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1 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (11): 藏药夏果贝的生药鉴别及荧光显微镜的应用 王亚琼 1, 徐福春 2, 卓玛东智 2, 刘鄂湖 1, 徐络珊 1, 刘惠娟 1, 李萍 1* (1. 中国药科大学, 天然药物活性组分与药效国家重点实验室, 江苏南京 ; 2. 西藏大学医学院药学系, 西藏拉萨 ) 摘要 : 夏果贝 (Delphinii Brunoniani Herba) 来源于毛茛科翠雀属植物囊距翠雀花 (Delphinium brunonianum Royle) 的干燥地上部分, 为常用藏药之一 主治流感 皮肤痒疹 蛇咬伤等症 本文对藏药夏果贝的生药性状与显微特征进行了观察 通过对夏果贝的性状特征观察, 同时利用普通光学显微镜和荧光显微镜对夏果贝茎 叶的横切面及粉末进行观察, 寻找典型的显微特征 在夏果贝的叶 嫩茎及花萼下表面, 发现了一种花柱状含黄色分泌物的单细胞腺毛 通过荧光显微镜对叶和茎的横切面观察, 不需要经过复杂耗时的传统染色即可寻找到发出明显荧光的木质部和中柱鞘纤维群 研究结果为藏药夏果贝的生药鉴别提供了实验依据 关键词 : 夏果贝 ; 囊距翠雀花 ; 生药鉴别 ; 荧光显微法中图分类号 : R931 文献标识码 : A 文章编号 : (2012) Normal light and fluorescence microscopy for authentication of Delphinii Brunoniani Herba of Tibet WANG Ya-qiong 1, XU Fu-chun 2, DONGZHI Zhuo-ma 2, LIU E-hu 1, XU Luo-shan 1, LIU Hui-juan 1, LI Ping 1* (1. State Key Laboratory of Natural Medicines, China Pharmaceutical University, Nanjing , China; 2. Medical School of Tibet University, Lhasa , China) Abstract: Dried herb of Delphinium brunonianum Royle (Ranunculaceae) has long been used under the herbal name Xiaguobei (Delphinii Brunoniani Herba) in traditional Tibetan medicine and prescribed for the treatment of influenza, itchy skin rash and snake bites. In order to find a useful and convenient method for the identification of microscopic features, the technique of fluorescence microscopy was applied to authenticate Xiaguobei of Tibet. The transverse sections of stem and leaf, as well as the powder of Xiaguobei were observed to seek for typical microscopic features by normal light and fluorescence microscopy. A style-like, single-cell glandular hair containing yellow secretions on the leaf, young stem and sepal of Xiaguobei was found. Under the fluorescence microscope, the xylem and pericycle fiber group emitted significant fluorescence. This work indicated that fluorescence microscopy could be an useful additional method for the authentication work. Without the traditional dyeing methods, the main microscopic features could be easily found by fluorescence microscopy. The results provided reliable references for the authentication of Xiaguobei. Key words: Xiaguobei; Delphinium brunonianum Royle; authentication; fluorescence microscopy 收稿日期 : ; 修回日期 : 基金项目 : 天然药物活性组分与药效国家重点实验室开放课题资助项目 (SKLNMKF201224); 西藏大学青年科研培育基金项目 (ZD11PZ01). * 通讯作者 Tel: , Fax: , liping2004@126.com

