612 中华损伤与修复杂志 ( 电子版 )2012 年第 7 卷第 6 期 ChinJInjuryRepairandWoundHealing(ElectronicEdition),December2012,Vol7,No.6 throughdetectingtheexpresionofmecaand

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1 中华损伤与修复杂志 ( 电子版 )2012 年第 7 卷第 6 期 ChinJInjuryRepairandWoundHealing(ElectronicEdition),December2012,Vol7,No 论著 烧伤创面分离葡萄球菌 meca fema 基因检测及耐甲氧西林金黄色葡萄糖球菌耐药相关性研究 赵超莉谢卫国金文平叶子青 张卫东 櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔 作者简介 : 赵超莉, 高级科研人员, 毕业于武汉市医师进修学院 ( 江汉大学医学部前身 ) 从事烧伤临床及科研工作 20 余年, 现担任烧伤科研 微生物学检测与鉴定 皮肤组织库技术管理等工作 先后参与和主持烧伤科研项目 8 项, 其中获奖 5 项 ; 独立主持课题一项, 获武汉市科技进步三等奖 摘要 目的对武汉市第三医院烧伤科住院患者中分离的 56 株葡萄球菌 (SA) 进行 meca fema 基因检测及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (MRSA) 耐药相关性分析, 探讨 MRSA 的耐药机制, 为指导临床合理用药提供科学依据 方法对 2012 年 1 月至 6 月在武汉市第三医院烧伤科住院患者中分离的 56 株葡萄球菌 (SA), 采用多重 PCR 快速微流体芯片技术, 检测 SA 中是否含有 meca fema 基因, 探讨 meca fema 阳性表达基因与 MRSA 菌株的关系 ; 并与头孢西丁纸片扩散试验作比较, 判定两种检测方法测得 MRSA 菌株是否一致 采用 K B 纸片扩散法药敏试验, 对分离的 56 株 SA 进行耐药性分析 结果检出的 56 株 SA 中,4 株为耐甲氧西林表皮葡萄球菌 (MRSE), 仅携带 meca 基因 ; 52 株为金黄色葡萄球菌, 其中 9 株只携带 fema 基因,43 株携带 meca fema 基因, 为 MRSA 菌株, 52 株金黄色葡萄球菌中 MRSA 检出率为 83.69% 采用基因检测技术测得 MRSA 株的方法与头孢西丁纸片扩散试验检出的 MRSA 菌株结果一致 葡萄球菌普通株与耐药株比较, 两者之间携带基因差异有统计学意义 (P<0.01) 体外药敏试验显示, 检出的金黄色葡萄球菌 MRSA 株及甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 (MSSA) 株均对万古霉素 替考拉宁 利奈唑胺敏感率达 100%; 氯霉素 复方新诺明次之 ; 而对青霉素 红霉素 克林霉素 头孢西丁 庆大霉素等耐药率较高, 其中 MRSA 株耐药率达 94.1% 以上 结论 MRSA 株检出率较高, 并表现出较高的耐药性 MRSA 菌株的耐药性与其携带有 meca fema 基因密切相关 ;PCR 微流体芯片技术联合检测 meca fema 基因与经典的头孢西丁纸片测量法结果基本一致 关键词 葡萄球菌感染 ; 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 ; 耐药 ; 基因 ; 烧伤 櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔櫔 DetectionofmecA andfema geneinstaphylococcusisolatedfrom burnwoundandthecorrelation analysisofmethicilin resistantstaphylococcusaureusresistance ZHAOChao li,xiewei guo,jin WEN ping,yezi qing,zhangwei dong.instituteofburns,wuhancityno.3hospital,wuhan430060, China Corespondingauthor:ZHAOChao li,emai:zhaochaoli17@hotmail.com Abstract Objective Fifty sixstrainsofstaphylococcuswereisolatedfromburnwoundsinpatients hospitalizedinburndepartmentofwuhancityno.3hospitaltoinvestigatetheresistancemechanismsof methiciclin resistantstaphylococcusaureus(mrsa)andprovideascientificreferenceforrationaldruguse, DOI: /cma.j.isn 基金项目 : 武汉市科技局重点攻关项目 (wk ) 作者单位 : 武汉市第三医院烧伤研究所通讯作者 : 赵超莉, zhaochaoli17@hotmail.com

