746 ISSN (print) ISSN (online) 世界华人消化杂志 213 年 3 月 28 日第 21 卷第 9 期研发前沿本研究采用血清药理学方法, 运用 MTT 法流式细胞仪实时荧光定量 PCR 免疫印迹法免疫印光染色法, 从基因转录和蛋白

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懿石
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1 世界华人消化杂志 213 年 3 月 28 日 ; 21(9): ISSN (print) ISSN (online) 基础研究 BASIC RESEARCH 健脾清热活血方介导 Wnt/β-catenin 通路对人结肠 SW48 细胞的影响张保静, 张涛, 陈远能, 王小平, 潘怀耿张保静, 张涛, 陈远能, 广西中医药大学附属瑞康医院消化内科广西壮族自治区南宁市 5311 王小平, 江西中医药高等专科学校江西省抚州市 3447 潘怀耿, 广州中医药大学广东省广州市 5145 张保静, 在读硕士, 主要从事消化系疾病的研究. 国家自然基金资助项目, No ; No 广西卫生厅重点基金资助项目, No 作者贡献分布 : 张保静与张涛对此文所做贡献均等 ; 张涛为课题总负责人 ; 本课题由张涛陈远能王小平及张保静设计 ; 文献检索实验过程及数据分析由张保静与潘怀耿完成 ; 研究所用试剂与工具由张涛与陈远能提供 ; 论文撰写由张保静完成. 通讯作者 : 张涛, 副教授, 5311, 广西壮族自治区南宁市华东路 1 号, 广西中医药大学附属瑞康医院消化内科. zhangxuan271@yahoo.com 收稿日期 : 修回日期 : 接受日期 : 在线出版日期 : Treatment with Jian-pi-qing-rehuo-xue detection regulates SW48 cell apoptosis by altering Wnt/β-catenin expression Bao-Jing Zhang, Tao Zhang, Yuan-Neng Chen, Xiao-Ping Wang, Huai-Geng Pan Bao-Jing Zhang, Tao Zhang, Yuan-Neng Chen, Department of the Gastroenterology, the Ruikang Hospital Affiliated Guangxi University of TCM, Nanning 5311, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China Xiao-Ping Wang, the Jiangxi TCM College, Fuzhou 3447, Jiangxi Province, China Huai-Geng Pan, Guangzhou University of TCM, Guangzhou 5145, Guangdong Province, China Supported by: National Natural Fund, No ; No ; Key Project of Health Department of Guangxi, No Correspondence to: Tao Zhang, Associate Professor, Department of the Gastroenterology, the Ruikang Hospital Affiliated Guangxi University of TCM, 1 Huadong Road, Nanning 5311, Guangxi Zhuang Autonomous Region, China. zhangxuan271@yahoo.com. Received: Revised: Accepted: Published online: Abstract AIM: To investigate the effect of treatment with Jian-pi-qing-re-huo-xue decoction on SW48 cell proliferation and apoptosis and the expression of β-catenin, TCF-4, c-myc and cyclin D1. METHODS: SW48 cells were divided into a blank group, an intervention group and a control group, which were incubated with fetal calf serum, different concentrations of serum containing Jian-pi-qing-re-huo-xue decoction, or serum containing mesalamine for 24 h, respectively. The proliferation and apoptosis of SW48 cells were detected by MMT assay and flow cytometry, respectively. The mrna and protein expression of β-catenin, TCF-4, c-myc, and cyclin D1 was assayed by real-time PCR and Western blot. RESULTS: Compared to the blank group, the survival of SW48 cells was reduced in the intervention group (P <.5). When the dilution concentration of Jian-pi-qing-re-huo-xue decoction was 5%, 1%, 15%, 2% and 3%, the reduced rate of cell growth was 28%, 44.58%, 65.86%, 57.86% and 49.89%, respectively. However, this inhibitory effect was not concentration-dependent (P >.5). Intervention with Jian-pi-qingre-huo-xue decoction significantly increased the percentage of cells at S phase and decreased that of cells at G 1 in a concentration-dependent manner compared to the control group (both P <.5). β-catenin was more abundantly expressed in the nucleus in the blank group. In the intervention group, the ectopic expression of β-catenin in the cytoplasm and nucleus declined, and membrane expression increased (P <.5). Treatment with Jian-pi-qing-re-huo-xue decoction induced cell apoptosis and down-regulated the expression of β-catenin, TCF-4, c-myc, and cyclin D1 compared to the blank group (P <.1), and the effect was more significant when middle concentration of serum containing the decoction was used. CONCLUSION: Jian-pi-qing-re-huo-xue decoction exerts a distinct preventive and therapeutic effect on colon cancer possibly by altering the expression of Wnt/β-catenin, affecting G 1 cell cycle progression and inducing cell apoptosis. 213 Baishideng. All rights reserved. 背景资料溃疡性结肠炎与结肠癌之间存在因果关系已得到消化界公认, Wnt 通路调控 β-catenin 磷酸化 (P-β-catenin) β-catenin 核内异常转录在介导溃疡性结肠炎相关癌变的 (UCAC) 发生发展中具有重要的作用. 健脾清热活血类方药在促进结肠上皮细胞修复及杯状细胞分泌保护因子, 加快肠道黏膜重建, 促进溃疡修复和抑制 NF-κB 活性及调节机体免疫方面显示了较好的效果, 但其对 Wnt/β-catenin 信号通路的影响尚未报道. 同行评议者牛英才, 研究员, 齐齐哈尔医学院医药科学研究所 Volume 21 Issue 9

2 746 ISSN (print) ISSN (online) 世界华人消化杂志 213 年 3 月 28 日第 21 卷第 9 期研发前沿本研究采用血清药理学方法, 运用 MTT 法流式细胞仪实时荧光定量 PCR 免疫印迹法免疫印光染色法, 从基因转录和蛋白水平分析健脾清热活血方药对人结肠癌 SW48 细胞 Wnt/β-catenin- TCF-4 通路的影响, 阐明复方中药的作用机制. Key Words: Jian-pi-qing-re-huo-xue decoction; β-catenin; TCF-4; C-myc; CyclinD1; Wnt/β-catenin; Apoptosis Zhang BJ, Zhang T, Chen YN, Wang XP, Pan HG. Treatment with Jian-pi-qing-re-huo-xue detection regulates SW48 cell apoptosis by altering Wnt/β-catenin expression. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 213; 21(9): wjgnet.com/19-379/21/745.asp DOI: org/ /wcjd.v21.i9.745 摘要目的 : 观察人结肠癌细胞 S W48 增殖凋亡及 β-catenin T 细胞因子 4(T cell factor 4, TCF-4) C-myc CyclinD1 表达变化, 探讨健脾清热活血方防治结肠癌的可能机制. 方法 : 将 SW48 细胞分为空白组治疗组对照组 ; 采用血清药理学方法, 空白组给予胎牛血清 ; 治疗组分别给予等比稀释不同浓度含药血清 ; 对照组给予美沙拉嗪含药血清干预体外培养的结肠癌细胞 SW48(24 h), 应用 M T T 法检测细胞增殖, 流式细胞仪分析细胞凋亡率细胞周期, 免疫荧光染色分析细胞 β-catenin 蛋白表达, Western blot 及荧光定量 PCR 检测 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 蛋白及 mrna 表达. 结果 : 与空白组比较, 治疗组 SW48 细胞存活率明显下降 (P <.5), 稀释浓度为 5% 1% 15% 2% 3% 的不同剂量组细胞生长抑制率分别为 28.% 44.58% 65.86% 57.86% 49.89%, 但与药物浓度没有剂量依赖性 (P >.5); 与对照组比较, 治疗组 S 期细胞增多 G 1 期细胞减少, 且与药物浓度有剂量依赖性 (P <.5); 空白组 β-catenin 表达以核内表达为主, 治疗组 β-catenin 胞质 / 核异位表达下降 (P <.5), 以胞膜表达为主 ; 与空白组比较, 治疗组可明显下调 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 蛋白及 mrna 表达并促进细胞凋亡 (P <.1), 以中剂量更为明显. 结论 : 健脾清热活血方可能通过介导 W n t/ β-catenin 通路, 干预 SW48 细胞 G 1 期, 诱导细胞凋亡, 发挥防治结肠癌的效应. 213 年版权归 Baishideng 所有. 关键词 : 健脾清热活血中药 ; β-catenin; T 细胞因子 4; C-myc; CyclinD1; Wnt/β-catenin; 凋亡张保静, 张涛, 陈远能, 王小平, 潘怀耿. 健脾清热活血方介导 W n t/β-c a t e n i n 通路对人结肠 S W48 细胞的影响. 世界华人消化杂志 213; 21(9): h t t p : / / w w w. wjgnet.com/19-379/21/745.asp DOI: org/ /wcjd.v21.i9.745 引言结肠癌与炎症密切相关, 8% 结肠癌缺乏基因易感的依据, 28 年分别发表在 Nature Carcinogenesis 等杂志的研究文章也清楚表明 : 炎症已成为致癌的第 7 大致癌因素 [1,2]. 溃疡性结肠炎与结肠癌之间存在因果关系已得到消化界公认, 溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis, UC) 患者结肠组织上皮异性增生 ( 高级别或低级别 ) 发生在进展期大肠癌之前, 内镜检查可见单发或多发腺瘤样假性息肉改变, 这些病理改变被看作是癌前状态 [3]. 溃疡性结肠炎相关癌变 (ulcerative colitis associated carcinogenesis, UCAC) 是涉及多基因多信号的复杂过程, Wnt 通路调控 β-catenin 磷酸化 (P-β-catenin) β-catenin 核内异常转录介导 UCAC 发生发展中具有重要地位 [4]. 我们前期在体试验研究结论, 初步证实健脾清热活血类方药具有不良反应低, 提高溃疡性结肠炎溃疡愈合质量, 缓解溃疡性结肠炎临床疗效 [5]. 为进一步揭示其防治结肠癌的可能机制, 课题组采用血清药理学方法, 以公认有效的美沙拉嗪为对照组, 观察其对 SW48 细胞增殖凋亡及其关键通路 Wnt/β-catenin 的影响, 探讨健脾清热活血类方药防治人结肠癌的生物学机制. 1 材料和方法 1.1 材料人结肠癌细胞株 SW48 购自上海细胞库 ; SPF 级大鼠, 2 g±2 g, 购自广西医科大学动物实验中心, 动物许可证号 : SCXK 桂 29-2, 动物合格证号 : 1869; 健脾清热活血方购自广西中医学院第一附属医院仁爱分院 ; 美沙拉嗪肠溶颗粒剂 ( 商品名 : 艾迪莎 )( 批号 : H27727) 购自广西中医学院附属瑞康医院 ; D M E M 培养液南美洲胎牛血清 FBS(Hyclone); 总 RNA 提取试剂盒 ( 离心柱型, DP419, 北京天根 ); MTT 噻唑 (Amresco) 二甲基亚砜 (DMSO)(OACS Grade)( 广西天地扬 ); 逆转录试剂盒 (RevertAid First Strand cdna Synthesis Kit)(Ferments)(#K1621 #K1622) 引物 ( 上海生工 ); Alexa Fluor 488 annexinv/dead Cell Apoptosis Kit with Alexa Fluor 488 annexin V and for Flow Cytometry(invitrogen) 凯基细胞 DNA 含量检测试剂盒 ( 细胞周期 )( 广西阳光实 Volume 21 Issue 9

3 张保静, 等. 健脾清热活血方介导 Wnt/β-catenin 通路对人结肠 SW48 细胞的影响 747 验 ); FS Universal SYBR Grenn Mas( 广州聚研 ); 蛋白提取液 ( 碧云天 ) 十二羟硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)( 广州威佳 ); 二硫苏糖醇 (dithiothreitol, DTT)(Sigma); 甘油 (glycerol)( 国产 ); 丙烯酰胺 (Acrylamide)(Sigma); N,N'- 亚甲基丙烯酰胺 (Bis-Acrylamide)(Sigma); 四甲基乙二胺 (tetramethylethylenediamine, TEMED)( 上海生工 ); 过硫酸铵 (ammomium persulfate, AP)( 国产广州化学试剂厂 ); 甘氨酸 (Glycine)( 鼎国 ); Tris 碱 (Trisbase)(Sigma); 甲醇 (methanol)( 广州化学试剂厂 ); 吐温 -2(Tween-2)(Sigma); 脱脂奶粉 ( 伊利 ); PVDF 膜 (BIO RAD); 荧光一抗 c-fos(sc R-FITC, santa-cruz, 美国 ); PBS( 北京中杉金桥 ); Tween 2(Amresco ); 染核试剂 DA(sigma, D9564, 美国 ); 倒置相差显微镜 (Axiovert2, 德国 Zeiss); 全自动酶标仪 (BIO-RAD); 75 荧光 PCR 仪 ; CO 2 培养箱 (HEPA FILTER): 多通道 PCR 扩增仪 (PTC-22, 美国 MJ); SZ-93 自动双重纯水蒸馏器 ( 上海亚荣 ); BIO-RAD 电泳仪 (Power/Pac3, 美国 BIO-RAD); 凝胶成像分析系统 (Bio-Rad Gel doc2, 美国 ); 低速大容量离心机 (LXJ-ⅡB, 上海安亭 ); 高速低温离心机 (581R Eppendorf Centrifuge, 德国 ); 细胞流式分析仪 (FACSCalibur) 及统计软件 (FACSCalibur); 超声细胞破碎仪 ( 上海天呈 ); 垂直电泳仪及转移系统 (BIO RAD); 射线摄影暗匣 (5 7 英寸富士 X 光片发光暗盒, 广州艺佳 ), 脱色摇床 (Rotomix 公司 ); PVDF 膜 (BIO RAD) 内参抗体 ( 广州艺佳 ); HRP 标记二抗 ( 武汉博士德 ); 蔡司激光共聚焦显微镜 LSM 方法实验药物制备 : 健脾清热活血方药组方为救必应 15 g 白术 1 g 白芍 15 g 水蛭 1 g 三七 1 g 炙甘草 6 g. 用蒸馏水煎成健脾清热活血方药液, 浓缩配制成 1 g 原生药 /1 ml 的药液, 过滤分装 4 保存备用. 美沙拉嗪肠溶颗粒剂用蒸馏水配制成药液, 过滤分装 4 保存备用含药血清制备 : 将 2 只 SD 大鼠, 按体质量随机分为对照组和治疗组, 每组 1 只. 给药剂量参照人和动物按体表面积折算的等效剂量比率表计算 [6]. 参考公式 : 给药剂量 = 临床常用量动物等效剂量系数 ( 按体表面积 ) 培养液内稀释度. 给药方式 : 治疗组给予健脾清热活血中药, 对照组给予美沙拉嗪, 空白组给予等量的生理盐水, 以灌胃形式给予处理, 1 次 /d, 连续 7 d. 采血时相 : 末次给药 2 h 后, 用 1% 的水合氯醛以体重.3 ml/1 g 的比例行麻醉处理, 于腹主动脉取血, 室温下静置 2 h, 于 4 3 r/min 离心 15 min 后取得血清, 同种条件下血清混匀, 56 3 min 灭活处理,.22 μm 滤膜过滤除菌, 置于 -2 保存备用 MTT 法检测人结肠癌 SW48 细胞增殖 : 将人结肠癌细胞 SW48 接种于含 1% 胎牛血清的 DMEM 培养液中, 置于含 5%CO 2 37 的培养箱中培养. 取处于对数生长期的细胞, 用.25% 的胰酶消化下来, 用 DMEM 培养液制成细胞悬液, 2 μl/ 孔, 以个 / 孔的密度接种于 96 孔板中, 继续培养 24 h, 用微量移液器移去培养液, 血清添加方式参考文献 [7], 略作修改, 治疗组分别加入不含胎牛血清的 DMEM 培养基 2 μl 稀释浓度分别为 5% 1% 15% 2% 3% 的含药血清, 对照组加入不含胎牛血清的 DMEM 培养基 2 ml 稀释浓度为.5 mmol/l 的美沙拉嗪含药血清, 空白组是含 1% 胎牛血清的 DMEM 培养液, 每组设 5 个复孔, 继续培养 h 后, 每孔加入 2 μl 的 MTT 溶液 (5 mg/ ml), 37 孵育 4 h 后, 用 1 ml 注射器小心吸取每孔中的培养液, 再分别加入 2 μl 的 DMSO, 于微型振荡器上振荡 1 min 后, 用全自动酶标仪测定各孔 (57 nm) 吸光度 (A ) 值. 计算公式 : 肿瘤细胞生长抑制率 (%) = ( 对照孔平均 A 值 - 加药组平均 A 组 )/ 对照孔的平均 A 值乘以 1% 流式细胞仪检测人结肠癌 SW48 细胞周期及凋亡 : 取处于对数生长期的细胞, 用 DMEM 培养液制成细胞悬液, 2 ml/ 孔, 以个 / 孔的密度接种于 6 孔板中, 培养 24 h 后给药. 移去培养液, 血清添加方式参考文献 [7], 略作修改, 治疗组分别加入不含胎牛血清的 DMEM 培养基稀释浓度分别为 5% 15% 25% 的含药血清, 对照组加入不含胎牛血清的 DMEM 培养基 2 ml 稀释浓度为.5 mmol/l 的美沙拉嗪含药血清, 空白组加入含 1% 胎牛血清的 DMEM 培养液, 继续培养 24 h 后, 分别用.25% 的不含 EDTA 的胰酶消化, 收集细胞, 采用凯基细胞 DNA 含量检测试剂盒 ( 细胞周期 ) 和 Invitrogen 凋亡试剂盒, 严格按照说明书操作步骤操作. 用美国 BD 公司生产的 FACSCalibur 流式细胞仪检测, 以 cell quest pro 统计软件分析荧光直方图上细胞周期和凋亡细胞百分率免疫印光染色技术检测人结肠癌 SW48 细胞 β-catenin 蛋白表达 : 将与流式细胞仪检测方法相关报道曹俊等研究发现胃泌素与其受体作用后可使结肠癌细胞中 β-catenin 分布发生转移并激活 β-catenin/tcf-4 通路来降低结肠癌细胞的黏附, 增加肿瘤细胞的侵袭和转移, 但上述研究主要集中在中药单体抗肿瘤作用与 Wnt/β-catenin 信号转导的关系, 本研究从中药复方调控 Wnt/ β-catenin 信号通路干预 UCAC 入手, 研究结果将有助探讨中药复方干预溃疡性结肠炎癌变的靶点机制 Volume 21 Issue 9

4 748 ISSN (print) ISSN (online) 世界华人消化杂志 213 年 3 月 28 日第 21 卷第 9 期创新盘点临床研究发现, 美沙拉嗪阿司匹林等药物可通过抑制 W n t 信号通路, 提高结肠癌细胞内 β-catenin 的磷酸化水平, 稳定其转录失活状态, 阻滞 Wnt/β-catenin- TCF/LEF 对下游靶基因的转录活性调节而发挥抗癌效应. 但由于不良反应过大患者耐受差, 往往限制其临床使用. 中医药因其天然疗效明确且具有不良反应低价格低廉等优势日益受到青睐, 健脾清热活血方具有多环节多靶点缓解溃疡性结肠炎的作用, 结合现代医学, 从分子水平深入探讨其防治溃疡性结肠炎癌变的作用机制, 具有重要的理论与应用价值. 抑制率 (%) 表 1 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 引物序列基因名称 Forward (5'-3') Reverse (5'-3') 扩增长度 (bp) β-catenin GGTGAAAATGCTTGGTTCACC CGCACTGCCATTTTAGCTCC 112 TCF-4 CCACAGCTATGCCTGGTGGT AAGGCCGGTTCCATACCCT 127 C-myc AGGCGAACACACAACGTCTTG GGGCCTTTTCATTGTTTTCCA 116 CyclinD1 ACCTGAGGAGCCCCAACAAC GCTTCGATCTGCTCCTGGC 132 β-actin GCATGGGTCAGAAGGATTCCT TCGTCCCAGTTGGTGACGAT 条件下处理过的细胞, 应用免疫印光染色技术检测 β-catenin 蛋白表达, 具体步骤严格按照试剂说明书进行操作, 以 AlphaImager22 分析系统对蛋白条带进行含量分析 Western blot 技术检测人结肠癌 SW48 细胞 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 蛋白表达 : 将与流式细胞仪检测方法条件下处理过的细胞, 应用 Western blot 技术检测 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 蛋白表达, 具体步骤严格按照试剂说明书进行操作. 同时以 β-actin 作为内参, 用光密度扫描仪对蛋白含量进行密度分析, 以目的蛋白与 β-actin 的密度比值作为目的蛋白的相对含量. 5% 1% 15% 2% 3% 含药量图 1 各组结肠癌 SW48 细胞增殖率比较. 治疗组对照组荧光定量 PCR 检测人结肠癌 SW48 细胞 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 mrna 表达 : 将与流式细胞仪检测方法条件下处理过的细胞, 应用实时荧光定量 P C R 法 (R e a l- time PCR), 以 β-actin 为内参, 检测 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 的 mrna 表达, 具体步骤严格按照试剂说明书进行操作, 各样品的荧光信号值由荧光定量 PCR 仪的支持软件 ABI Prism7SDS software 实时产生并自动计算定量数值, 以目的基因与 β-actin 的 mrna 表达比值作为目的基因的相对表达量. β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 引物序列见表 1. 统计学处理实验数据以 mean±sd 表示, 用 SPSS11.5 for Windows 软件进行数据处理与分析. Oneway Analysis Of Variance(One-way ANOVA) 进行各组间方差分析, 方差齐同时用 LSD 法, 方差不齐时用 Tambane'S T2 法, P <.5 为有统计学意义. 检验水准为 α =.5. 实验重复 3 遍以上. 2 结果 2.1 健脾清热活血中药对人结肠癌 SW48 细胞增殖的影响治疗组与 SW48 细胞共同孵育 h 后, 1% 的含药血清浓度 24 h 时出现明显的抑制作用 (P <.5), 其抑制率是 57.86%, 半数抑制率的含药血清浓度是 13.7%, 但 h 后没有明显的抑制的作用, 可能与含药血清本身的药理动力学有关, 故后续的实验都只取 24 h 这个时间段来检测各个指标 ( 图 1). 2.2 健脾清热活血中药对人结肠癌 SW48 细胞周期影响应用 FCM 定量分析, 治疗组 SW48 细胞的 S 期细胞增多 G 1 期细胞减少, 且与药物浓度有剂量依赖性 (P <.5), 与对照组比较有统计学差异 (P <.5, 图 2). 2.3 健脾清热活血中药对人结肠癌 SW48 细胞凋亡影响应用流式细胞仪检测, 治疗组干预 SW48 细胞作用 24 h 后, 治疗组细胞凋亡率较空白组增高 (P <.5), 但与剂量无依赖性. 这说明, 健脾清热活血中药可诱导细胞凋亡 ( 表 2, 图 3). 2.4 健脾清热活血中药对人结肠癌 SW48 细胞 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 蛋白表达免疫荧光染色分析显示, 空白组 β-catenin 阳性表达以核内高表达为特点, 各治疗组 β-catenin 阳性表达呈下降趋势且以膜表达为主, 不存在膜缺失现象, 与空白组比较, 均有统计学差异 (P <.5). Western blot 分析显示, 治疗组 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 蛋白表达均呈下降趋势, 与空白组比较有统计学意义 (P <.1), 其中低中剂量调节作用更 Volume 21 Issue 9

5 张保静, 等. 健脾清热活血方介导 Wnt/β-catenin 通路对人结肠 SW48 细胞的影响 749 A B C D E 应用要点本研究从体外细胞着手, 用含药血清干预人结肠癌细胞, 以不同浓度健脾清热活血方含药血清及公认治疗 UCAC 有效的西药美沙拉嗪作对照, 观察 SW48 细胞增殖凋亡及其对 Wnt/ β- catenin- TCF-4 通路的影响, 为阐明该复方中药治疗作用靶点提供理论依据图 2 FCM 检测各组人结肠癌 SW48 细胞周期变化. A, B, C: 分别为治疗组低中高剂量组 ; D: 对照组 ; E: 空白组. 表 2 各组人结肠癌 SW48 细胞 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 mrna 表达 (n =5, mean±sd) 分组细胞凋亡率 (%) β-catenin mrna TCF-4 mrna C-myc mrna CyclinD1 mrna 空白组 1.74± ± ± ± ±.13 对照组 22.71±1.9 a 1.39±.12 a 1.62±.21 a 1.52±.16 a 1.41±.12 a 低剂量组 13.5±1.31 bc 1.62±.22 bc 1.83±.24 bc 1.71±.13 bc 1.71±.23 bc 中剂量组 15.8±1.11 bc 1.53±.21 bc 1.74±.19 bc 1.63±.27 bc 1.55±.13 bc 高剂量组 14.47±1.27 bc 1.85±.11 bc 2.4±.12 bc 1.84±.31 bc 1.89±.11 bc a P <.5, b P <.1 vs 空白组 ; c P <.5 vs 对照组. 表 3 各组人结肠癌 SW48 细胞 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 蛋白表达 (n =5, mean±sd) 分组细胞凋亡率 (%) β-catenin 蛋白 TCF-4 蛋白 C-myc 蛋白 CyclinD1 蛋白空白组 1.74± ± ± ± ±.15 对照组 22.71±1.91 a 1.33±.14 a 1.59±.12 a 1.35±.31 a 1.36±.17 a 低剂量组 13.5±1.31 bc 1.57±.15 bc 1.75±.7 bc 1.65±.17 bc 1.69±.11 bc 中剂量组 15.8±1.11 bc 1.46±.18 bc 1.66±.11 bc 1.44±.13 bc 1.52±.23 bc 高剂量组 14.47±1.27 bc 1.73±.11 bc 1.89±.14 bc 1.72±.18 bc 1.73±.25 bc a P <.5, b P <.1 vs 空白组 ; c P <.5 vs 对照组. 佳 (P <.1). β-catenin 核内积聚, 下游靶基因 TCF-4 C-myc CyclinD1 高表达可能是结肠癌变的关键所在, 健脾清热活血方药具有干预 β-catenin 核内积聚以及 TCF-4 C-myc CyclinD1 表达的作用. 这说明, 健脾清热活血方药可干预 β-catenin 核内积聚以及调节下游靶基因 TCF-4 C-myc CyclinD1 表达的作用 ( 图 4, 5, 表 3) Volume 21 Issue 9

6 75 ISSN (print) ISSN (online) 世界华人消化杂志 213 年 3 月 28 日第 21 卷第 9 期名词解释根据世界卫生组织 198 年专家会议将癌前病变的组织学定义分为癌前状态和癌前病变两个范畴, 溃疡性结肠炎相关癌变包括两个方面 : 一是溃疡性结肠炎为结肠癌癌前状态 ; 二是结肠上皮内瘤变 ( 表现为内镜下单发或多发的腺瘤样假性息肉改变 ) 为结肠癌前病变. A B C D E R7 R1 R R8 R 图 3 FCM 检测各组人结肠癌 SW48 细胞凋亡率. A, B, C: 分别为治疗组低中高剂量组 ; D: 对照组 ; E: 空白组. A B C D E 图 4 各组结肠癌 SW48 细胞 β-catenin 蛋白的免疫荧光染色. A, B, C: 分别为治疗组低中高剂量组 ; D: 对照组 ; E: 空白组. 2.5 健脾清热活血中药对人结肠癌 SW48 细胞 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 mrna 表达各治疗组 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 mrna 表达呈下降趋势, 与空白组比较均有统计学差异 (P <.1). 这说明, 结肠癌变存在 β-catenin mrna 高表达, 导致下游靶基因 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 过度转录的特点, 健脾清热活血方药可能干预上述靶点, 发挥治疗效应 ( 表 2). 3 讨论健脾清热活血方是全国名老中医广州中医药 Volume 21 Issue 9

7 张保静, 等. 健脾清热活血方介导 Wnt/β-catenin 通路对人结肠 SW48 细胞的影响 751 A C E B D F 同行评价本文目标明确, 设计合理, 研究方法较先进, 实验数据可靠, 创新性较好, 有一定的科学意义. G H 图 5 各组结肠癌 SW48 细胞 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 蛋白表达. A-D: 基因 β-catenin TCF-4 C-myc CyclinD1 目的基因蛋白的表达 ; E-H: 相应内参基因蛋白的表达. 其中蛋白图中从左至右分别为空白组对照组治疗组低中高剂量组. 大学终身教授劳绍贤在总结多年治疗溃疡性结肠炎经验基础上, 精心筛制而成, 临床疗效确切 [8,9]. 该方由白术炙甘草救必应白芍水蛭, 三七等药物组成, 诸药合用共奏健脾利湿清热解毒活血定痛之效. 我们前期临床研究结果提示健脾清热活血方可能通过促进结肠上皮细胞修复及杯状细胞分泌保护因子, 加快肠道黏膜重建, 促进溃疡修复过程 ; 下调过量表达的 IKK-α 蛋白水平, 从而抑制 NF-κB 活性, 调节机体免疫, 因而发挥干预溃疡性结肠炎相关癌变的治疗效应 [1-13]. 为进一步阐明健脾清热活血方防治溃疡性结肠炎相关癌变的作用机制, 课题组采用血清药理学方法, 以公认有效的美沙拉嗪为对照组, 观察了不同浓度含药血清防治结肠癌的可能机制及其效应, 细胞增殖周期及凋亡率均证实健脾清热活血方可以抑制 SW48 细胞增殖, 干预细胞 G 1 期, 诱导细胞凋亡, 提示健脾清热活血方可有效防治结肠癌. 多项研究均已证实, UC 长期患者发生癌变的危险性升高, 在确诊 8-1 年后, 癌变风险有逐年增长.5%-1.% 之趋势, 一项荟萃分析显示, 1 2 及 3 年 UC 患者癌变发生率分别为 2% 8% 18% [14], 而因此所导致的死亡人数占总体患者的 15% [15]. 尽管 UC 癌变机制目前尚未明确, 但是现代研究已证实 Wnt 信号通路与 UC 癌变的发生有着密切的关系, 其中 β-catenin 核内异常转位及其下游靶基因过度转录被认为是 UC 癌变的关键事件之一. β-catenin 是 Wnt 信号通路中最关键的转导子 [16,17], 是一种多功能胞质蛋白, 在细胞内存在于细胞膜细胞质及细胞核中, 含有 781 个氨基酸, 分子量在 kda, 其氨基末端含数个 GSK-3β 的磷酸化位点, 羟基末端有活化相应靶基因转录的功能, 中间区域形成 α- 螺旋和连接环结构, 含有 Cadherin APC 蛋白及 TCF 结合的位点, 这些分子的结构特点决定了 β-catenin 在 Wnt 信号传导中起枢纽作用 [18]. 结直肠癌与 β-catenin/ T 细胞因子 (T cell factor, TCF) 介导的特异转录有关, TCF 和 β-catenin 形成复合物是靶基因激活的先决条件, β-catenin 缺少 DNA 结合活性, 却有转录活性区, 而 Tcf 兼有 β-catenin 结合域和结合 DNA 活性, 无转录活性, 两者结合形成具有转录功能的复合体, 在核内共同调控下游靶基因包括 3 多种调节细胞增殖和侵袭转移原癌基因如 c-myc cyclind1 等转录活性上调, 诱导细胞恶变, 从而完成 Wnt 信号的最终效应 [19] [2]. 临床研究也证实大肠正常黏膜 - 腺瘤 - 腺癌中 β-catenin 阳性表达分别以细胞膜细胞浆胞浆 / 核为主, 同时也证明了 β-catenin 首先在细胞浆内累积, 后转移到细胞核与转录因子 TCF 结合, 激活相关靶基因的理论. TCF-4 作为结肠黏膜主要表达细胞因子和 Wnt 信号通路中的分子开关, 在调控细胞癌变过程中具有促进细胞增殖分化和抑制细胞过度生长防止肿瘤发生的双重效应, 其突变可致肿瘤发生 [21], 更重要的是 TCF-4-β-Catenin 复合体及下游靶基因的转录激活是结直肠癌细胞恶性转化的一个标志, 且这些基因的构成性激活对维持恶性表现型来说是必需的 [22]. 经研究证实的 β-catenin/tcf 最为重要的下游靶基因 C-myc, 具有与染色体 DNA 结合特性, 可使细胞无限增殖和促进细胞分裂, 在调节细胞生长分化及恶性转化中发挥作用 [23], 并有着和其他癌基因协同的作用, 共同参与肿瘤的发生发展. 研究表明细胞浆内 β-catenin 的聚集及 c-myc 的高表达与结肠癌的形成有关 [24], 而且 β-catenin 的表达与 c-myc 呈正相关, 这可能与 Wnt 通路活化后细胞浆中 β-catenin 的增加从而调控 c-myc 的表达有关 [25]. 因此, 逆转 β-catenin 核内聚集及抑制 β-catenin c-myc 表达可达到抑制肿瘤发生目的. 肿瘤作为一种细 Volume 21 Issue 9

8 752 ISSN (print) ISSN (online) 世界华人消化杂志 213 年 3 月 28 日第 21 卷第 9 期胞周期性疾病, CyclinD1 是细胞周期重要的正调控因子且在肿瘤的发生发展过程起着重要的作用 [26-28], 其含量及活化程度在细胞增殖周期卡点 G 1 /S 期转换过程中起限速作用. 相关文献报道 [29], CyclinD1 于结肠癌细胞株中表达下调, 能抑制结肠癌细胞的增殖, 从而反证了 CyclinD1 过度表达能促进结肠癌细胞增殖的结论. 因此 CyclinD1 可能通过促进细胞周期而促进细胞增殖来参与结肠癌的发生, 通过抑制其基因表达, 可以达到抑制肿瘤生长目的. 综上可知, 这一复杂的 Wnt/ β-catenin-tcf/lef 信号通路, 其关键点在于多种因素对细胞内 β-catenin 水平的影响, β-catenin 的高低最终决定靶基因的转录水平, 因此调控细胞内 β-catenin 水平, 介导 β-catenin 降解是干预 Wnt 信号通路防治溃疡性结肠炎癌变的关键事件之一. 临床研究表明 [3,31], 既往未被用于治疗癌症的某些药物, 具有明确的化学预防结肠癌的效应, 可以抑制 Wnt 信号通路, 比如非甾体类抗炎药物舒林酸阿司匹林异布洛芬上述药物可以提高结肠癌细胞内 β-catenin 的磷酸化水平, 稳定其转录失活状态, 阻滞 Wnt/β-catenin-TCF/LEF 对下游靶基因的转录活性调节, 发挥抗癌效应. 但由于上述药物副作用过大患者耐受差, 往往限制临床使用. 本研究结果发现, 空白组 β-catenin 表达以核内表达为主, 各治疗组 β-catenin 以膜内表达为主, 不存在膜表达缺失现象, 而且各治疗组的 β-catenin C-myc CyclinD1 TCF-4 mrna 和蛋白较空白组相比, 均呈现下降趋势, 其中以低中剂量疗效最为明显. 上述变化与细胞增殖周期与凋亡变化呈正相关. 因此, 我们可以相信, 健脾清热活血中药可以调控 β-catenin C-myc CyclinD1 TCF-4 基因表达, 发挥抑制结肠癌的效应. 综上所述, 课题组推测健脾清热活血中药复方具有明确防治结肠癌变效应, 其机制可能为通过介导 Wnt/β-catenin 通路, 干预 SW48 细胞 G 1 期, 诱导细胞凋亡, 从而发挥防治结肠癌的效应. 同时本研究结果也弥补了现代抗癌药物的不足, 对防治溃疡性结肠炎相关癌变发生具有深远意义. 4 参考文献 1 Mantovani A, Romero P, Palucka AK, Marincola FM. Tumour immunity: effector response to tumour and role of the microenvironment. Lancet 28; 371: [PMID: DOI: 1.116/S (8)6241-X] 2 Colotta F, Allavena P, Sica A, Garlanda C, Mantovani A. Cancer-related inflammation, the seventh hallmark of cancer: links to genetic instability. Carcinogenesis 29; 3: [PMID: DOI: 1.193/carcin/bgp127] 3 Goldacre MJ, Wotton CJ, Yeates D, Seagroatt V, Jewell D. Cancer in patients with ulcerative colitis, Crohn's disease and coeliac disease: record linkage study. Eur J Gastroenterol Hepatol 28; 2: [PMID: DOI: 1.197/ MEG.b13e3282f2a5e2] 4 Risques RA, Lai LA, Brentnall TA, Li L, Feng Z, Gallaher J, Mandelson MT, Potter JD, Bronner MP, Rabinovitch PS. Ulcerative colitis is a disease of accelerated colon aging: evidence from telomere attrition and DNA damage. Gastroenterology 28; 135: [PMID: DOI: 1.153/ j.gastro ] 5 李华燕, 张涛, 张颖芹. 健脾清热活血方与美沙拉嗪治疗溃疡性结肠炎的对比研究. 中国中西医结合消化杂志 211; 19: 李仪奎. 中药药理实验方法学. 上海 : 上海科学技术出版社, 1991: 吴健宇, 穆静, 李仪奎. 血清药理学方法体外实验系统的血清添加量问题. 上海中医药杂志 21; 9: 常东, 劳绍贤, 樊亚巍, 陶永胜, 朱圣鹰, 张东坡. 溃结灵颗粒配合柳氮磺胺吡啶治疗大肠湿热型溃疡性结肠炎 3 例. 辽宁中医杂志 27; 34: 黄志新, 劳绍贤, 崔琦珍, 王汝俊, 胡旭光. 溃结灵颗粒治疗活动期溃疡性结肠炎的临床与实验研究. 中国中西医结合消化杂志 23; 11: 杜群, 李红, 王建华, 王汝俊. 溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠粘膜 NF-κB p65 蛋白表白及血清 TNF-α 含量的影响. 广州中医药大学学报 27; 24: 杜群, 李红, 王汝俊, 李燕舞, 巫燕莉, 王建华. 溃结灵对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜 IKK-α 蛋白表达的作用. 中药材 28; 31: 常东, 刘子志, 李键, 冯春霞, 李辉, 何方. 大肠湿热型溃疡性结肠炎患者防御素白细胞介素 -8 表达及溃结灵的干预作用. 中国中医药信息杂志 21; 17: 王喜周, 张涛, 陈远能, 黄适, 潘怀耿. 健脾清热活血类方药介导 β-catenin C-myc 表达干预溃疡性结肠炎相关癌变研究. 中成药 212; 34: Eaden JA,Abrams KR,Mayberry JF. The risk of colorectal cancer in ulcerative colitis: a meta-analysis. Gut 21; 48: [PMID: DOI: /gut ] 15 Munkholm P. Review article: the incidence and prevalence of colorectal cancer in inflammatory bowel disease. Aliment Pharmacol Ther 23; 18 Suppl 2: 1-5 [PMID: DOI: /apt.12211] 16 Schneikert J, Behrens J. The canonical Wnt signalling pathway and its APC partner in colon cancer development. Gut 27; 56: [PMID: DOI: /gut ] 17 Gregorieff A, Pinto D, Begthel H, Destrée O, Kielman M, Clevers H. Expression pattern of Wnt signaling components in the adult intestine. Gastroenterology 25; 129: [PMID: ] 18 Reya T, Clevers H. Wnt signalling in stem cells and cancer. Nature 25; 434: [PMID: DOI: 1.138] 19 Batlle E, Bacani J, Begthel H, Jonkheer S, Gregorieff A, van de Born M, Malats N, Sancho E, Boon E, Pawson T, Gallinger S, Pals S, Clevers H. EphB receptor activity suppresses colorectal cancer progression. Nature 25; 435: [PMID: ] 2 张丽娟, 李梅, 陈云, 杨承纲. B-catenin c-myc 在结直肠肿瘤中的表达及其意义. 结直肠肛门外科 27; 13: Volume 21 Issue 9

9 张保静, 等. 健脾清热活血方介导 Wnt/β-catenin 通路对人结肠 SW48 细胞的影响 Batlle E, Henderson JT, Beghtel H, van den Born MM, Sancho E, Huls G, Meeldijk J, Robertson J, van de Wetering M, Pawson T, Clevers H. Beta-catenin and TCF mediate cell positioning in the intestinal epithelium by Controlling the expression of EphB/ ephrib. Cell 22; 111: [PMID: ] 22 Fasolini M, Wu X, Flocco M, Trosset JY, Oppermann U, Knapp S. Hot spots in Tcf4 for the interaction with beta-catenin. J Biol Chem 23; 278: [PMID: DOI: /hsz ] 23 Gregorieff A, Clevers H. Wnt signaling in the intestinal epithelium: from endoderm to cancer. Genes Dev 25; 19: [PMID: DOI: 1.111/ gad ] 24 Valentini AM, Pirrelli M, Renna L, Armentano R, Caruso ML. P53 and beta-catenin in colorectal cancer progression. Current Pharmace-utical Design 23; 9: [PMID: DOI: / ] 25 徐晓, 陈卫昌, 林茂松, 张宝峰, 方静, 周琼, 胡莺, 郜恒骏. β-catenin/c-myc 在结肠癌组织中的表达及其临床意义. 中国现代医药杂志 27; 9: Zhou JX, Niehans GA, Shar A, Rubins JB, Frizelle SP, Kratzke RA. Mechanisms of G1 checkpoint loss in resected early stage non-small cell lung cancer. Lung Cancer 21; 32: [PMID: DOI: 1.116] 27 Moghaddam SJ, Haghighi EN, Samiee S, Shahid N, Keramati AR, Dadgar S, Zali MR. Immunohistochemical analysis of p53, cyclind1, RB1, c-fos and N-ras gene expression in hepatocellular carcinoma in Iran. World J Gastroenterol 27; 13: [PMID: DOI: /wjg.v19.i1.144] 28 Rose SL, Buller RE. The role of p53 mutation in BRCA1-associated ovarian cancer. Minerva Ginecol 22; 54: [PMID: ] 29 Morisaki T, Uchiyama A, Yuzuki D, Essner R, Morton DL, Hoon DS. Interleukin 4 regulates G1 cell cycle progression in gastric carcinoma cells. Cancer Res 1994; 54: [PMID: DOI: / ] 3 Arber N, Levin B. Chemoprevention of colorectal neoplasia: the potential for personalized medicine. Gastroenterology 28; 134: [PMID: ] 31 Terdiman JP, Johnson LK, Kim YS, Sleisenger MH, Gum JR, Hayes A, Weinberg VK, McQuaid KR. Chemoprevention of colonic polyps with balsalazide: an exploratory, double-blind, placebo-controlled study. Dig Dis Sci 29; 54: [PMID: DOI: 1.17/s ] 编辑田滢电编鲁亚静 ISSN (print) ISSN (online) DOI: 年版权归 Baishideng 所有消息中国科技信息研究所发布世界胃肠病学杂志 ( 英文版 ) 影响因子.873 本刊讯一年一度的中国科技论文统计结果由中国科技信息研究所 ( 简称中信所 ) 在北京发布. 中国科技期刊引证报告 ( 核心版 ) 统计显示, 211 年世界胃肠病学杂志 ( 英文版 ) 总被引频次次, 影响因子.873, 综合评价总分 88.5 分, 分别位居内科学类 52 种期刊的第 1 位第 3 位第 1 位, 分别位居 1998 种中国科技核心期刊 ( 中国科技论文统计源期刊 ) 的第 11 位第 156 位第 18 位 ; 其他指标 : 即年指标.219, 他引率.89, 引用刊数 619 种, 扩散因子 8.84, 权威因子 , 被引半衰期 4.7, 来源文献量 758, 文献选出率.94, 地区分布数 26, 机构分布数 1, 基金论文比.45, 海外论文比.71. 经过多项学术指标综合评定及同行专家评议推荐, 世界胃肠病学杂志( 英文版 ) 再度被收录为中国科技核心期刊 ( 中国科技论文统计源期刊 ). 根据 211 年度中国科技论文与引文数据库 (CSTPCD 211) 统计结果, 世界胃肠病学杂志( 英文版 ) 荣获 211 年百种中国杰出学术期刊称号 Volume 21 Issue 9

instillation therapy combined with Western medicine can reduce the levels of ALT, TBA, ALP, TBIL, DBIL and GGT, and improve the anti-cmv-igm negative

instillation therapy combined with Western medicine can reduce the levels of ALT, TBA, ALP, TBIL, DBIL and GGT, and improve the anti-cmv-igm negative 在线投稿 : http://www.baishideng.com/wcjd/ch/index.aspx 帮助平台 : http://www.wjgnet.com/esps/helpdesk.aspx DOI: 10.11569/wcjd.v23.i28.4568 世界华人消化杂志 2015 年 10 月 8 日 ; 23(28): 4568-4573 ISSN 1009-3079

746 ISSN (print) ISSN (online) 世界华人消化杂志 213 年 3 月 28 日第 21 卷第 9 期 研发前沿本研究采用血清药理学方法, 运用 MTT 法 流式细胞仪 实时荧光定量 PCR 免疫印迹法 免疫印光染色法, 从基因转录和蛋白

746 ISSN (print) ISSN (online) 世界华人消化杂志 213 年 3 月 28 日第 21 卷第 9 期研发前沿本研究采用血清药理学方法, 运用 MTT 法流式细胞仪实时荧光定量 PCR 免疫印迹法免疫印光染色法, 从基因转录和蛋白