2 1556 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (11): 夏果贝 (Delphinii Brunoniani Herba) 来源于毛茛科翠雀属植物囊距翠雀花 (Delphinium brunonianum Royle) 的干燥地上部分, 为常用藏药之一 [1] 翠雀属 (Delphinium L.) 植物约有 300 种以上, 广泛分布于北温带地区 我国约有 113 种, 除台湾省和海南岛以外在其他各省区均有分布 翠雀亚属约有 110 种, 其中大多数种分布在云南北部 西藏东部和四川西部一带的高山地区 夏果贝在我国主要分布于西藏南部, 一般生长于海拔 4 500~6 000 米草地或多石处 [2] 晶珠本草 记载, 夏果贝解邪毒 清疫疠热 让钧多吉说, 夏果贝治皮肤病 如意宝树 记载, 夏果贝清疫疠热, 治疔中毒症 赤巴病有特效 [3] 藏医多用本品治疗流感 皮肤痒疹 蛇咬伤等症 [1] 中国藏药 记载夏果贝与夏冈哇 ( 展毛翠雀, Delphinium kamaonense Huth var. glabrescens (W.T.Wang) W.T. Wang) 均为翠雀属植物, 不易区分 夏果贝在西藏地区多为本品, 而在云南迪庆地区用法较宽, 常用者包括螺距翠雀花 (Delphinium spirocentrum Hand.-Mazz.) 拟螺距翠雀花 (Delphinium bulleyanum Forr. ex Diels) 滇川翠雀花 (Delphinium delavayi Franch.) 大理翠雀花 (Delphinium taliense Franch.) 等 [3] 而有关夏果贝 ( 囊距翠雀花 ) 的生药鉴别研究却未见相关报道, 因此本文对夏果贝的药材性状及显微特征进行了研究, 同时采用光学显微镜和荧光显微镜寻找典型的显微特征, 为其生药鉴别提供科学依据 材料与方法仪器粉碎机 (BD-05014, China), 冰冻切片机 (Leica CM1950, Germany), 石蜡切片机 (Leica, Germany), 显微镜 (Nikon Eclipse 50i, Japan), 汞灯电源 (Nikon C-SHG1, Japan), 汞灯 (Nikon LH-M100C-1, Japan), 数码摄像头 (Nikon digital camera DS-Fi1, Japan), 图像采集软件 (Nikon NIS-Elements F3.00, Japan) 荧光显微镜的光源分别通过 330~380 nm 的带通滤波片 (band-pass filter, BP) 和 420 nm 的长通滤光片 (long-pass filter, LP), 显蓝色荧光 ; BP 450~ 490 nm, LP 520 nm, 显绿色荧光 ; BP 510~560 nm, LP 590 nm, 显红色荧光, 分别在这 3 档下观察样品荧光特征并记录拍照 荧光谱线如图 1 所示 试剂石蜡 (UNI-CHEM, China), 番红 (SIGMA- ALORICH, Switzerland), 固绿 (SIGMA-ALORICH, Switzerland), 树胶 (SIGMA-ALORICH, Switzerland), 无水乙醇 (Sasma, Netherlands), 二甲苯 (RCI Labscan, Thailand), 冷冻包埋剂 (Leica, Germany), 水合氯醛 ( 中国医药集团上海化学试剂公司 ), 甘油 ( 中国医药集团上海化学试剂公司 ) 夏果贝夏果贝于 2011 年 8 月采自西藏拉萨市区 拉萨市墨竹工卡县和山南地区加查县, 经兰州大学杨永建教授及西藏大学藏药老师卓玛东智鉴定为囊距翠雀花 (Delphinium brunonianum Royle) 标本保存于西藏大学植物标本馆 Figure 1 The transmittance spectra of emission filters (a) with BP nm and LP 420 nm, (b) with BP nm and LP 520 nm, (c) with BP nm and LP 590 nm