2 612 中华损伤与修复杂志 ( 电子版 )2012 年第 7 卷第 6 期 ChinJInjuryRepairandWoundHealing(ElectronicEdition),December2012,Vol7,No.6 throughdetectingtheexpresionofmecaandfemagenesandmakingadrug resistentcorelationanalysis. Methods Fifty sixstrainsofstaphylococcuswereisolatedfromburnwoundsinpatientshospitalizedinburn departmentofwuhan CityNo.3 Hospitalfrom Jan. tojun ThemecA and fema genesof Staphylococusaureus(SA)weredetectedbyusingmultiplePCRandrapidmicrofluidicchiptechnologyto determinetheirexpresionandtherelationshipwithmrsa strains.andtheresultwascomparedwith cefoxitindiskdifusionmethodtodeterminethecorelationofthetwomethodsintestingmrsastrains.by usingthek Bmethodofdrugsensitivetest,thedrugresistanceoftheisolated56strainsofstaphylococcus wasanalyzed.results Fourof56strainsofstaphylococcusweremethicilinresistantstaphylococcus epidermidis(mrse),andonlycariedmeca gene.fifty twostrainsweresa,inwhich9strainsonly cariedfemageneandtheother43strainscariedbothmecaandfemagenes.thepositiveexpresionrate ofmrsawasupto83.69%.thepositiverateofthetwomethodsfortestingmrsawasalmostthesame. Thegenecariedindrug resistantstrainsandthesensitivestrainswassignificantlydiferent(p<0.01). Thedrugsensitivetestin vitroindicated thatmras and MSSA strainshad a100% sensitivityto vancomycin,teicoplaninandlinezolid,andalitlelowersensitivitytochloramphenicolandcotrimoxazole, butahighresistancetopenicilin,erythromycin,clindamycin,cefoxitinandgentamicin.theresistantrate ofmrsawasmorethan94.1%.conclusions AhighpositiverateofMRSAstrainswithahighdrug resistancewasdetected.mrsastrainswerecloselyrelatedwiththepositiveexpresionofmecaandfema genesinsa strains.theexpresionofmeca andfema genesdetectedbyusingpcr microfluidicchip technologywasinagoodaccordancewiththatusingtheconventionalcefoxitindiscmethod. Keywords Staphylococcalinfections;Methicilin resistantstaphylococcusaureus;resistance; Genes;Burns 感染是造成大面积烧伤患者死亡及产生并发症 的主要原因 [1] 烧伤创面检出的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicilin resistantstaphylococusaureus, MRSA) 往往对临床上广泛应用的多种抗生素产生耐药, 给治疗带来困难 研究表明 [2 3],mecA fema 基因分别是金黄色葡萄球菌 (Staphylococusaureus, SAU) 的耐药决定和辅助基因, 它们的存在直接影响 MRSA 菌株的产生 对金黄色葡萄球菌进行 meca fema 基因检测及耐药相关性分析, 为指导临床合理 应用抗生素具有重要意义 本研究采用采用多重 PCR 快速微流体芯片技术联合检测 meca fema 基 因, 并与经典的头孢西丁纸片扩散试验作比较, 探讨 MRSA 菌株的耐药机制, 为指导临床合理应用抗生素提供科学依据, 现报道如下 材料和方法 一 材料 1. 