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累隆唐
7 years ago
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1 第十九章核酸的物理化学性质和常用的研究方法 1

2 核酸的物理化学性质天然 DNA 分子细丝状的双螺旋结构赋予 DNA 一系列显著的物化特性 : 极大的粘度 ; 易于断裂 ; 易形成纤维状物质 ; 在稀盐溶液中热变性 ; 熔点高 RNA 分子没有如此明显的物化特性 2

3 一核酸的紫外吸收 1 核酸具有紫外吸收吸收范围 : nm λ max = 260nm ( 定量测定 ) 2 根据紫外吸收判断样品纯度不纯的样品 DNA:A 260 /A 280 = 1.8;RNA:A 260 /A 280 = 2.0 纯的核酸分子或寡核苷酸 A =1 50μg/ml 双螺旋 DNA 40μg/ml 单链 DNA( 或 RNA) 20μg/ml 寡核苷酸 3

4 一核酸的紫外吸收 3 用摩尔磷消光系数 ε(p) 表示溶液中核酸的含量碱基和磷原子含量相等, 可以用 P 的含量来表示核酸的含量 ε(p) = A/CL = 30.98A/WL A: 光吸收值 C: 磷的摩尔浓度 L: 比色杯内径 W: 每升溶液中磷的重量 (g) 4

5 一核酸的紫外吸收 DNA 的 ε(p):6600 RNA 的 ε(p): 核酸的 ε(p) 比核苷酸单体低单链多核苷酸的 ε(p) 比双螺旋多核苷酸的 ε(p) 要高增色效应 : 核酸变性时, ε(p) 增加减色效应 : 当核酸复性时, ε(p) 降低 5

6 二核酸的沉降特性溶液中的核酸受到引力作用会下沉, 不同构象的分子沉降速度有很大差异超速离心 : 分离纯化核酸测定核酸的沉降系数相对分子量 6

7 二核酸的沉降特性密度梯度超离心分离 RNA 常用蔗糖梯度, 分离 DNA 常用 CsCl 梯度实验室纯化质粒 DNA: 染料 ( 溴乙锭 )-CsCl 密度梯度超离心, 得到的 DNA 纯度较高, 可用于 DNA 重组, 测序及限制酶图谱等 DNA 的密度与 G-C 含量成正比 7

8 三核酸的变性复性及杂交 ( 一 ) 变性 (denaturation) 1. 变性和降解稀盐溶液 DNA 的变性过程是双螺旋结构被破坏, 物化性质发生改变的过程 8

9 变性实质 : 氢键断裂, 双链解体成单链核酸的降解 : 多核苷酸骨架上共价键断裂, 因而引起核酸分子量的降低氢键的破坏导致变性, 共价键的破坏导致降解 9

10 三核酸的变性复性及杂交 4. DNA 的熔解温度 Tm(melting temperature) DNA 变性的特点 : 爆发式 DNA 的熔点 Tm 通过加热使 DNA 的双螺旋结构解旋 50% 时的温度 S 形曲线 -DNA 的变性曲线 DNA 的 Tm:

11 三核酸的变性复性及杂交影响 Tm 值的因素 ⅰ)DNA 的均一性 ⅱ)G-C 含量 ⅲ) 介质的离子强度低离子强度 : Tm 下降, 熔解温度范围宽高离子强度 : Tm 较高, 熔解温度范围窄 11

12 三核酸的变性复性及杂交 5 RNA 的变性特点 : Tm 较低, 变性曲线较宽 trna 的 Tm 较高双链 RNA 的变性与 DNA 相同 12

13 ( 二 ) 复性 (renaturation) 复性 : 在适当条件下, 变性 DNA 的两条链重新缔合成双螺旋结构的过程复性 : 物化性质和生物活性 DNA 复性的影响因素 1 降温速度退火 : 变性 DNA 缓慢冷却而复性的过程 2 DNA 片段的大小 3 DNA 的浓度 4 核苷酸顺序的复杂程度 13

14 三核酸的变性复性及杂交 ( 三 ) 核酸的杂交 (hybridization) 将异源 DNA 在同一体系中同时变性, 如果异源 DNA 彼此间有部分序列相同, 它们在复性时会形成杂交分子 DNA- DNA,DNA-RNA 介质 : 液相, 固相 ( 硝酸纤维素膜 ) 14