3 王亚琼等 : 藏药夏果贝的生药鉴别及荧光显微镜的应用 1557 性状特征的观察从形状 大小 色泽 表面特征 质地 断面特征和气味等方面对夏果贝药材生药性状进行观察与描述, 并用数码相机拍摄图像 对药材进行数据测量, 测量茎直径, 叶片长度 宽度, 叶柄长度等 显微特征的观察茎和叶横切面 : 选取茎的中部和叶的主脉制作石蜡切片, 并于显微镜下观察 选择具有代表性的切片进行特征描述和拍照 冷冻切片 : 将制作石蜡切片的原材料取 3~5 mm 长的小段, 充分湿润软化后放置于样品托上, 加适量冷冻胶覆盖样品, 放置于冷冻切片机的冷冻头处冷冻固定 冷冻胶完全变成白色时为冷冻完全, 即可进行切片 选取组织结构较完整的切片粘于载玻片上, 晾干以备观察 粉末显微特征 : 药材打粉后制片 用解剖针挑取适量粉末于载玻片上, 滴加水合氯醛试剂, 加热透化, 滴加稀甘油试剂, 加盖盖玻片 ; 取适量粉末滴加斯氏液, 混合均匀, 加盖盖玻片 ( 观察淀粉粒 ) 于 20 倍物镜下对粉末片进行 Z 字形扫描, 对于具有鉴别性的特征于 40 倍物镜下进行仔细观察 描述和拍照, 并对重要的显微特征进行数据测量 Figure 2 Macroscopic characteristics of Xiaguobei 结果 1 性状特征本品茎表面青黄色或淡绿色, 被白色柔毛和黄色腺毛, 直径 1~9 mm; 老茎淡红色略带紫色无毛 ; 具纵棱, 断面中空, 呈白色 叶 2~3 枚, 多生于茎下部及基部, 具长柄, 柄长 1~12 cm; 叶片黄绿色皱缩, 湿润展开后呈肾状五角形, 表面被短柔毛, 长 1.2~ 4.5 cm, 宽 2~5 cm; 3 深裂, 裂片互相邻接或稍覆压, 具缺刻状小裂片和粗牙齿, 中央全裂片宽菱形, 侧全裂片近扇形, 一至二回细裂, 小裂片狭卵形 花团状, 单生枝顶 ; 花梗被短柔毛, 并混生黄色腺毛 ; 花萼宿存, 5 枚, 蓝紫色, 外被白色柔毛, 距圆筒状钻形 雄蕊黑褐色, 有黄色髯毛 心皮 5, 果皮被柔毛 种子黑褐色, 扁四面体形, 沿稜有翅, 长约 2 mm 气清香, 味苦, 涩 ( 图 2) 2 显微特征 2.1 茎横切面茎表皮细胞一层, 扁长方形, 外被角质层, 可见腺毛或非腺毛 下皮细胞一层, 扁长方形, 壁略薄 皮层薄壁细胞类多角形或类圆形, 大小不一 中柱鞘纤维发达, 呈环带状 外韧型维管束 7~ 28 个, 韧皮部狭窄 髓部较宽广, 中空 ( 图 3a) 2.2 叶横切面叶上下表皮细胞各 1 列, 长方形或扁圆形, 下表皮着生腺毛和非腺毛 栅栏组织细胞 2 Figure 3 The transverse sections of the stem and leaf of Xiaguobei. a: The transverse sections of the stem; b: The transverse sections of the leaf. 1: Glandular hair; 2: Epidermal cells of the stem; 3: Hypodermal cells; 4: Cortex: 5: Pericycle fibers; 6: Phloem; 7: Xylem; 8: Pith; 9: Upper epidermal cells of the leaf; 10: Palisade tissue; 11: Spongy tissue; 12: Sclerenchymatous cells; 13: Xylem; 14: Phloem; 15: Pericycle fibers; 16: Lower epidermal cells of the leaf

4 1558 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (11): 列, 长柱状 ; 海绵组织排列疏松 主脉维管束外韧型, 外侧有纤维束 ; 维管束周围有 1~2 列厚壁细胞形成维管束鞘 主脉上 下表皮内侧具厚角细胞 ( 图 3b) 2.3 粉末特征本品粉末呈黄绿色, 气清香, 味苦, 涩 ( 图 4 5) 腺毛单细胞, 花柱状 ; 基部膨大, 内含黄色分泌物, 上部细长呈长颈状 ; 长 170~489 μm, 基部直径 24~176 μm, 颈中部直径 5~15 μm 非腺毛有两种 薄壁非腺毛, 无色, 1~2 个细胞, 常弯曲或皱折, 表面有细微疣状突起, 长 226~1 191 μm, 直径 7~24 μm 厚壁非腺毛, 着生于退化雄蕊, 单细胞, 黄色表面具雕状纹理, 长 604~1 259 μm, 直径 27~64 μm 叶表皮细胞叶上表皮细胞表面观不规则形, 垂周壁略弯曲, 偶见腺毛及非腺毛 ; 下表皮细胞垂周壁波状弯曲, 呈连珠状增厚 ; 不定式气孔多见, 类圆形或长圆形, 长 38~80 μm, 宽 30~70 μm, 副卫细胞 3~5 个, 腺毛及非腺毛多见 叶上非腺毛长 339~ μm, 直径 8~46 μm; 腺毛长 250~466 μm, 基部直径 30~94 μm, 颈中部直径 6~15 μm 花萼表皮细胞垂周壁深波状弯曲, 上 ( 内侧 ) 表皮多见细长非腺毛, 下 ( 外侧 ) 表皮多见非腺毛与黄色腺毛 茎表皮细胞长条形, 气孔偶见 果皮表皮细胞外表皮细胞表面观长条形或不规则形, 表面具细微线性纹理 内表皮细胞表面观不规则形, 壁波状弯曲, 气孔类圆形或长圆形, 不定式, 5~6 个副卫细胞 偶见细长非腺毛 种皮表皮细胞外表皮细胞成片, 棕色或棕褐色, 表面观呈长多角形, 长 24~202 μm, 直径 7~ 66 μm 内表皮细胞成片, 棕色, 表面观呈长多角形, 具细密平行的横向纹理, 垂周壁连珠状增厚, 长 13~114 μm, 宽 3~13 μm 花粉粒类圆形, 直径 22~31 μm, 具 3 个萌发孔, 孔口类圆形或长圆形 花粉囊内壁细胞表面观界限不清, 呈乳突状, 断面观细胞成长条形, 具螺状增厚 分泌物类球形, 金黄色 淀粉粒单粒, 卵圆形 类圆形或不规则形, 直径 3~26 μm; 脐点裂缝状 飞鸟状或人字状 导管螺纹, 环纹, 直径 3~39 μm 3 荧光显微特征作者运用冰冻制片法, 制备了夏果贝茎及叶的横切片, 用荧光显微镜观察, 希望不同组织的荧光特 Figure 4 The powder of Xiaguobei. 