菌株来源 :2012 年 1 月至 2012 年 6 月武汉 市第三医院烧伤科住院患者创面分离的葡萄球菌 (Staphylococcus,SA)56 株 2. 主要仪器 :PCR 扩增仪 AMA2100 全自动微流芯片分析仪 ( 宁波基内生物技术有限公司 ),DYY 6G 型电泳仪 ( 北京六一仪器厂 ) 等 3. 主要试剂 : 细菌基因组提取试剂盒 SA 耐药 性检测试剂盒 100~500bp 内标液 ;PCR 扩增体系 ( 含通道 1 和通道 2):PCR 反应缓冲液 ( 主要成分 : KCL Tris Cl PH9.0,1.0%TritonX 100)12.5μL 2, 混合引物 1 2 各 2μL, 样品 DNA1μL 2 双蒸水 9.5μL 2, 总体积 25μl, 均由宁波基内生物技术有限公司提供 4. 药敏纸片 : 共测试 13 种抗生素包括 : 甲氧苄氨嘧啶 / 磺胺甲基异恶唑 ( 复方新诺明 ) 环丙沙星 庆大霉素 氯霉素 头孢西丁 四环素 青霉素 红霉 素 万古霉素 克林霉素 替考拉宁 利奈唑胺 头孢噻吩, 均为英国 OXOID 公司产品 5. 质控菌株 : 金黄色葡萄球菌 ATCC25925 由华中科技大学同济医学院微生物室提供 二 研究方法 ( 一 ) 细菌分离鉴定及体外药敏试验 收集 2012 年 1 月至 2012 年 6 月烧伤住院患者创 [4] 面分泌物标本, 按文献常规分离鉴定金黄色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 头孢西丁纸片扩散试验 : 用 30μg 头孢西丁纸片检测 MRSA 或耐甲氧西林表皮葡萄球菌 (methicilin resistantstaphylococcusepidermidis, MRSE) 菌株 药敏试验采用 K B 纸片扩散法, 按 2012 年新版美国临床实验室标准化研究所 (CLSI) 药 敏试验标准判定抗菌药敏结果 如抑菌环直径 22mm 的金黄色葡萄球菌判定为 MRSA 试验阳性 ; 如凝固酶阴性葡萄球菌, 则抑菌环直径 24mm 判定为 MRSE 试验阳性 ( 二 ) 葡萄球菌基因及耐药检测 1. 按照细菌基因组提取试剂盒说明书进行操

3 中华损伤与修复杂志 ( 电子版 )2012 年第 7 卷第 6 期 ChinJInjuryRepairandWoundHealing(ElectronicEdition),December2012,Vol7,No 作, 提取细菌基因组 DNA, 其中细菌增菌液基因组 提取后, 需进行电泳检测检验提取的有效性, 方可进行后续 PCR 扩增反应 2.PCR 扩增检测 meca fema 基因及耐药性检测 采用葡萄球菌耐药性检测试剂盒 (PCR 法 ) 检测耐药性 按照上述试剂组成配制好 PCR 扩增系, 盖严管盖, 短暂离心, 不可留气泡 PCR 扩增程序 : 94,4min;94,30s,56,40s,72,45s,32 个循环 ;720C,10min PCR 完毕后于 -200C 保存或直接芯片仪电泳检测 芯片检测 : 取 5μLPCR 产物加 15μL100~500bp 内标液, 混匀, 使用一次性微 流芯片 AMA2100 全自动微流芯片分析仪上进行样品分析 芯片仪电泳检测时高压程序设置如下 ( 表 1) 高压 方式 时间 (s) 表 1 高压程序设置数据 进样池 进样地 电泳池 电泳地 常数 常数 三 统计学处理采用 WHONET5.6 软件, 统计 56 株葡萄球菌属对 13 种抗生素的耐药率 ; 采用 SPSS13.0 软件进行统计学分析, 计数资料以率表示, 行 χ 2 检验, 以 P < 0.05 为差异有统计学意义 结 1. 细菌鉴定及体外药敏试验结果 : 烧伤创面 56 株葡萄球菌, 仅 4 株为 MRSE 占 7.14%, 其余 52 株为金黄色葡萄球菌占 92.86%, 其中 MRSA 有 43 株, 阳性 检出率达 82.69%,9 株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 (methicilin sensitive Staphylococus aureus, MSSA) 占 17.31%, 两者之间检出率差异有统计学意义 (P<0.01) 2.56 株葡萄球菌对 13 种抗生素的耐药情况见 表 2 分离出的金黄色葡萄球菌中,43 株 MRSA 对这 13 种抗生素耐药率明显高于 9 株 MSSA,MRSA 与 MSSA 菌株均对万古霉素 替考拉宁 利奈唑胺敏感, 耐药率为 0; 氯霉素 复方新诺明也有较高的敏感性 ; 而对青霉素 G 红霉素 克林霉素 