15 Southern Blotting E.M. Southern (1975) DNA 酶解电泳变性洗涤杂交烘烤转移放射自显影 15

16 四核酸的酸碱性质 1 酸碱性质核酸具有较强的酸性核酸可视为多元酸碱基稳定性氢键碱基解离状态溶液 ph 溶液的 ph 直接影响着双螺旋结构的稳定核酸是两性电解质, 在不同 ph 溶液中的解离程度不同两性解离导致兼性离子的形成, 所以核酸也有等电点 16

17 四核酸的酸碱性质 2 核酸的水解酸水解糖苷键和磷酸二酯键都可以被酸水解 : 糖苷键, 嘌呤碱基的糖苷键, 脱氧核糖, 脱氧核糖与嘌呤碱基形成的糖苷键最不稳定, 易于得到无嘌呤酸碱水解 RNA 在碱性条件下会产生 2 - 核苷酸和 3 - 核苷酸 17

18 酶水解磷酸二酯酶 : 非特异性水解磷酸二酯键的酶核酸酶 : 特异性水解核酸的磷酸二酯酶叫核糖核酸酶, 脱氧核糖核酸酶, 核酸内切酶, 核酸外切酶 ( 如 3 - 或 5 - 核苷酸酶 ) 非特异性的磷酸单酯酶对一切核苷酸都能作用 18

19 五核酸的分离与纯化 3 凝胶电泳简单, 快速, 分离效果好, 大小分子都适用凝胶电泳对核酸的分离作用主要依赖于它们的分子量及分子构型, 而凝胶的类型及其浓度对被分离核酸的分子大小关系重大 19

20 五核酸的分离与纯化琼脂糖凝胶电泳 (agarose gel electrophoresis) 琼脂糖浓度 : % 分离片段大小 : D 琼脂糖凝胶用于分析 DNA 较好, 分析 RNA 时易降解, 必须加入蛋白质变性剂聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE) 胶的浓度 : % 分离片段大小 : D PAGE 可分析小于 1000bp 的 DNA 和 RNA 20

21 五核酸的分离与纯化凝胶浓度与可分离的核酸片段分子量范围琼脂糖凝胶电泳胶浓度 % 分子量范围 PAGE

22 影响电泳迁移率的因素 1) 分子大小 : 迁移率与分子量对数成反比 2)DNA 的构象 : 超螺旋 > 线型 > 开环 DNA 3) 胶浓度 : 迁移率与胶浓度成反比 4) 电压或电流 : 在一定的电压范围内, 迁移率与电压或电流大小成正比 5) 碱基组成 : 有一定影响 6) 温度 :4-30, 常为室温 22

23 七聚合酶链反应 (PCR) PCR(polymerase chain reaction) 体外快速扩增 DNA 的一种生物技术, 是一种无细胞分子克隆法 K.Mullis, 1985: 合适的聚合酶可以实现 DNA 的体外扩增基本原理 : 与 DNA 在生物体内的复制相仿区别 : 无法模拟体内的复制叉替代 : 将 DNA 变性, 使双链分开底物 (dntp),dna 聚合酶, 模版, 引物 3 - OH: 单链 DNA 退火过程中杂交产生 23

24 七聚合酶链反应 (PCR) 特点 : 操作简便, 扩增效率高, 没有序列要求, 可用于扩增任意 DNA 片段基本步骤 1 设计合适的引物使目标 DNA 的扩增行之有效, 并最大限度地减少非特异产物引物设计的原则 1) 引物长度应大于 16 个核苷酸 2) 引物与靶序列间的 Tm 值 >55 24

25 七聚合酶链反应 (PCR) 3) 引物不应有发夹结构, 即不能有 4 bp 以上的回文序列 4) 引物之间不应有大于 4bp 以上的互补序列或同源序列 5) 引物中碱基的分布要尽可能均匀, G + C 含量接近 50% 25

26 七聚合酶链反应 (PCR) 2 优化反应条件包括模板引物 dntp DNA 聚合酶和 Mg 2+,PCR 中常用的聚合酶是 Taq DNA 聚合酶 3 选择热循环温度 PCR 过程的温度控制十分关键热循环温度 : 变性温度, 退火温度 ( 低于引物 Tm 值的 2-3 ), 延伸温度 26

27 七聚合酶链反应 (PCR) 4 检测扩增结果一般使用电泳的方法检测结果 PCR 技术非常灵敏, 甚至可以检测到单拷贝基因, 在临床医学检验法医学和刑侦鉴定以及分子生物学各项研究中应用极广缺点 : 灵敏度和准确性不能同时满足 27

28 八 DNA 测序早期的测序大部分从化学方法出发, 其中很多的概念和技术在 DNA 测序史上占有重要地位最早的测序方法简单, 只能测定较小的片段上世纪 70 年代 Maxam 和 Gilbert 发展了一种碱基顺序快速分析法, 不久,Sanger 利用全新的概念提出了一个新的测序方法 ( 酶法 ),DNA 的测序才真正成为可能 28

29 九 DNA 的限制酶图谱 1 修饰和限制现象微生物有修饰和限制现象, 这是细菌的自卫方式之一如 E.coli K 株繁殖出来的噬菌体入 (K) 只能感染 E.coli K 株, 而不感染 E.Coli B 株, 该现象称限制现象然而被限制的噬菌体群体中也可能有极少的幸存个体, 这些个体可以在受限制的菌株中繁衍子代此现象称修饰 29

30 九 DNA 的限制酶图谱细菌内有二种不同功能的酶 (Arber 等 ) : 限制性内切酶 : 识别并水解 DNA 的某特定碱基序列修饰酶 ( 甲基化酶 ): 识别限制酶识别的碱基顺序并将其甲基化被甲基化了的 DNA 不会被限制酶降解, 所以细菌自身的 DNA 不会被自身酶降解而当异源 DNA 侵入细胞时, 就会被限制酶降解 30

31 九 DNA 的限制酶图谱 2 限制性内切酶 restiction nucleise 发现 : 1968 年, 于大肠杆菌 (E. Coli K) 来源 : 主要在细菌和霉菌中特点 : 专一性非常强, 具有严格的碱基序列专一性, 能识别 DNA 的特定位点 31

32 九 DNA 的限制酶图谱 EcoR I, MW: E co R I 属名种名菌株编号该酶识别一个 6 bp 的序列 : 5 GAATTC 3 3 CTTAAG 5 HindⅢ (haemophilus influenzae) 是从流感噬血杆菌 d 株分离到的第三种内切酶 32

33 核苷酸的代谢和生物合成第十九章

34 核苷酸的代谢和生物合成核酸代谢与核苷酸的代谢密切相关, 细胞内存在多种游离核苷酸, 几乎参与细胞内所有生化过程核苷酸在代谢中的主要作用代谢调节物质能量代谢中通用的高能化合物生物合成的活性中间物衍生核苷酸 ATP, AMP 核酸生物合成前体 CoⅠ(Ⅱ) CoA FMN 等的组分 2

35 一核酸和核苷酸的分解代谢所有生物细胞都含有与核酸代谢有关的酶, 能够分解细胞内各种核酸 1 核苷酸的降解核酸核酸酶磷酸二酯酶核苷酸核苷酸酶磷酸单酯酶核苷 + 磷酸核苷磷酸化酶碱基 + 戊糖 -1- 磷酸核苷 + 水核苷水解酶碱基 + 戊糖只对核糖核苷有作用 3

36 一核酸和核苷酸的分解代谢 2 嘌呤碱的分解各种生物对嘌呤碱的分解能力不一样人和猿类 ( 鸟类, 某些爬虫类和昆虫 ): 以尿酸为嘌呤碱代谢的最终产物哺乳动物 ( 人猿除外 ): 尿囊素鱼类和两栖类动物 : 尿素 NH 3 和 CO 2 ( 低等生物 ) 4

37 一核酸和核苷酸的分解代谢嘌呤碱 A -NH 3 脱氨酶 I G -NH 3 脱氨酶 X 动物组织中腺嘌呤脱氨酶含量很少腺嘌呤的脱氨分解发生在核苷和核苷酸的水平上 5

38 一核酸和核苷酸的分解代谢 6

39 一核酸和核苷酸的分解代谢鸟嘌呤的脱氨分解 : 鸟嘌呤脱氨酶鸟嘌呤 + H 2 O 黄嘌呤 +NH 3 次黄嘌呤和黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的作用下氧化成尿酸次黄嘌呤 +O 2 + H 2 O 黄嘌呤 +O 2 + H 2 O 黄嘌呤氧化酶黄嘌呤氧化酶黄嘌呤 + H 2 O 2 尿酸 + H 2 O 2 7

40 一核酸和核苷酸的分解代谢痛风 : 由于体内嘌呤代谢紊乱引致尿酸过多 ( 血尿酸含量 > 7mg%) 药物 : 别嘌呤醇机理 : 抑制黄嘌呤氧化酶, 使得黄嘌呤和次黄嘌呤不能氧化成尿酸, 血尿酸含量降低 8

41 一核酸和核苷酸的分解代谢其它哺乳类动物以尿囊素作为嘌呤代谢的排泄物尿酸氧化酶尿酸 + 2H 2 O + O 2 尿囊素 + CO 2 + H 2 O 2 有些生物能够继续水解尿囊素生成尿囊酸或尿素作为终产物排出尿囊素 + H 2 O 尿囊酸 + H 2 O 尿囊素酶尿囊酸酶尿囊酸 2 尿素 + 乙醛酸 9

42 一核酸和核苷酸的分解代谢 10

43 二核苷酸的生物合成生物体合成嘌呤和嘧啶核苷酸的途径从头合成途径 (de novo) 补救途径 (salvage) 1 从头合成途径 : 从一些简单的非碱基前体物质合成核苷酸 11

44 二核苷酸的生物合成嘌呤核苷酸 ( 从 5- 磷酸核糖焦磷酸起始 ) 5-PRPP 五元环六元环 10 步次黄嘌呤核苷酸 A G 嘧啶核苷酸乳清酸 5-PRPP 乳清苷酸脱羧 UMP 其它嘧啶核苷酸 12

45 二核苷酸的生物合成 2 补救途径利用外源或降解产生的碱基和核苷合成核苷酸该途径更经济 Salvage 核糖核苷 de novo 磷酸核糖,CO 2,NH 3, 氨基酸碱基核糖核苷酸 RNA 脱氧核糖核苷脱氧核糖核苷酸 DNA 13

46 二核苷酸的生物合成 Ⅱ 嘌呤核苷酸合成的补救途径更便捷, 可以更经济地利用体内已有成分 1 第一条补救途径碱基 + 1- 磷酸核糖核苷 + ATP 核苷磷酸化酶核苷磷酸激酶核苷 + Pi 核苷酸 + ADP 生物体内只有腺苷激酶, 而缺乏其它的嘌呤核苷激酶 14

47 二核苷酸的生物合成 2 第二条补救途径腺嘌呤 + 5PRPP 次黄嘌呤 + 5PRPP 鸟嘌呤 + 5 PRPP 磷酸核糖转移酶磷酸核糖转移酶磷酸核糖转移酶腺嘌呤核苷酸 + PPi 次黄嘌呤核苷酸 + PPi 鸟嘌呤核苷酸 + PPi 体内存在的嘌呤核苷也可先分解成嘌呤碱基, 再通过上述途径形成核苷酸 15

48 二核苷酸的生物合成从头合成途径平衡补救途径嘌呤核苷酸抑制 (5- 磷酸核糖胺 ) 受阻先天缺乏磷酸核糖转移酶神经疾病症状尿酸积累 16

49 二核苷酸的生物合成 ( 二 ) 嘧啶核糖核苷酸的生物合成 1 从头合成途径 NH 3 + CO 2 + ATP + Asp 嘧啶环磷酸核糖乳清苷酸嘧啶环的元素来源尿嘧啶核苷酸其它嘧呤核苷酸 17

50 二核苷酸的生物合成 O O H 2 N CH C CH 2 CH 2 OH + 2ATP + HCO 3 - 氨甲酰磷酸合成酶 O NH 2 C O O - H 2 N P O - + 2ADP + Pi + O CH C CH 2 CH 2 OH C O NH 2 氨甲酰磷酸 C O OH 酶 : 氨甲酰磷酸合成酶 (carbamyl phosphate synthetase) 18

51 1) 尿嘧啶核苷酸的合成 19

52 二核苷酸的生物合成第一步尿苷酸的酶促合成共有 5 步反应氨甲酰磷酸将氨甲酰基转移给 Asp 形成氨甲酰天冬氨酸 O H 2 N OPO H 2 N O CH C CH 2 C O OH 转氨甲酰酶 H 2 N O C H N O CH C CH 2 C O OH + Pi OH OH 酶 : 天冬氨酸转氨甲酰酶 (aspartate carbamyl transferase) 20

53 二核苷酸的生物合成第二步氨甲酰天冬氨酸环化生成二氢乳清酸 O O O H NH 2 C N CH C OH 二氢乳清酸酶 NH CH 2 C OH O HOOC N H O + H 2 O 酶 : 二氢乳清酸酶 (dihydroorotase) 此反应可逆 21

54 二核苷酸的生物合成第三步二氢乳清酸氧化生成乳清酸 O O NH 二氢乳清酸脱氢酶 NH HOOC N H O NAD + HOOC N H O 氧化作用酶 : 二氢乳清酸脱氢酶 (dihydroorotate dehydrogenase) 该酶是个含铁的黄素酶 22

55 第四步 HOOC 二核苷酸的生物合成乳清酸与 5- 磷酸核糖焦磷酸作用生成乳清苷酸, 此反应可逆 O N H NH O + 2- O 3 PO OH O PPi OH 乳清苷酸焦磷酸化酶 2- HOOC O 3 PO O 酶 : 乳清苷酸焦磷酸化酶 (orotidylic acid phosphorylase) PPi OH O N OH NH O Mg 2+ 可以活化该反应 23

56 二核苷酸的生物合成第五步乳清苷酸脱羧形成尿嘧啶核苷酸 O O NH NH 2- O 3 PO HOOC O N O 乳清苷酸脱羧酶 -CO 2 2- O 3 PO O N O OH OH OH OH 酶 : 乳清苷酸脱羧酶 (orotidylic acid decarboxylase) 24

57 二核苷酸的生物合成 2) 胞嘧啶核苷酸的合成尿苷酸转变为胞苷酸是在尿苷三磷酸的水平上进行的尿嘧啶尿苷尿苷酸氨基化氨基化氨基化胞嘧啶胞嘧啶核苷胞嘧啶核苷酸 UTP CTP 25

58 二核苷酸的生物合成 UMP + ATP UDP + ATP 尿嘧啶核苷酸激酶核苷二磷酸激酶 UDP + ADP UTP + ADP 动物组织中由 UTP 转变成 CTP 需要的氨基由 Gln 提供,ATP 供能 UTP + Gln + ATP + H 2 O CTP 合成酶 CTP + Glu + ADP + Pi 26

59 二核苷酸的生物合成 2 补救途径尿嘧啶转变成尿嘧啶核苷酸有两种方式 1) 由磷酸核糖转移酶催化直接由碱基形成尿嘧啶 + 5-PRPP UMP 磷酸核糖转移酶尿嘧啶核苷酸 + PPi 胞嘧啶 + 5-PRPP 胞嘧啶核苷酸 + PPi 27

60 二核苷酸的生物合成 2) 尿嘧啶与 1- 磷酸核糖反应尿嘧啶 +1- 磷酸核糖尿苷尿苷磷酸化酶尿苷激酶尿苷尿苷酸尿苷激酶能催化胞苷的磷酸化胞嘧啶核苷 +ATP 尿苷激酶胞苷酸 + ADP 28

61 二核苷酸的生物合成 ( 三 ) 脱氧核糖核苷酸的合成核糖核苷酸的还原 NDP (A G C U) dndp (da dg dc du) 核苷一磷酸与核苷二磷酸的互变 ATP + AMP AMP 激酶 ADP + ADP 29

62 二核苷酸的生物合成核苷二磷酸与核苷三磷酸的互变 XDP + YTP 核苷二磷酸激酶 XTP + YDP X Y: 不同的核糖核苷 ( 或脱氧核糖核苷 ) 酶 : 核苷二磷酸激酶 30

63 二核苷酸的生物合成胸腺嘧啶核苷酸 (dtmp) 的合成由 dump 甲基化得到胸苷酸 dump 可以由尿嘧啶核苷二磷酸 UDP 还原, 再通过尿嘧啶脱氧核苷三磷酸酶转变成 dump dutpase 胸苷酸合酶 UDP dudp dutp dump dtmp CDP 核糖核苷酸还原酶 dcdp 核苷磷酸激酶 dctp 31

64 二核苷酸的生物合成 32

生物化学习题（答案不太全）

生物化学习题（答案不太全） 1 2 1 2 3 4 5 6 7 8 a- b- 9 10 11 R 12 13 NH2 COOH 14 N- C- 15 16 17 18 1. 2. 3. 4.a- 1 A B C D E 1( ) A B C D E 2 ( ) A B C D E 3 ( ) A B C ADP D 1 3 E 4 ( ) A IMP B AMP C GMP D XMP E ATP 5 SCOA ( ) A