1: Glandular hair; 2a: Non-glandular hair with thin wall; 2b: Non-glandular hair with thick wall; 4: Epidermal cells of the sepal; 5: Epidermal cells of the stem; 7a: Outer epidermal cells of testa; 7b: Inner epidermal cells of testa; 8: Pollen grains; 9a: Surface view of inner-wall cells of microdiodange; 9b: Section view of inner-wall cells of microdiodange; 10: Secretion; 11: Starch grains; 12: Vessels Figure 5 The powder of Xiaguobei. 3a: Upper epidermal cells of the leaf; 3b: Lower epidermal cells of the leaf; 6a: Outer epidermal cells of pericarp; 6b: Inner epidermal cells of pericarp 征可以为夏果贝的生药学鉴别提供帮助 夏果贝的荧 光显微特征如表 维管束叶和茎的木质部和中柱鞘纤维均显较 明显的荧光, 中柱鞘纤维的荧光略强于木质部, 而薄 壁细胞和韧皮部基本不显荧光 中柱鞘纤维和周围的 皮层薄壁细胞由于形态极为相似不易区分时, 纤维

5 王亚琼等 : 藏药夏果贝的生药鉴别及荧光显微镜的应用 1559 Table 1 The fluorescence of the key microscopic characters of Xiaguobei Vascular bundle of stem Vascular bundle of leaf Glandular hair Non-glandular hair with thick wall Pollen grain Normal light microscopy Green fluorescence Red fluorescence Blue fluorescence 细胞的绿 红 蓝 3 种荧光都非常明显, 可以为纤维群的鉴别提供准确的佐证 叶的厚壁细胞也显浅色荧光, 但不如木质部和纤维细胞的荧光明显, 与在普通光学显微镜下观察相比, 可更方便的鉴别出叶维管束周围具有厚壁细胞组成的维管束鞘 3.2 其他腺毛显绿色和红色荧光, 其中腺毛基底部的荧光较强 ; 腺毛的头部和基底部显蓝色荧光, 但其他部位不显蓝色荧光 厚壁非腺毛显明亮的绿色和红色荧光, 而蓝色荧光不明显 薄壁非腺毛基本不显荧光 花粉粒显强的绿 红 蓝荧光 讨论藏药是我国药用植物资源的一大宝库, 在长期的实践中以中医药学 印度医药学和大食医药学为基础形成了独特的医药体系, 是我国较为完整 较有影响的民族药之一 西藏是藏医药的发源地, 常用藏药有 300 多种, 含生物碱的种类约占 50%, 活性较强的成分多见于乌头属 翠雀属 莨菪属和龙胆属等药 用植物 夏果贝 ( 囊距翠雀花 ) 是翠雀属植物中常用的一种藏药, 全草含囊距翠雀碱 (brunonine) 囊距翠雀宁 (delbrunine) 和囊距翠雀星 (delbrusine) 等生物碱 [1] 本文是对藏药夏果贝进行质量控制研究的第一步, 相关分析及活性的研究还正在进行中 对夏果贝的生药鉴别可以为翠雀属药用植物的进一步研究和资源的开发利用提供帮助 此外, 收集更多种类的翠雀属植物, 更全面的研究它们的差别也更有意义, 但由于药用的翠雀属植物多为野生, 资源匮乏, 采集期仅有每年的 7 8 月份, 对样本的收集还需要更多的时间 荧光显微技术是利用特定波长的光照射被检物体产生荧光进行检测的显微光学观测技术 由于不同组织细胞理化性质不同, 在不同波长的照射下而产生不同颜色或不同强弱的荧光, 使用荧光显微镜可以观察到植物组织 细胞在普通光学显微镜下无法呈现的一些特征, 从而有助于更有效地进行鉴别 [4 7] 番红固绿双重染色法是生药鉴定中最常用的经典染

