28 中国农业科技导报 10 卷和 φ50 mm ( 过流动相 ) ; W aters Oasis λ HLB ( 6 ml, 500 mg) 小柱 1. 2 标准溶液配制标准贮备液 : 分别准确称取盐酸环丙沙星甲磺酸培氟沙星恩诺沙星诺氟沙星氧氟沙星盐酸洛美沙星盐酸沙拉沙星盐酸

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波谭
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1 中国农业科技导报, 2008, 10 ( S2) : Journa l of Agricultural Sc ience and Technology 高效液相色谱法测定复合预混合饲料中 9 种喹诺酮类药物施杏芬, 任玉琴, 陈勇, 吴望君, 周丰超 ( 浙江省饲料监察所, 杭州 ) 摘要 : 建立了以高效液相色谱 - 荧光检测法同时测定复合预混合饲料中 9 种喹诺酮类药物的最佳方法该法简便快速准确灵敏度高重现性好 9 种喹诺酮类药物在浓度 0. 05~4μg/mL 范围内与峰面积呈线性相关, 相关系数 r > , 平均回收率均在 80% 以上, RSD 均在 7% 以内关键词 : 喹诺酮类 ; 高效液相色谱 ; 荧光检测法 ; 色谱条件中图分类号 : S 文献标识码 : A 文章编号 : ( 2008) S D eterm ina tion of N ine Qu in olones in Pr em ix Using H igh Performance L iqu id Chroma togra phy SH I Xing2fen, R EN Yu2qin, CHEN Yong, WU W ang2jun, ZHOU Feng2chao ( Zhejiang Feed Sup ervision Institute, Hangzhou , China) Ab stra ct: An efficient Liquid chroma tography2fluore scence de tec tion m ethod for dete rm ina tion of nine kinds of quinolone s in compound prem ix wa s e stablished. The m ethod is simple, rapid, accurate, sensitive and rep roducible. The concentra tion of nine kinds of qu inolines and peak area was linear corre lation between 0. 05~4μg/mL, co rrela2 tion coeffic ient r wa s above Average recla im ra tio wa s above 80% and coefficient of variation was not excee2 ding 7%. Key wor ds: quinolones; HPLC; fluorescence detection; chrom atographic conditions 喹诺酮类药物是 60 年代人工合成的具有 4 - 喹诺酮环结构的广谱杀菌性抗菌药物, 现在普遍使用的是第三代喹诺酮类药物 ( FQS), 广泛用于治疗小动物禽类家畜及水生动物由细菌支原体引起的消化呼吸泌尿生殖等系统疾病以 [1 ~3 ] 及皮肤软组织的感染性疾病但是该类药物本身具有一定毒性, 若使用不当也存在着潜在的危害, 个别品种已在真核细胞内显示出致突变趋向, 因此必须从整个食物链的源头 ( 饲料 ) 抓 [ 4, 5 ] 起为此, 本实验建立了复合预混合饲料中喹诺酮类药物多组分检测的高效液相色谱 - 荧光检测法, 该法是检测饲料中喹诺酮类多残留的一种简便快速准确的方法 1 材料与方法 1. 1 主要仪器与试剂 KQ2500E 型超声波清洗器 ; 高效液相色谱仪 ( 配荧光检测器 ) 乙腈甲醇 ( 均为色谱级, 其余试剂为分析纯 ) ; 2% 氨化乙腈溶液 ( 2 ml 氨水用乙腈定容至 100 ml 摇匀 ) ; 提取液 [ 2% 氨化乙腈溶液与纯水按 1 1 (V /V ) 混合 ]; 磷酸盐缓冲溶液 ( 取磷酸二氢钾 6. 8 g, 加纯水溶解并稀释至 500 ml, 用 5. 0 mol/l 氢氧化钠溶液调节 ph 7. 0) ; 5% 甲醇溶液 ( 移取 5 ml 甲醇用纯水定容到 100 ml) ; 洗脱液 [ 乙腈 - 流动相 (30 70, V /V ) ]; 盐酸环丙沙星 (CPFX) 甲磺酸培氟沙星 ( PEFX ) 恩诺沙星 ( EFLX) 诺氟沙星 (NFLX) 氧氟沙星 (OFLX) 甲磺酸达氟沙星 (DANO) 盐酸洛美沙星 LMX) 盐酸沙拉沙星 (SALX) 盐酸二氟沙星 (D IFX) 样品流动相配制 : 移取 6. 8 ml 85% 的磷酸于 ml 容量瓶中, 纯水定容, 摇匀, 用三乙胺调 ph 2. 40, 加 1% 乙腈, 使用前过 μm 滤膜并脱气 ; 滤膜为孔径 0. 22μm,φ1. 3 mm ( 过提取液 ) 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 浙江省科技厅重点科研农业项目 ( 2006 C22044 ) 资助作者简介 : 施杏芬, 高级畜牧师, 从事饲料和畜产品检测工作 Tel: ; E2m ail: hzsh ixingf eng@ 163. com

2 28 中国农业科技导报 10 卷和 φ50 mm ( 过流动相 ) ; W aters Oasis λ HLB ( 6 ml, 500 mg) 小柱 1. 2 标准溶液配制标准贮备液 : 分别准确称取盐酸环丙沙星甲磺酸培氟沙星恩诺沙星诺氟沙星氧氟沙星盐酸洛美沙星盐酸沙拉沙星盐酸二氟沙星 8 种标准品 g( 以主含量计 ), 甲磺酸达氟沙星 g ( 以主含量计 ), 于 50 ml 棕色容量瓶中, 用提取液超声溶解并定容, 摇匀, 作为贮备液前 8 种沙量标准贮备液浓度为 1 000μg/mL, 甲磺酸达氟沙星标准贮备液浓度为 200μg/mL 混合标准工作液 : 分别从 9 种喹诺酮类贮备液中各吸取 2. 0 ml 于同一 100 ml 棕色容量瓶中, 用洗脱液定容, 此时 8 种沙星标准溶液浓度为 20μg/mL, 达氟沙星标准溶液浓度为 4 μg/ml 置 2~8 冰箱中保存, 有效期为 1 周 1. 3 试料的处理试料提取称取试样 0. 5 g ( 精确至 ) 于 100 ml 棕色容量瓶中, 加提取液 80 ml 左右, 常温超声 10 min, 摇匀, 再常温超声 10 m in, 冷却, 用提取液定容至 100 ml 移取 20 ml 左右于离心管中, rpm 离心 10 m in, 精密移取上溶液 5 ml, 50 氮吹至 2 ml 左右, 加入磷酸盐缓冲溶液至 5 ml, 涡旋混匀, 作为备用液试料净化先用 5mL 甲醇 5mL 磷酸盐缓冲溶液活化小柱, 移取 5. 0 ml 备用液上小柱, 用甲醇溶液 5mL 淋洗, 挤干用洗脱液 5. 0 ml 洗脱, 挤干, 收集的洗脱液涡旋混匀, 过滤膜, 供高效液相色谱法测定 1. 4 标准曲线从混合标准工作液中分别移取 25 μl 50 μl 250μL 500μL 1 ml 和 2 ml 于 10 ml 棕色容量瓶, 用洗脱液定容, 8 种沙星上机浓度分别为 μg/ml 0. 1 μg/ml 0. 5 μg /ml 1. 0 μg / ml 2 μg/ml 4 μg/ml 达氟沙星上机浓度为 0. 01μg/mL 0. 02μg/mL 0. 1 μg/ml 0. 2 μg / ml 0. 4μg/mL 0. 8μg/mL Table 1 表 1 流动相梯度 Gradient of mobile pha se 检测条件色谱柱 : A tlantis dc18 柱 ( 150 mm 4. 6 mm, 5μm) ; 流动相为磷酸 / 三乙胺溶液 - 乙腈溶液 ( 梯度见表 1) ; 流速 1. 2 ml /min; 检测波长采用激发波长 280 nm, 发射波长 480 nm; 柱温 30 ; 在 2. 5% ~5. 8% 之间, 添加量为 100 mg/kg 达氟沙星为 20 mg/kg 时, 其平均回收率在 94. 6% ~ % 之间, R SD 在 2. 8% ~4. 4% 之间, 添加量为 120 mg/kg 达氟沙星为 24 mg /kg 时, 其平均回收率在 93. 4% ~ % 之间, RSD 在 0. 6% ~ 进样量 20 μl 3. 0% 之间时间 (m in) Time (m in) 乙腈 ( % ) Acetonitrile ( % ) 磷酸 / 三乙胺溶液 ( 已加 1% 乙腈 ) ( % ) Phosphoric ac id triethylam ine (with 1% acetonitrile) ( % ) 结果与分析 2. 1 出峰顺序及保留时间 9 种混合标准溶液经 HPLC 测定, 其出峰顺序及对应保留时间分别为 : 氧氟沙星 (OFLX) m in, 诺氟沙星 (NFLX) min, 培氟沙星 ( PEFX ) min, 环丙沙星 ( CPFX ) m in, 洛美沙星 (LMX) min, 达氟沙星 ( DANO ) m in, 恩诺沙星 ( EFLX ) min, 沙拉沙星 ( SALX) m in, 二氟沙星 (D IFX) m in 2. 2 标准曲线及相关系数达氟沙星浓度在 0. 01~0. 8 μg/ml 范围内, 其他 8 种沙星均在 0. 05~4μg/mL 范围内, 峰面积与浓度线性关系良好, 其线性回归系数均在以上 ( 见表 2) 2. 3 最低检测浓度以信噪比 S /N = 3 计, 8 种沙星检测限为 0. 1 mg/kg, 达氟沙星的检测限为 mg/kg 2. 4 回收率和精密度测定批内的精密度 ( RSD ) 和准确度 ( 回收率 ) 称取给预混合饲料 0. 5 g 6 份, 1 份作空白料, 5 份作加标回收添加 3 个不同浓度的 9 种混标溶液, 按照样品处理的方法进行提取净化, 上机测定具体数据见表 3, 图谱见图 1 和图 2 添加量为 80 mg/kg 达氟沙星为 16 mg/kg 时, 其平均回收率在 92. 5% ~102. 0% 之间, RSD

3 S2 施杏芬等 : 高效液相色谱法测定复合预混合饲料中 9 种喹诺酮类药物 29 表 2 回归方程和线性范围 Table 2 Regre ssion equa tion and linea r range. 药物名称回归方程回归系数 r 线性范围 (μg/ml) Drug nam e Regression equation Regression coeftic ient r L inea r range (μg/ml) OFLX Y = x ~ NFLX Y = x ~ PEFX Y = x ~ CPFX Y = x ~ LMX Y = x ~ DANO Y = x ~ EFLX Y = x ~ SALX Y = x ~ D IFX Y = x ~ 表 3 复合预混合饲料中喹诺酮的回收率 ( X ) 及相对标准偏差 ( RSD ) Table 3 The recla im rctio of quinolone (X) and RSD in compound prem ix. 添加量 Addition 平均值 ( % ) Average ( % ) OFLX NFLX PEFX CPFX LMX DANO EFLX SALX D IFX 80 m g/kg X R SD mg/ kg X R SD mg/ kg X R SD 图 1 试样图谱 F ig. 1 The HPLC p rofile of samples.

4 30 中国农业科技导报 10 卷图 2 空白图谱 F ig. 2 The HPLC p rofile of blank sample 批间的精密度 ( RSD ) 和准确度 ( 回收率 ) 添加同一浓度的复合预混合饲料分 3 个不同日期进行提取测定 : 每次 5 个重复, 1 个空白 ; 具体数据见表 4, 总平均回收率在 88. 0% ~98. 1% 之间, RSD 在 2. 2% ~6. 8% 之间表 4 批间平均精密度 ( RSD) 和准确度 ( 回收率 X) Table 4 Ba tch2ba tch prec ision ( RSD) and ave rage recla im ratio (X ). 批次 B atch 平均回收率 ( % ) Ave rage reclaim ra tio( %) 总平均 ( % ) To ta l average ( % ) 总 RDS ( % ) Tota l RD S( % ) OFLX NFLX PEFX CPFX LMX DANO EFLX SALX D IFX A B C 讨论本试验采用常温超声的方法同时提取复合预混合饲料样品中的 9 种喹诺酮类药物, 极大地缩短了样品的预处理时间, 检测方法的回收率和重复性均满足饲料中兽药分析要求, 回收率均在 80% 以上, RDS 均在 7% 以内, 检测限达 0. 1 mg / kg, 与单个药物检测方法相比, 多组分同时测定, 使整个检验周期大大缩短, 检测成本大大降低复合预混合饲料是由微量元素维生素氨基酸非营养性添加剂中任何两类或两类以上与载体按一定比例配制的, 其中以微量元素和维生素混合的复合预混合饲料较为常用, 它的微量元素 ( Fe Cu Mn Zn 等 ) 含量都很高, 对样品的提取与测定会造成很大的干扰, 故本实验采取 2% 氨化乙腈与水体积比为 1 1 的碱性混合液作为提取液, 一方面喹诺酮类药物在碱性溶液中有较好的溶解性, 另一方面又可以减少微量元素对喹诺酮 [ 6, 7 类药物的干扰 ] 喹诺酮类药物在 HLB 净化小柱中保留后挤干, 洗脱时发现洗脱液不容易往下滴, 这时可以用真空泵抽或用洗耳球挤, 但滴的速度要比较慢, 以确保 9 种喹诺酮类药物全部洗脱完全光 [ 8 ] 喹诺酮类药物在酸性溶液中有较强的荧, 故用碱性溶液提取后氮吹至中性, 然后用

5 S2 施杏芬等 : 高效液相色谱法测定复合预混合饲料中 9 种喹诺酮类药物 31 ph 7. 0 的磷酸缓冲盐稀释后上 HLB 净化小柱, 用 ph 2. 4 的洗脱液洗脱, 与流动相也具有很好的互溶性参考文献 [ 1 ] 郑国安, 宋庆华. 动物性食品兽药残留的危害与对策初探 [ J ], 河南农业科学, 2005, 11: [ 2 ] 贡玉清. 喹诺酮类药物的残留分析 [ J ], 畜牧与兽医, 2002 ( 8) : [ 3 ] 杜黎明, 卫洪清, 张俊燕, 等. 高效液相色谱法测定氟喹诺酮类药物 [J ], 分析化学, 2003, 5: 637. [ 4 ] 王野, 刘峥, 刘峰. 高效液相色谱法同时快速测定喹诺酮类药物帕珠沙星洛美沙星左氧氟沙星的含量 [ J ]. 中国抗生素杂志, 2006, 31 (7) : [ 5 ] 余已刚, 刘继平, 林华山, 等. 喹诺酮类药物残留色谱检测研究概述 [ J ], 中国卫生检验杂志, 2003, 13 ( 4 ) : [ 6 ] 杜黎明, 卫洪清, 张俊燕, 等. 反相高效液相色谱法同时测定 6 种氟喹诺酮类药物 [ J ], 色谱, 2003, 21 ( 5 ) : [ 7 ] 钟映梅, 张秀英, 张峻峰. 动物性食品中氟喹诺酮类药物的残留分析 [J ], 中国兽药杂志, 2004, 38: [ 8 ] 刘芃岩, 姜宁, 王洪宇, 等. 固相萃取 - 高效液相色谱法同时测定猪肉中磺胺类和氟喹诺酮类兽药残留量 [ J ], 化学通报, 2006, 8: 新书推介饲料数据描述规范及评价进展熊本海, 庞之洪, 罗清尧主编中国农业科学技术出版社出版日期 : I S B N: 定价 : 元开本 : 16 开页数 : 410 页科学数据既是科技活动的产物, 又是支持更复杂的科学研究及科技创新所不可替代的基本资源在竞争激烈的科技创新全球化时代, 拥有科学数据就意味着拥有了丰富的创新资源和最佳的创新能力, 就有了提升科技竞争力的最广泛基础中国进入信息时代的主要标志之一是大量科学数据产生科学数据是国家科技进步社会发展经济建设和全民教育所需要的重要信息基础, 是国家宝贵的资源和财富, 这已成为不争的事实长期以来, 国家投资科研项目产生的大量的科学数据不能得到广泛应用, 已经成为制约我国科技发展最主要的障碍之一, 在动物营养学研究领域也不例外本书第一部分提出的饮料数据描述规范在现阶段旨在抛砖引玉, 尽管在现阶段对于饲科技数据的整合是基本可行的, 但是随着饲料营养科技的不断深入, 当新的研究方法和新的概念指标不断出现时, 描述规范将会有新的版本以完善和更新过去的版本, 希望描述规范的应用者在实践中提出建设性意见, 为新版的行业描述规范的不断完善, 各抒已见畅所欲言

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