前言 蛋白质由多种不同的包含弱酸性 ( 羧基 ) 和弱碱性 ( 氨基 ) 基团的氨基酸组成 因此, 蛋白质是种两性分子, 在特定 ph 值范围内大多以两性离子形式存在 在 某一 ph 值下, 蛋白质所带净电荷为零, 且不与任何带电介质相互作用, 此时的 ph 值即为等电点 (pi) 在离子交换色谱

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1 使用安捷伦缓冲液顾问软件优化阳离子交换色谱法的蛋白质分离使用 gilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统进行蛋白质分离 技术概述 作者 Sonja Schneider Jochen Strassner 安捷伦科技公司德国瓦尔德布隆 mu RNse Pi 9.6 Pi Pi 摘要 本技术概述说明了将安捷伦缓冲液顾问 (uffer dvisor) 软件与 gilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统联用, 是利用离子强度梯度进行自动化蛋白质分离的理想解决方案 通常, 利用预先混合的二元梯度进行 ph 筛选既浪费时间又增加了工作强度 而使用由缓冲液顾问软件计算得到的动态混合四元梯度时, 可以缩短并简化 ph 筛选过程 此外, 使用缓冲液顾问软件计算得到的梯度还可获得卓越的保留时间精度和 ph 一致性

2 前言 蛋白质由多种不同的包含弱酸性 ( 羧基 ) 和弱碱性 ( 氨基 ) 基团的氨基酸组成 因此, 蛋白质是种两性分子, 在特定 ph 值范围内大多以两性离子形式存在 在 某一 ph 值下, 蛋白质所带净电荷为零, 且不与任何带电介质相互作用, 此时的 ph 值即为等电点 (pi) 在离子交换色谱 (IEX) 中, 可利用蛋白质表面净电荷和 ph 值间的独特关系实现蛋白质分离的优化 在分析过程中,pH 值将确定蛋白质 所带的电荷数, 并有助于缓冲液中的蛋白 质保持其自然结构 要利用预先混合的二元梯度进行 ph 筛 选, 应准备多瓶缓冲液 例如, 为了测试 6 种不同的 ph 值, 需要准备 12 瓶预先混合的缓冲液 相反, 如果使用动态混合的 四元梯度, 只需准备 4 瓶缓冲液即可获得 多种 ph 值 此外动态混合缓冲液可免除 人工滴定缓冲溶液的步骤, 该步骤通常很 耗时且容易引入误差 应用动态混合的四 元梯度可简化方法开发过程, 并且由于只 需提供四瓶储备溶液, 可大大缩短缓冲液 制备时间 : 管路 : 水 管路 : 盐溶液 管路 : 酸性缓冲组分 管路 D: 碱性缓冲组分 通过使用这四种储备溶液, 可制备不同 ph 值和盐浓度的不同缓冲液 缓冲液顾问软件可帮助您计算储备溶液的百分比, 以获得所需的 ph 值 缓冲液浓度和离子 强度 ( 图 1) 为了确保目标蛋白质与 IEX 色谱柱最优的 Na 2 HPO 4 NaH 2 PO 4 结合及洗脱特性, 所用缓冲液的 ph 值和 离子强度是非常重要的因素 即使这两个 参数出现很小的变化也会影响分离效果 因此, 当使用离子强度梯度时,pH 筛选 是一种寻找最优分离条件的重要方法 与 ph 梯度相反的是, 离子强度梯度的 ph 值将保持恒定 通过增加流动相的离子强 度 ( 盐浓度 ), 弱结合能力的蛋白质先于 强结合能力的蛋白质被洗脱出来 一般来说, 用于分析的预混合二元梯度包 括弱离子强度的起始缓冲液和强离子强度 的洗脱缓冲液 这包括下列制备步骤 : 溶解适量缓冲液化合物至指定的浓度 利用酸 / 碱滴定调节至流动相的 ph 值 分装缓冲液, 并向其中一份缓冲液中加 入盐 ( 洗脱缓冲液 ) 必要时利用酸 / 碱滴定调节至洗脱缓冲 液的 ph 值 ph 图 1 四元混合以产生具有恒定 ph 值的盐梯度 % % Nal Result Pump Gradient Timetable Time % % % %D Init. ph alc. ph IS ond. Status OK OK OK OK OK (min) (mm) ph ph 2

3 缓冲液顾问软件将生成一个时间表, 可通 过 gilent OpenL DS 化学工作站软 件中的导入溶剂混合文件 (Import Solvent lending File) 功能导入到 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱泵方法中 ( 图 2) 图 2 生成的时间表可由 gilent OpenL DS 化学工作站软件导入 gilent 1260 Infinity 生物惰性液相色谱系统的方法中 3