6 1560 药学学报 Acta Pharmaceutica Sinica 2012, 47 (11): 色方法, 番红能使木质部和厚壁组织细胞壁呈红色, 而固绿使韧皮部和薄壁细胞壁呈绿色 但染色制片却是一个复杂耗时的过程, 前期的研究已经表明荧光显微镜可以作为生药学鉴别中一个有效的辅助手段 在本文中通过荧光显微镜对叶和茎的横切面观察发现, 木质部和中柱鞘纤维都有明显荧光, 而薄壁细胞和韧皮部基本无荧光, 无需染色即可更方便快捷的找到木质部和纤维群 由于不同组织荧光特点的差异, 荧光显微技术不需要通过复杂耗时的染色即可寻找到夏果贝典型的显微特征 荧光显微技术必将为生药学鉴别的发展提供新的思路 同时, 显微图像采集采 [8, 用数码成像技术, 记录结果真实客观 9] 小结本文通过对常用藏药夏果贝的生药鉴别, 发现一种花柱状含黄色分泌物的单细胞腺毛 这种腺毛在其他种类的中草药植物中暂未发现详细的文字和图片报道, 其同属易混淆的夏冈哇 ( 展毛翠雀 ) 的显微鉴别中也未见报道 [3] 荧光显微镜作为生药鉴别中一个有效的辅助手段, 也再一次在藏药夏果贝的显微鉴别中得到验证 本文对藏药翠雀属植物夏果贝的性状特点和显微特征进行了报道, 同时采用光学显微镜和荧光显微镜真实 客观的记录了夏果贝的显微形态特征, 为夏果贝的质量标准研究提供了科学依据 References [1] Chinese herbal medicine editorial committee, State Administration of Traditional Chinese Medicine. Chinese Herbal Medicine ( 中华本草 ) [M]. Shanghai: Shanghai Science and Technology Publishers, 1999: [2] Flora of China editorial committee. Flora of China: Vol 27 ( 中国植物志 : 第 27 卷 ) [M]. Beijing: Science Press, 1979: , 365. [3] Qinghai province institute for drug control, Qinghai province institute of Tibetan Medicine. Tibetan Medicine: Vol 3 ( 中国藏 药 : 第 3 卷 ) [M]. Shanghai: Shanghai Science and Technology Publishers, 1996: [4] Liang ZT, Jiang ZH, Zhao ZZ, et al. Distinguishing the medicinal herb Oldenlandia diffusa from similar species of the same genus using fluorescence microscopy [J]. Microsc Res Tech, 2006, 69: [5] Liang ZT, Chen HB, Zhao ZZ. An experimental study on four kinds of Chinese herbal medicines containing alkaloids using fluorescence microscope and microspectrometer [J]. J Microsc, 2009, 233: [6] Chu C, Liu HJ, Li P, et al. Combination of normal light and fluorescence microscopy for authentication of five Lonicera species flower buds [J]. Microsc Res Tech, 2011, 74: [7] Wang YQ, Zhao ZZ, Li P, et al. Identification of powdered Chinese herbal medicines by fluorescence microscope, Part 1: fluorescent characteristics of mechanical tissues, conducting tissues, and ergastic substances [J]. Microsc Res Tech, 2011, 74: [8] Wang SY, Zhang M, Wang ZT. Microscopic identification of homonym drugs of Baitouweng by digital imaging technique [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2004, 39: [9] Yang XJ, Zhang M, Wang ZT, et al. Macroscopic and microscopic identification of Chinese herb belonging to genus Senecio [J]. Acta Pharm Sin ( 药学学报 ), 2011, 46: