个酶活力单位,1IU=1μmol/min 一个催量 (kat): 在特定条件 ( 最适条件 ) 下,1Sec 内使 1mol 底物转化为产物所需的酶量 即 1kat=1mol/s;1IU= kat= Kat;1Kat= IU 转换数 (turnover number): 每秒钟每个酶分子能催化的发生变化的底物微摩尔 数, 用 kcat 表示 ( mol/s) 酶比活 : 每毫克蛋白所含有的酶活力单位数 纯化倍数 = 每次比活力 / 第一次比活力产率 %( 回收率 )=( 每次总活力 / 第一次总活力 ) 100 三 酶的制备工业上大多采用微生物发酵的方法来获得大量酶制剂 酶分离纯化的三个基本步骤 :1 抽提 ;2 纯化 ;3 结晶或制剂 小结 习题 维生素化学 重点 :B 族维生素与辅酶 ( 基 ) 一 概述 1 维生素 (Vitamin) 的定义 : 维持正常生命活动所必需的一类小分子有机化合物 2 维生素的特点 : (1) 既不供给能量, 也不构成组织成分 ; 参与体内物质代谢与调节 (2) 体内不能合成或合成甚微, 必须由食物供给 (3) 需要量很少, 但不可缺少 ( g mg/d); 长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病 维生素缺乏症

21 3 维生素的命名 (1) 按发现先后 :A B C D (2) 根据化学结构或生理功能命名 : 硫胺素 (3) 初发现时以为是一种, 以后证实是几种维生素的混合物, 则在字母右下方注以 维生素的分类 (1) 脂溶性维生素 : 维生素 A D E K 等 (2) 水溶性维生素 : 维生素 B 族 (B1 B2 泛酸 维生素 PP B6 生物素 叶 酸,B12) 和维生素 C 等 二 脂溶性维生素 1 维生素 A: 视黄醇 (1) 化学结构及性质 1) 结构 :β- 白芷酮环的不饱和一元醇, 包括 A1 和 A2 两种 维生素 A 原 : 本身不具有 VitA 活性, 但在体内可转变为 VitA 的物质, 如类胡萝卜素 2) 性质 : 活泼 空气中易氧化, 紫外线照射可破坏, 食物中稳定 (2) 生物化学功能及缺乏病 1) 功能 :1 构成视觉细胞内感光物质 : 视紫红质 = 视蛋白 +11- 顺视黄醛 2 维持上皮组织结构的完整和健全, 促进上皮细胞糖蛋白的合成 ; 3 促进生长发育 ;4 防癌作用 2)VitA 缺乏 : 夜盲症, 粘膜干燥, 干眼病 2 维生素 D: 抗佝偻病维生素 (1) 化学结构及性质 1) 结构 : 类固醇衍生物, 维生素 D2 D3 D4 D5 四种, 其中 D2 和 D3 较为重要 维生素 D3 原 :7- 脱氢胆固醇 D3( 胆钙化醇 ) 活性形式 :1,25-(OH)2-D3 2) 性质 : 稳定 耐热 (2) 生物化学功能及缺乏病 1) 功能 : 调节钙 磷代谢, 促进 Ca P 吸收, 维持血液正常的钙 磷浓度, 促进钙化, 使牙齿 骨骼发育正常 2)VitD 缺乏 : 小儿 ( 佝偻病 ), 成人 ( 软骨病或骨质疏松 ) 3 维生素 E: 生育酚或抗不育维生素 (1) 化学结构及性质 1) 结构 : 苯骈二氢吡喃衍生物, 已知有 8 种, 其中 4 种 (α β γ δ- 生育酚 ) 较为重要,α- 生育酚的效价最高 2) 性质 : 对热稳定, 对氧敏感 : 抗氧化剂 (2) 生物化学功能及缺乏病 1) 功能 :

22 1 与生殖功能有关 2 保护生物膜 3 抗衰老 防癌及增强免疫作用 2)VitE 缺乏 : 生殖系统的上皮细胞毁坏, 雄性睾丸退化, 不产生精子, 雌性流产或胎儿被溶化吸收 4 维生素 K: 凝血维生素 (1) 化学结构及性质 1) 结构 :2- 甲基 -1,4 萘醌衍生物, 有 K1 K2 K3 三种,K1 K2 为天然产物,K3 为人工合成品 2) 性质 : 耐热 易受光线和碱破坏 (2) 生物化学功能及缺乏病 1) 功能 : 促进血液凝固 ( 主要作用 ) 2)VitK 缺乏 : 凝血时间延长, 皮下 肌肉 胃肠出血 三. 水溶性维生素 1 维生素 B 1 : 硫胺素 (Thiamine) (1) 化学结构及性质 1) 结构 : 由一含 S 的噻唑环和一含 NH2 的嘧啶环组成 2) 性质 : 白色 有特殊香气, 微苦, 溶于水, 耐热, 加碱破坏 (2) 生物化学功能及缺乏病 1) 功能 : 在肝中与焦磷酸 (PP) 结合形成 Thiamine pyrophosphate(tpp) 1TPP 是 - 酮酸脱氢酶系中的辅酶, 参与糖分解代谢中 - 酮酸的氧化脱羧 2 促进年幼动物的发育 3 保护神经系统 2) 缺乏症 : 1 丙酮酸 乳酸堆积, 神经肌肉兴奋性异常, 多发性神经炎 ( 脚气病 ), 中枢神经糖代谢失常 2 抑制胆碱酯酶, 胃肠蠕动缓慢, 消化不良 2 维生素 B 2 : 核黄素 (riboflavin) (1) 化学结构及性质 : 1) 结构 : 核糖醇与 6,7 二甲基异咯嗪的缩合物, 自然界多与蛋白质结合成黄素蛋白 2) 性质 : 橘黄色 针状晶体, 味苦, 微溶于水, 极易溶于碱性溶液, 对光和碱不稳定 (2) 生物化学功能及缺乏病 1) 功能 : 递氢辅酶, 参与生物氧化作用 FMN,flavin mononucleotide : 黄素单核苷酸 FAD,flavin adenine dinucleotide : 黄素腺嘌呤二核苷酸递氢过程 : 功能部位 :N1,N10;FMN(FAD)+2H FMN(FAD)H22) 缺乏症 : 眼角膜和口角血管增生, 引起白内障 眼角膜炎 舌炎和阴囊炎等 3 维生素 PP: 抗赖皮病维生素或维生素 B5 (1) 化学结构及性质

23 1) 结构 : 吡啶衍生物, 包括尼克酸 ( 烟酸 ) 和尼克酰胺 2) 性质 : 无色晶体, 性质稳定, 溶于水及酒精, 不被光 空气及热破坏 (2) 生物化学功能及缺乏病 1) 功能 : 1 不需氧脱氢酶的辅酶, 参与递氢 NAD+(nicotinamide adenine dinucleotide): 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸 NADP+(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate): 尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 递氢过程 : 功能部位 :N1,C4;NAD(P) + +2H NAD(P)H+H + 2 维持神经组织的健 康 3 促进微生物生长 4 尼克酸可使血管扩张, 使皮肤发赤发痒 大剂量尼克酸有降低血浆胆固醇和脂肪的作用 2) 缺乏症 : 对称性皮炎 ( 癞皮病 :pellagra) 消化道炎 神经损害与精神紊乱 4 维生素 B 6: 吡哆素 (1) 化学结构及性质 1) 结构 : 吡啶衍生物, 包括吡哆醇 吡哆醛 吡哆胺 2) 性质 : 吡哆素为无色晶体, 易溶于水及乙醇, 对光 碱敏感 ( 在酸液中稳定 ), 对热稳定 ( 吡哆醛和吡哆胺不耐高温 ) 2) 生物化学功能及缺乏病 1) 功能 : 氨基酸转氨酶 氨基酸脱羧酶和丝氨酸羟甲基转移酶的辅酶 磷酸吡哆醛 (pyridoxal phosphate) 和磷酸吡哆胺 2) 缺乏症 : 导致皮肤 中枢神经系统和造血机构的损害 5 维生素 B 3 : 泛酸 (1) 化学结构及性质 1) 结构 :β- 丙氨酸和 α,γ- 二羟 -β,β- 二甲基丁酸缩合物 2) 性质 : 淡黄色粘性油状物, 溶于水和醋酸, 不溶于氯仿和苯, 在中性溶液中对湿热 氧化和还原都稳定, 酸碱溶液中加热易破坏 (2) 生物化学功能及缺乏病 1) 功能 : 酰基转移酶的辅酶, 是酰基的载体 HSCoA 或 CoA: 辅酶 A 2) 缺乏症 : 大白鼠缺乏泛酸, 毛发边灰白, 并自行脱落, 毛与皮的色素形成可能与泛酸有关 食物中富含, 肠道细菌可合成, 缺乏病甚少 6 维生素 B7: 生物素 (bioton) (1) 化学结构及性质 : 1) 结构 : 为含硫维生素, 由尿素与硫戊烷环结合而成, 并有一个 C5 酸枝链 2) 性质 : 细长针状晶体, 熔点 232, 耐热和耐酸 碱, 微溶于水, 室温下稳定 (2) 生物化学功能及缺乏病

24 1) 功能 : 多种羧化酶的辅酶, 是羧基 (-COO - ) 的传递体, 在 CO2 固定反应中起 重要作用 2) 缺乏症 : 来源广泛, 肠道细菌可合成, 缺乏病甚少 7 维生素 B 11 : 叶酸 (folic acid) (1) 化学结构及性质 : 1) 结构 : 由蝶呤啶 对氨基苯甲酸与 L- 谷氨酸连接而成 2) 性质 : 鲜黄色物质, 微溶于水, 在水溶液中易被热 光破坏 (2) 生物化学功能及缺乏病 1) 功能 : 一碳单位转移酶辅酶 FH4 或 THFA:5,6,7,8- 四氢叶酸,N5 和 N10 位可与多种一碳单位结合 2) 缺乏症 : 巨红细胞性贫血症 8 维生素 B 12 : 钴胺素 (cyanocobalamine) (1) 化学结构及性质 1) 结构 : 含三价钴的多环系化合物, 经验式为 C63H88O14N14RCo 包括 CoB12 辅 酶 (5 脱氧腺苷钴胺素 ),CH3-B12( 甲基钴胺素 ),HO-B12 ( 羟钴胺素 ),CN-B12 ( 氰钴胺素 ) 2) 性质 : 深红色晶体, 熔点甚高, 溶于水 乙醇和丙酮, 不溶于氯仿 水溶液粉红色, 特定条件下稳定 (2) 生物化学功能及缺乏病 1) 功能 : 促进甲基转移作用 ; 促进某些化合物的异构作用 ; 维持 SH 的还原型状态 ; 促进核酸和蛋白质的生物合成 ; 维持造血机构的正常运转 ; 促进上皮组织细胞的新生 2) 缺乏症 : 1 儿童及幼龄动物发育不良 2 消化道上皮组织细胞失常 3 造血器官功能失常, 不能正常产生红血细胞, 导致恶性贫血 4 髓磷脂的生物合成减少, 引起神经系统的损害 9 维生素 C: 抗坏血酸 (ascorbic acid) (1) 化学结构及性质 1) 结构 :6C, 多羟 (-OH), 酸性化合物, 包括还原型抗坏血酸和氧化型抗坏血酸 2) 性质 : 无色晶体, 熔点 192, 味酸, 溶于水及乙醇, 不耐热, 易被光及空气氧化 (2) 生物化学功能及缺乏病 1) 功能 : 1 参与羟化反应 2 参与体内氧化还原反应 3 其它生化功能 : 降低血浆胆固醇 ; 防癌 2) 缺乏症 : 坏血病, 毛细血管易出血和齿 骨发育不全或退化

25 小结 / 习题 核酸化学 重点 : 核酸的结构与功能的关系核酸 : 生物有机体不可缺少的组成成分 ; 生命遗传信息的携带者和传递者 ( 一 ) 通论 一 核酸研究简史 1 核酸的发现 : 年, 瑞士 F.Miescher, 核素 (nuclein) 2 核酸的化学研究 : 年,E.Chargaff,Chargaff 法则 3 分子生物学的建立 :1953 年,J.D.Watson 和 F.H.C.Crick,DNA 双螺旋模型 4 DNA 重组技术 :1972 年,P.Berg 等,SV40DNA 与 λ 噬菌体 DNA 重组 5 后基因组时代 (Post-genome era): 年, 人类基因组计划 二 核酸的概念 种类 分布与功能 1 概念 : 细胞内产生的有重要生物活性的线性酸性多聚核苷酸 2 种类与分布 (1) 种类 : 1) 脱氧核糖核酸 (deoxyribonucleic acid-dna) 环状双链 DNA: 原核生物染色体 DNA, 细胞器 DNA 线性双链 DNA: 真核生物染色体 DNA( 末端为端粒 ) 病毒 DNA 有环状, 线性, 单链, 双链 2) 核糖核酸 (ribonucleic acid-rna): 转移 RNA(transfer RNA-tRNA) 信使 RNA(messenger RNA-mRNA) 核糖体 RNA (ribosomal RNA-rRNA) 小分子细胞核 RNA(snRNA) 染色质 RNA(chRNA) 反义 RNA(antisense RNA) 双链 RNA(dsRNA) 细胞质小 RNA(scRNA) 具有催化活性的 RNA(ribozyme) 各种病毒 RNA (2) 分布 : DNA: 真核生物细胞核 (95%) 线粒体 叶绿体 (5%); 原核生物核质区 ;DNA 病毒 RNA: 真核生物细胞质 (75%) 线粒体 叶绿体 (15%) 细胞核 (10%); 原核生物细胞质 ; RNA 病毒 3 生物功能 (1)DNA: 是主要的遗传物质 1)1944 年,O.T.Avery( 美 ) 肺炎链球菌的转化实验 2)1952, A.D.Hershey 和 M.Chase 噬菌体转导作用 3)1997 年, 英国罗斯林研究所克隆羊培育成功 (2)RNA: 1) 参与蛋白质的生物合成 ; rrna(75-80%),trna(10-15%),mrna(2-5%) 三者共同参与遗传信息的表达 2) 遗传物质 ; 3) 生物催化剂

26 ( 二 ) 核酸的结构一 核酸的化学结构 1 核酸的元素组成 : 基本元素 C H O N P,P 含量较恒定 (9%-10%), 定磷法定量核酸 2 核酸的分子组成 : 基本结构单元 : 核苷酸 含氮碱基 戊糖和磷酸三种分子组成 (1) 含 N 碱基 1) 基本碱基嘌呤碱基 : 腺嘌呤 (Adenine:A); 鸟嘌呤 (Guanine:G) 嘧啶碱基 : 尿嘧啶 (Uracil:U); 胞嘧啶 (Cytosine:C); 胸腺嘧啶 (Thymine: T) 碱基的结构特征 1 嘌呤环和嘧啶环均呈平面或接近于平面, 具有芳香环的结构特征 2 碱基的芳香环与环外基团可以发生酮式 烯醇式或胺式 亚胺式互变异构 2) 稀有碱基 : 基本碱基化学修饰, 含量甚少的碱基 种类多, 多为甲基化产物 如 :I m 5 C hm 5 C DHU 等 (2) 戊糖两种 :RNA 所含的戊糖为 β-d- 核糖 ;DNA 所含的戊糖为 β-d-2- 脱氧核糖 (3) 核苷 (nucleoside): 戊糖和碱基脱水缩合而成 嘌呤的 N9-H 与戊糖 C-1`-OH 以 N-C 糖苷键相连接嘧啶的 N1-H 与戊糖 C-1`-OH 以 N-C 糖苷键相连接 1) 基本核苷 : RNA 中核糖核苷 :S-A,S-G,S-C,S-U DNA 中脱氧核糖核苷 :ds A,dS G,dS C,dS-T 2) 稀有核苷 1 碱基化学修饰 ;2C C 糖苷键 ;3 核糖化学修饰 ( 少见 );4tRNA 中的胸腺嘧啶核糖核苷 (4) 核苷酸 (nucleotide): 核苷的磷酸酯, 由核苷的羟基与磷酸脱水缩合而成 1) 核苷酸种类 1DNA 或 RNA 中的核苷酸 :5 核苷酸 Ⅰ 基本核苷酸 RNA 中 5 - 磷酸 - 核糖核苷 :AMP,GMP,CMP,UMP DNA 中 5 - 磷酸 - 脱氧核糖核苷 :damp,dgmp,dcmp,dtmpⅡ 稀有核苷酸 2 其他核苷酸 Ⅰ 3` 核苷酸 Ⅱ 2` 核糖核苷酸 Ⅲ 单核苷酸磷酸化, 产生相应的核苷二磷酸和核苷三磷酸 : 高能化合物 Ⅳ 环化核苷酸例如 :camp(3', 5'- 环腺嘌呤核苷一磷酸 );cgmp(3', 5'- 环鸟嘌呤核苷一磷酸 ), 主要功能是作为细胞之间传递信息的信使 Ⅴ 辅酶核苷酸 NAD + NADP + FMN FAD CoA 等 : 核苷酸衍生物 2) 核苷酸的生物学作用 1 参与 DNA RNA 的合成 蛋白质的合成 糖与磷脂的合成 2 能量转化中起重要作用 :ATP 是生物体内能量的通用货币

27 3 参与细胞中的代谢与调节 :camp cgmp 4 构成多种辅酶的成分 :NAD NADP FAD FMN 和 CoA 3 核酸 : 多聚核苷酸 (1) 多聚核苷酸的特点 1) 核苷酸的连接方式 3', 5' 磷酸二酯键 2) 多聚核苷酸链具方向性 3) 每条线形多聚核苷酸链都有 : 5`- 末端 :5 - 磷酸末端 (5 -P) 此端的 C5 带有一个自由磷酸基 3` 末端 :3 - 羟基末端 (3 -OH) 此端 C3 带有自由羟基 4) 多聚核苷酸链的共价化学结构是核酸的一级结构 : 多聚核苷酸链中各核苷酸残基按一定的排列顺序以 3', 5' 磷酸二酯键相连而成共价结构 共价主链 : 磷酸 - 核糖 - 磷酸 - 核糖 - 磷酸 - 核糖 - 侧链 : 碱基排列顺序, 可表示核酸的一级结构一级结构的表示方法 :1 结构式表示法 ;2 线条式表示法 ;3 字母式表示法 ( 书与文献 ) 二 DNA 的结构 1 DNA 的一级结构 ( 化学结构 ) (1) 定义 : 分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序, 即四种碱基的排列顺序 (2) 碱基组成特点 : ,Chargaff 定则 1) 所有 DNA 中,A=T,G=C 即 A+G=T+C,6- 氨基 =6- 酮基 2)DNA 的碱基组成具有种的特异性, 没有组织和器官的特异性 (3) 一级结构与遗传信息 :DNA 分子量大 ( 最大可超过 10 8 bp) 可编码大量信息 生物遗传信息分布于细胞核内 DNA 核外质粒 叶绿体 线粒体等细胞器 DNA 1) 几个概念 : 基因 : 编码一个遗传信息的 DNA 片段基因组 : 细胞核内 DNA 的总称或染色体全部基因的总和 染色体外遗传因子 : 核外质粒 叶绿体 线粒体等细胞器 DNA 携带的基因 重叠基因 : 基因核苷酸序列重叠 重复序列 : 被重复的一段 DNA 顺序 基因家族 ( 超基因 :Super gene): 来源相同, 结构相似和功能相关的一些基因串联在一起, 中间夹杂一些重复序列 同基因 (isogene): 编码同工酶 (isoenzyme) 假基因 (pseudo gene): 与有功能的基因同源, 但并不产生有功能的基因产物的基因 不连续基因 ( 断裂基因,split gene): 基因中编码序列被不编码序列隔开 外显子 ( 外元 ): 基因中编码序列内含子 ( 内元或介入序列 ): 基因中不编码序列 自私 DNA(selfish DNA) 或寄生 DNA(parasite DNA): 哺乳动物 ( 包括人 ) 基因组中绝大部分非编码顺序, 都没有什么特殊功用, 似乎只是自身复制 2) 基因组特点原核生物 :

28 1 几乎无蛋白质与 DNA 结合 2 基因组比较小 3 具操纵子结构, 基因转录产物为多顺反子 4 重复序列少, 结构基因都是单拷贝,rRNA 基因为多拷贝 5 不编码的部份少 6 基因重叠 7 一个复制起始点, 复制子长度较长真核生物 : 1DNA 与蛋白质结合形成细胞核染色体, 多条 2 基因组比较大 3 基因转录产物为单顺反子 4 重复序列多 DNA 指纹 : 同一种属中不同个体的高度重复顺序的重复次数 5 基因以单拷贝和多拷贝两种型式存在 6 不编码的区域多 7 大部分基因是不连续基因 ( 断裂基因,split gene) 8 存在多基因家族 (multigene family) 超基因 (Super gene) 9 多复制起始点, 每个复制子长度较小 (4)DNA 一级结构的研究方法 : 1) 酶法 (Sanger 法 ):1977 年,Sanger 末端终止法原理 :1DNA 链的酶促聚合反应 模板链, 引物链, 底物 ( 四种 dntp), DNA 聚合酶 2 终止化合物 ddntp: 末端为 ddnmp 的 DNA 链步骤 :1 反应分四组 (dntp 标记 );2 每组加入相应一种 ddntp;3 每组产生一组长短不同的以该组 ddnmp 为 3 - 末端 (H)DNA 片段 ;4 凝胶电泳 5 放射自显影 6 读序 : 自下而上合成链 5-3 碱基顺序 ; 模板链顺序 2) 化学法 :1977 年,Maxam 和 Gilbert 步骤 : 1 特异化学试剂修饰特定碱基 2 哌啶切除碱基,DNA 链断裂成片段, 末端为特异碱基 3 变性胶电泳分离, 放射自显影得测序图谱 4 判断方法同 Sanger 终止法 2 DNA 的高级结构 : 核酸主干链及核苷酸的旋转形成构象 (1)DNA 的二级结构 :DNA 的双螺旋结构 特点 : 1 两条反向平行 DNA 链沿同一根轴盘绕, 形成右手双螺旋结构, 螺旋结构上有大沟和小沟 2 螺旋外侧磷酸和脱氧核糖基以 磷酸二酯键连接, 形成 DNA 分子的骨 架, 糖基环平面与螺旋轴平行 ; 螺旋内侧, 嘌呤与嘧啶碱基环平面与螺旋轴垂直, 3 双螺旋内部碱基严格配对 : 双螺旋的两条链互补 碱基互补 A 与 T 结合 ( 两个氢键 );G 与 C 结合 ( 三个氢键 ) 4 螺旋横截面的直径约 2nm, 每条链相邻两个碱基平面之间距离为 0.34nm, 夹角为 36, 每 10 个核苷酸形成一个螺旋, 其螺矩 ( 即螺旋旋转一圈 ) 高度为 3.4nm

29 DNA 双螺旋的稳定因素 : 氢键和碱基堆积力 ; 其他弱键 磷酸基团的负电荷与介质中的阳离子间形成的离子键及范德华力 DNA 双螺旋结构提出的生物学意义 :20 世纪最伟大的发现之一, 第一次阐述了遗传信息的储存方式及 DNA 复制的机理, 以准确的语言回答了 DNA 是如何成为遗传物质的, 大大推动了分子生物学和分子遗传学的发展 双螺旋的其他型式 :A C D E( 右 ),Z( 左 ),H(3 股 ) 等 B-DNA: 相对湿度为 92% 时的 DNA 钠盐 接近 DNA 在细胞中的构象 A-DNA: 相对湿度为 75% 以下时的 DNA 纤维 Z-DNA: 左手螺旋, 调控 (2)DNA 的三级结构 : 双螺旋 DNA 分子扭曲和折叠形成的特定构象, 包括不同二级结构单元间 单链与二级结构单元间的相互作用以及 DNA 的拓扑特征 超螺旋 DNA 双螺旋的螺旋, 是 DNA 三级结构的一种类型 环状 DNA 拓扑学特征 :L=T+W 1) 链环数 (Linking number): L, 双螺旋 DNA 中, 一条链以右手螺旋绕另一条链缠绕的次数 2) 扭转数 ( 缠绕数 :Twisting number): T,DNA 分子中 Watson-Crick 的螺旋数 3) 超螺旋数 (Writhing number): W 负超螺旋 : 超螺旋方向与 B-DNA 双螺旋方向 ( 右 ) 相反 ( 左 ) 正超螺旋 : 超螺旋方向与 B-DNA 双螺旋方向 ( 右 ) 相同 ( 右 ) 拓扑异构体 : 结构相同,L 值不同 拓扑异构酶催化转换 : 拓扑异构酶 Ⅰ:L 值增加 1, 消除一个负超螺旋拓扑异构酶 Ⅱ: 促旋酶,L 值减少 2, 松弛环状 DNA 变成负超螺旋 DNA DNA 负超螺旋在 DNA 复制 重组和转录等过程中易于解链 (3)DNA 与蛋白质复合物 核蛋白的结构 1) 病毒 : 病毒颗粒 ( 蛋白质外壳 ; 核酸 ; 脂质 糖类 ) 2) 细菌 : 拟核 ( 双链环状 DNA, 与碱性蛋白和少量 RNA 结合, 形成突环结构, 在细胞内紧密缠绕形成致密的小体 ) 3) 真核生物的染色体 :DNA 双链以左手螺旋缠绕组蛋白八聚体核心形成核小体 核小体链 ( 念珠状结构 ) 染色质丝 突环 玫瑰花结 螺线圈 组装成染色单体 三 RNA 的结构 RNA:DNA 片段转录生成, 比 DNA 分子小 RNA 一级结构 : 核糖核苷酸按一定排列顺序以 3-5 磷酸二酯键连接形成的共价结构 特点 :(1) 单链 ; (2) 不遵守碱基种类的数量比例关系, 即分子中的嘌呤碱基总数不一定等于嘧啶碱基的总数 ; (3)tRNA 中除了常见的碱基外, 还存在一些稀有碱基 RNA 的高级结构特点 : (1)RNA 单链分子部分区域形成双螺旋结构 臂 ( 类似 A-DNA 双螺旋结构 ); 不能形成双螺旋的部分 突环, 这种结构可以形象地称为 发夹型 结构或茎环结构

30 (2) 在 RNA 的双螺旋结构中, 碱基的配对情况不象 DNA 中严格 G 除了可以和 C 配对外, 也可以和 U 配对 G-U 配对形成的氢键较弱 (3)tRNA 中的稀有碱基大部分位于突环部分. (4) 不同类型的 RNA, 其二级结构有明显的差异 1 trna:10-15%, 携带相应的氨基酸转运到核糖核蛋白体 (1) 一级结构特点 : 1 分子量 左右, 大约由 个核苷酸组成, 沉降系数为 4S 左右 23 - 末端都具有 CpCpAOH 的结构 5 端多为 pg, 也有 pc 3 分子中含有较多的修饰成分, 稀有碱基比例 10% 左右 (2)tRNA 的二级结构 : 三叶草 形状, 一般为四臂四环 : 氨基酸接受臂 反密码 ( 环 ) 臂 二氢尿嘧啶 ( 环 ) 臂 T C( 环 ) 臂和可变环 1) 氨基酸接受区 : 包含 trna 的 3'- 末端和 5'- 末端,5-6bp;3'- 末端的最后 3 个核苷酸残基都是 CCAOH -AOH 可与氨基酸 -COOH 成酯 作用 : 在蛋白质合成中携带氨基酸 2) 反密码区 : 与氨基酸接受区相对, 一般环中含有 7 个核苷酸残基, 臂中含有 5 对碱基 反密码子 : 环正中的 3 个核苷酸残基, 识别 mrna 上的密码子 3) 二氢尿嘧啶区 : 含有二氢尿嘧啶 环由 8-12 个核苷酸组成, 臂由 3-4 对碱基组成 4)TψC 区 : 与二氢尿嘧啶区相对, 假尿嘧啶核苷 胸腺嘧啶核糖核苷环 (TψC) 由 7 个核苷酸组成, 几乎所有 tbna 在此环中都含有 TψC( 个别例外 ) TψC 臂 :5 对碱基组成的双螺旋区 5) 可变区 ( 额外环 ): 反密码区与 TψC 区之间. 不同的 trna 该区变化较大, 一般有 3-18 个核苷酸组成 (3)tRNA 的三级结构 : 三叶草型二级结构的基础上, 突环上未配对的碱基由于整个分子的扭曲而配成对, 为倒 L 字母型 2 mrna:5%, 直接阅读模板, 指导蛋白质的合成 (1) 一级结构的特点 : 真核 : 单顺反子 5'- 末端有 帽子 3'- 末端有 polya 片段和非编码区 原核 : 多顺反子 5'- 末端无 帽子 3'- 末端无 polya 片段 ( 病毒除外 ), 有非编码区 3'- 末端 PolyA: 极大多数真核细胞转录后 mrna 经 polya 聚合酶作用在 3 - 末端添加上一段长约 200 核苷酸的 polya 功能 : 与 mrna 从细胞核到细胞质的转移有关 ; 与 mrna 的半寿期有关 5'- 末端 帽子 结构 :5'- 末端的 G 被甲基化, 通过焦磷酸与另一个发生了核糖上甲基化的核苷酸以 5' 5'- 磷酸二酯键相连 功能 : 抗核酸酶的水解 ; 与蛋白质合成起始有关 ; 作为 mrna 与核糖体 40S 亚基结合的信号 3 rrna:80%, 是核糖核蛋白体的主要组成部分, 与蛋白质生物合成相关, 可分别与 mrna trna 作用, 催化肽键的形成 动物细胞核糖体 rrna 四类 :5SrRNA,5.8SrRNA,18SrRNA,28SrRNA

31 许多 rrna 的一级结构及由一级结构推导出来的二级结构都已阐明, 但是对许多 rrna 的功能迄今仍不十分清楚 rrna 的高级结构 : 数个 rrna 和数十种蛋白质聚合形成 核糖体作用 : 合成蛋白质的场所 ;23SrRNA 催化肽键形成 ( 三 ) 核酸的理化性质 1 核酸的一般物理性质 2 核酸的水解 (1) 核酸的酸解和碱解 :DNA 和 RNA 对酸和碱的耐受程度有很大差别 1) 酸易水解 N- 糖苷键 : 嘌呤碱基比嘧啶碱基易被水解下来, 脱氧核糖比核糖的糖苷键易被水解下来 酸对核酸的作用因酸的浓度 温度和作用时间不同而不同 2) 碱易水解磷酸酯键 :DNA 和 RNA 对碱的耐受程度有很大差别 RNA: 核糖基上 2 -OH 进攻磷酸基, 断开磷酯键的同时形成环状磷酸二酯 在碱的作用形成水解产物 (2) 核酸的酶解 1) 核酸酶分类 : 1 底物专一性 : DNA 水解酶 (DNases): 以 DNA 为底物 RNA 水解酶 (RNases): 以 RNA 为底物 2 作用部位 : 核酸外切酶 : 从多聚核苷酸链的一端 (3 - 端或 5 - 端 ) 开始, 逐个水解切除核苷酸 核酸内切酶 : 和外切酶相反, 从多聚核苷酸链中间开始, 在某个位点切断磷酸二酯键 ( 小球菌核酸酶即可外切又可内切 ) 3 作用键 : 水解 3`- 磷酸酯键酶 : 产物是 5`- 磷酸核苷水解 5`- 磷酸酯键酶 : 产物是 3`- 磷酸核苷 2) 核酸酶作用方式 : 1 水解 3`- 磷酸酯键 : 产物是 5`- 磷酸核苷 2 水解 5`- 磷酸酯键 : 产物是 3`- 磷酸核苷限制性核酸内切酶 (DNases): 特异性水解 DNA 分子双链中某些特定碱基顺序部位, 基因工程的工具酶 3 核酸的两性性质及等电点 核酸分子 : 磷酸基 ( 酸性基团 ); 碱基 ( 弱碱性基团 ) 核酸具有两性性质 等电点 pi: 核酸分子内的酸性解离和碱性解离相等, 本身所带的正电荷与负电荷相等时, 此时核酸溶液的 ph 值 等电点时核酸溶解度最小 核酸的等电点比较低 :DNA(4~4.5), RNA(2~2.5) 4 核酸的紫外吸收嘌呤碱和嘧啶碱具有共轭双键体系, 具有独特的紫外线吸收光谱, 一般在 260nm 左右有最大吸收峰, 可以作为核酸及其组分定性和定量测定的依据

32 纯度 :A260/A280 DNA(1.8 以上 );RNA(2.0) 5 核酸的变性, 复性与杂交 (1) 核酸的变性 (denaturation) 1) 概念 : 指核酸双螺旋区的氢键断裂, 变成单链结构的过程 2) 变性后表现 : 双螺旋结构解体 ;A260 值增加 增色效应 ; 粘度下降 ; 浮力 密度增大 ; 分子量不变 ; 失去其部分或全部的生物活性 3) 变性因素 : 温度升高 酸碱度改变 低离子强度 甲醛和尿素等 DNA 热变性 :DNA 的稀盐溶液加热到 时, 双螺旋结构解体, 两条链彼此分开, 形成无规线团 1DNA 的解链温度 (melting temperature,tm): 熔解温度或 DNA 的熔点,DNA 的变性达到 50% 时, 即增色效应达到一半时的温度 DNA 的 Tm 值 : 一般在 C 之间 2 与 T m 值有关的因素 : G 和 C 的含量高,Tm 值高 ;DNA 的均一性 ; 介质中离子强度等 (2) 核酸的复性 1) 概念 : 适当条件下, 变性 DNA 的两条彼此分开的单链重新缔合形成双螺旋结构, 这一过程称为复性 退火 (annealing): 热变性的 DNA 缓慢冷却时, 可以复性, 这一过程叫退火 复性温度 Ta=Tm-20 2) 复性过程 :1 正确的互补配对 核心 ( 慢 );2 迅速形成双螺旋 3)DNA 复性的程度 速率与复性过程的条件有关 1 分子量越大复性越难 2 浓度越大, 复性越容易 复性反应的速度用 Cot1/2 表示 Co 为变性 DNA 复性时的浓度,t 为时间, 以秒表示 3DNA 的复性与其本身的组成和结构有关 Cot1/2=1/K,K 与复杂性有关 4)DNA 复性后, 一系列物理 化学性质将得到恢复 (3) 核酸的杂交 (hybridization) 1) 概念 :DNA 单链与互补的异源 DNA 单链或 RNA 链形成双螺旋结构 杂交核酸分子 : 核酸杂交形成的新分子 2) 核酸杂交的应用 1Southern blotting(southern 印迹 ):DNA 杂交 2Northern blotting(northern 印迹 ):RNA 杂交 3Western blotting(western 印迹 ) 小结 / 习题

33 生物膜 (Biological membrane) 重点 : 了解生物膜的组成 ; 了解膜流动镶嵌模型的要点. ( 一 ) 概论 1 概念 : 将细胞或细胞器与环境分开的结构 2 分类 : 细胞膜 (Cytoplasmic membrane): 质膜 (Plasma membrane), 将细胞质与环境分开 细胞内膜 : 细胞器膜, 将细胞器基质与细胞质分开 3 功能 : (1) 为细胞的生命活动提供相对稳定的内环境, 介导细胞与细胞 细胞与基质之间的连接 ; (2) 物质运送与能量转换 ;(3) 细胞识别, 细胞免疫, 神经传导, 代谢调控, 参与形成细胞表面特化结构等 4 生物学意义 : 细胞结构的基本形式, 使各个细胞器和亚细胞结构既各自具有恒定 动态的内环境, 又相互联系 相互制约, 使整个细胞活动有条不紊 协调一致进行 ( 二 ) 生物膜的组成 一 膜脂 : 磷脂 糖脂和胆固醇 膜的基本骨架 1 磷脂 : 膜脂的基本成分, 约占整个膜脂的 50% 以上 (1) 甘油磷脂 : 膜中最丰富的脂结构 : 以甘油为骨架的磷脂类, 在骨架上结合两个脂肪酸链一个磷酸基团, 胆碱 乙醇胺 丝氨酸或肌醇等分子籍磷酸基团连接到脂分子上 主要类型 : 1 磷脂酰胆碱 phosphatidylcholine,pc, 旧称卵磷脂 2 磷脂酰丝氨酸 phosphatidylserine,ps 3 磷脂酰乙醇胺 phosphatidylethanolamine,pe, 旧称脑磷脂 4 磷脂酰肌醇 phosphatidylinositol,pi 5 双磷脂酰甘油 Diphosphatidylglycerol,DPG, 旧称心磷脂其中磷脂酰乙醇胺 磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸 3 种最主要 (2) 鞘磷脂 (sphingomyelin,sm): 在脑和神经细胞膜中特别丰富 结构 : 疏水尾部 ( 以鞘胺醇 (sphingoine) 为骨架, 结合一条脂肪酸链 ); 亲水头部 ( 磷脂酰胆碱 胆碱与磷酸结合 ) 2 糖脂 : 约占脂总量的 5% 以下, 在神经细胞膜上含量较高, 约占 5-10% 结构 : 含糖而不含磷酸的脂类, 结构与 SM 很相似, 由一个或多个糖残基与鞘氨醇的羟基结合 糖鞘脂 3 胆固醇 : 主要存在真核细胞膜上, 含量一般不超过膜脂的 1/3, 植物细胞膜中含量较少 结构 : 环形核 - 环戊烷多氢菲功能 : 提高双脂层的力学稳定性, 调节双脂层流动性, 降低水溶性物质的通透性

34 膜脂都是两性分子, 含有极性成分和非极性成分 磷脂和糖鞘脂在体内倾向于组装成一个脂双层 不能形成脂双层的胆固醇和其它脂 ( 大约占整个膜脂的 30%) 可以稳定地排列在其余 70% 脂组成的脂双层中 脂质体 (liposome): 人工膜, 磷脂在水中搅动后形成球形双层脂分子, 直径 25~1000nm 不等 二 膜蛋白 : 核基因组编码的蛋白质中 30% 左右为膜蛋白 膜功能的主要体现者 1 整合蛋白 (integral protein): 跨膜蛋白 (tansmembrane proteins), 两性分子, 与膜的结合非常紧密 跨膜结构域 :1 至多个疏水的 α 螺旋, 或由两性 β 折叠组成 2 外周蛋白 (peripheral protein): 与膜表面的蛋白质分子或脂分子的亲水部分离子键或其它较弱的键结合 3 脂锚定蛋白 (lipid-anchored protein): two types ( 三 ) 生物膜的结构 : 1 流动镶嵌模型 (Fluid-mosaic model) (1) 细胞膜由流动的双脂层和嵌在其中的蛋白质组成 (2) 磷脂分子以疏水性尾部相对, 极性头部朝向水相组成生物膜骨架 ; (3) 蛋白质或嵌在双脂层表面, 或嵌在其内部, 或横跨整个双脂层, 表现出分布的不对称性 2 生物膜的特性 :(1) 生物膜的流动性 : 膜脂和蛋白质分子运动 (2) 膜的不对称性 : 膜内外两层的组分和功能的差异 ( 四 ) 跨膜运输见普通生物学 ( 下 )