4 缓冲液顾问软件可应用于阴离子或阳离子交换色谱法中的离子强度或 ph 梯度控制 该软件可为单缓冲液 ( 离子强度梯度 ) 或复合缓冲液 (ph 梯度 ) 应用提供多种可供选择的不同缓冲液 用户可根据目标蛋白质和所使用的色谱柱为阴离子或阳离子交换选择缓冲液 ( 图 3) 为了确 保最优的缓冲容量, 列出了缓冲液应使用 的推荐 ph 范围和浓度 在使用离子强度梯度的离子交换色谱法 中, 一个常见的问题是加入中性盐 ( 例如 Nal) 会导致 ph 值降低 1,2 缓冲液顾问软件将重新计算整体流动相成分中用于维 持所需的恒定 ph 值的酸性和碱性缓冲液 的浓度, 以解决这个问题 此外, 如果 ph 偏移过大, 缓冲液顾问软件会在泵时间表中自动插入额外的时间点 图 3 用于阳离子交换色谱的缓冲液列表, 根据推荐的 ph 值范围排序 4

5 实验部分 仪器 gilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统, 包括以下模块 : gilent 1260 Infinity 生物惰性四元泵 (G5611) gilent 1260 Infinity 高效生物惰性自 动进样器 (G5667) gilent 1290 Infinity 自动进样器恒温 器 (G1330) gilent 1290 Infinity 柱温箱 (G1316), 配置生物惰性溶剂热交换器 gilent 1260 Infinity 二极管阵列检测 器 VL(G1315D, 配置生物惰性标准流通 池,10 mm) gilent 1260 Infinity 生物惰性分析型馏 分收集器 (G5664) 色谱柱 gilent io Mb 色谱柱,PEEK, mm,5 µm 软件 gilent OpenL DS hemstation, L 和 L/MS 系统版, 修订版 [32] 安捷伦缓冲液顾问软件, 修订版 溶剂 缓冲液 : H 2 O 样品 三种蛋白质混合物, 溶于 PS( 磷酸盐缓 冲盐水 ),ph 7.4 核糖核酸酶 : Da pi 9.6 细胞色素 : Da pi 溶菌酶 : Da pi 所有试剂均为 L 级 新制超纯水产自 配置 0.22 µm 膜式终端过滤器 (Millipak) 的 Milli-Q Integral 水纯化系统 MES (2-(N- 吗啉 ) 乙磺酸一水合物 ) 及 MES-Na (2-(N- 吗啉 ) 乙磺酸钠盐 ) 购自默克公司 ( 德国达姆斯塔特 ) Nal 购自 VWR 公司 ( 美国宾夕法尼亚州拉德诺 ) 色谱条件 流速 : 1 ml/min 梯度 : 0 min 20 mm Nal 5 min 20 mm Nal 30 min 500 mm Nal 35 min 1000 mm Nal 36 min 20 mm Nal 进样量 : 10 µl 控温器 : 4 温度 T: 25 DD: 280 nm/4 nm 参比波长 : 关闭峰宽 : 峰宽 :> 0.05 min(1.0 s 响应时间 )(5 Hz) 结果与讨论 使用安捷伦缓冲液顾问软件对 ph 值 5.8 至 6.8 之间的计算结果进行 ph 筛选 采用 6 种不同 ph 值下的四元盐梯度进行三种蛋白质混合物 ( 核糖核酸酶 细胞色素 及溶菌酶 ) 的分离 动态混合的四元梯度由软件的计算结果生成 缓冲液顾问软件通过计算指定时间点下流动相中每种储备溶液的百分比, 可简化不同四元梯度的生成过程 ( 图 4) 1. 首先确定梯度参数, 例如时间 最大盐浓度 ph 值, 以及缓冲液浓度 2. 缓冲液顾问软件将计算所需的储备溶液浓度 按下 Recipe 按钮后, 软件将显示制备储备溶液所需化学品的精确质量 ( 图 5) 用户可调整这些建议的储备溶液浓度 3. 选择 Process 标签 4. 缓冲液顾问软件将计算每个通道所需的量以便在整个色谱方法运行过程中维持正确的 ph 值 此外, 它还将计算所输入的 ph 值 盐浓度和缓冲液浓度是否适合所选的缓冲体系 时间表中还列出了一些附加数据, 例如流动相的缓冲容量 缓冲液 : Nal 3 M 缓冲液 : MES(2-(N- 吗啉 ) 乙磺酸一水 合物 )60 mm 缓冲液 D: MES-Na(2-(N- 吗啉 ) 乙磺酸钠 盐 )35 mm 5

6 图 4 安捷伦缓冲液顾问软件, 显示了 结果与讨论 中所描述的步骤 图 5 储备溶液配方 6

7 对核糖核酸酶 () 细胞色素 () 和 溶菌酶 () 这三种蛋白质混合物的 ph 筛 选结果证实了安捷伦缓冲液顾问软件的优 势 ( 图 6) 从此图中我们可以看出, 即 使 ph 值发生很小的变化 ( 例如 0.2), 也 会显著影响蛋白质在弱阳离子交换 (WX) 色谱柱上的保留性 当 ph 值从 5.8 变为 6.8 时, 洗脱顺序发生明显变化 在这些实验中, 选择 ph 5.8 条件对保留时间精确度和 ph 一致性进行进一步分析 使用动态混合的四元梯度时, 所有三种蛋白质的保留时间 RSD 均小于 0.11% 图 7 显示了在没有色谱柱的情况下, 通过离线测定所收集的组分得出的动态混合四元梯度的 ph 值 在一次完整的运行后,pH 值依然能恒定保持为 5.8 人工制备预混合二元梯度的相应缓冲液包 括多个步骤 对每种 ph 值及每个准备好 的试剂瓶 ( 一个为低离子强度, 另一个为 高离子强度 ), 都需要对缓冲液进行人工 滴定 为了获得最佳分离度, 对 6 种不同 ph 值进行 ph 筛选时需准备 12 个溶剂瓶 ( 包括化学品称量,pH 值调节 ) 这是一 mu ph 5.8 ph 6 ph 6.2 ph 6.4 ph 6.6 ph 6.8 个非常耗时的过程, 而且非常容易出现误 差和变异 相反, 安捷伦缓冲液顾问软件可以自动 地 可重现地利用四种储备溶液混合得到 所有六种分离条件, 无需任何人工干预 在 ph 5.8 下实现了最佳分离效果 ( 图 6) min 根据这些结果, 用户对如何进行操作可有 多种选择 : 图 6 利用动态混合四元梯度进行三种蛋白质混合物分离的 ph 筛选 1. 微调所得的 ph 值和梯度 2. 通过 OpenL DS 化学工作站软件的时间表将动态混合四元梯度转移至其它 仪器 3. 使用预先混合的缓冲液, 在二元梯度中实施 ph 值筛选结果 但是在最后一种情况下, 由于缓冲液顾问 软件中具有 ph 值优化程序, 预计会在正 确 ph 值处发生偏移 ph (min) 图 7 离线 ph 值测定结果 7

8 结论 使用由缓冲液顾问软件计算得到的动态混 合四元梯度时, 可以缩短并简化 ph 筛选 过程 利用缓冲液顾问软件计算得到的动 态混合四元梯度, 可显著减少缓冲液制备 时间, 尤其是与人工制备的预混合二元梯 度缓冲液相比 缓冲液顾问软件为阴离 子和阳离子交换色谱提供了众多的预先验 证 用户可选的缓冲系统, 并提供了制 备最适合的储备溶液所需的配方 软件会 对 ph 值加以优化, 令得出的 ph 值比通 过人工制备的缓冲液所形成预混合梯度的 ph 值更为准确和精确 缓冲液顾问软件将重新计算四元梯度中用于维持所需的恒 定 ph 值的酸性和碱性缓冲液的浓度, 以 解决这个问题 参考文献 1. R. J.. rown & M. J. T. Milton. Observation of a combined dilution and salting effect in buffers under conditions of high dilution and high ionic strength, ccred Qual ssur 8(11): , E. Voinescu et al. Similarity of Salt Influences on the ph of uffers, Polyelectrolytes, and Proteins, J. Phys. hem. 110: , 将缓冲液顾问软件与 gilent 1260 Infinity 生物惰性四元液相色谱系统联用, 是生成 四元梯度的卓越方法 借助缓冲液顾问软 件的计算结果可实现精确 可重现的蛋白 质分析, 是进行自动化 ph 筛选和准确离 子交换色谱分析的优秀工具软件 因此, 缓冲液顾问软件是离子交换色谱中分析方 法自动化开发的理想工具, 可无缝转移至 相关的 Q/Q 部门 bio-inert 安捷伦科技 ( 中国 ) 有限公司, 年 7 月 1 日, 中国出版 HN

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