头孢西丁 庆大霉素等耐药率较高, 其中 MRSA 株耐药率达 94.1% 以上, 高耐药率主要与 meca,fema 基因存在有关,4 株 MRSE 也显示较高的耐药性见表 2 3.mecA fema 基因 PCR 检测结果 : 电泳图 芯片图见图 1 2 检出的 56 株 SA 中,4 株为 MRSE, 仅携带 meca 基因 ;52 株 fema 基因阳性表达为金黄 果 色葡萄球菌, 其中 42 株均检出耐药特异性基因 meca,meca 基因条带显示加强, 为携带 meca fema 基因的 MRSA 菌株 ;9 株仅检出 fema 基因,mecA 基 因条带显示减弱, 为 MSSA 菌株 头孢西丁纸片扩 散试验与 PCR 基因检测法测得 MRSA 阳性结果基本一致 表 2 56 株葡萄球菌 MRSA MSSA MRSE 株 对 13 种抗生素的耐药率 (%) 比较 抗生素 MRSA MSSA MRSE 复方新诺明 环丙沙星 庆大霉素 氯霉素 头孢西丁 四环素 红霉素 克林霉素 青霉素 G 万古霉素 替考拉宁 利奈唑胺 头孢噻吩 合计耐药率 >94.1 >59.8 >89.7 注 :MRSA: 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,MSSA: 甲氧西林敏感金 黄色葡萄球菌,MRSE: 耐甲氧西林表皮葡萄球菌 4.56 株葡萄球菌对 13 种抗生素的耐药情况见 表 2 分离出的金黄色葡萄球菌中,43 株 MRSA 对这 13 种抗生素耐药率明显高于 9 株 MSSA,MRSA 与 MSSA 两组菌株均对万古霉素 替考拉宁 利奈唑 胺敏感, 耐药率为 0; 氯霉素 复方新诺明也有较高 的敏感性 ; 而对青霉素 G 红霉素 克林霉素 头孢西 丁 庆大霉素等耐药率较高, 其中 MRSA 株耐药率达 94.1% 以上,4 株 MRSE 也显示较高的耐药性 讨 研究表明 [5],MRSA 是烧伤创面感染的主要致病菌, 是造成医院感染及严重并发症的重要因素 由于它同时对多种抗生素耐药, 使得治疗由它引起的感染和控制其传播与流行十分困难 MRSA 的耐药机制非常复杂, 但主要的机制是 其染色体上 meca 基因介导产生了一个额外的 PBP2a 所致 这个 PBP2a 蛋白对 β 内酰胺抗生素 的亲和力很低, 并能替代原来正常 PBPs 的生物合成 功能, 起到合成细胞壁的作用, 从而使细菌得以生 存, 表现为对多种抗生素耐药 因此,mecA 是耐甲氧西林葡萄球菌的决定基因 [3] 论

4 614 中华损伤与修复杂志 ( 电子版 )2012 年第 7 卷第 6 期 ChinJInjuryRepairandWoundHealing(ElectronicEdition),December2012,Vol7,No.6 图 1 部分 MRSA 菌株 PCR 扩增检测片段电泳结果 注 :1.B4 条带 >404bp, 为杂带 2. 通道的阳性对照含相应的 3 个目标检测基因片段 3. 通道的阴性对照模板为水 图 2 MRSA 菌株芯片图 ( 注 :100bp 和 500bp 为内标 ) 除 meca 外, 其他辅助基因也参与了 MRSA 耐药 性的形成, 其中 fema 就是表达完整耐药性不可缺的 重要的一种辅助基因, 编码 48kD 的蛋白参与细胞壁 肽聚糖五甘氨酸桥合成 fema 是金黄色葡萄球菌的 固有基因, 可以影响 meca 的表达, 但 fema 在凝固酶阴性葡萄球菌 (coagulasenegativestaphylococcus, CNS) 中不表达 [3], 推测与 CNS 中 fema 变异或所扩增 片段不在 fema 保守区有关 因此, 选用适当引物行 fema 基因 PCR 扩增, 可用于金黄色葡萄球菌与 CNS 菌种间鉴别 [3] 目前国内临床微生物室对于 MRSA 的检测, 多采用 CLSI 推荐的头孢西丁纸片扩散法进行判断 [6], 而 meca 基因的 PCR 检测被认为是检测 MRSA 的 金标准, 但该法操作繁琐, 耗时, 成本较高, 在临 床实验室难以开展 笔者采用细菌基因组提取试剂盒提取细菌 DNA; 采用葡萄球菌耐药性检测试剂盒检测葡萄球 菌耐药性 ; 采用多重 PCR 一次性微流体芯片技术快 速测得葡萄球菌中 meca fema 基因, 得到 MRSA/ MSSA 和 MRCNS( 耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌 )/MSCNS( 甲氧西林敏感凝固酶阴性葡萄球菌 ) 结果, 并能够避免传统 PCR 法检测的假阳性结果 因此, 用本方法测得细菌染色体上的 meca 基因来确证 MRS, 测定 fema 基因来确证金黄色葡萄球菌, 不受药敏实验条件的影响, 能够检测出特异性耐药 的菌株, 是一项检测 MRSA 的新技术, 本实验方法与头孢西丁纸片扩散法结果基本一致 本实验结果中所有 MRSA 均携带 meca fema 基因, 只要有 meca 基因存在, 一旦在抗生素的压力下, 其完全可能表达为耐药株, 造成临床治疗失败 本研究表明, 几乎所有 MRSA 株是多重耐药菌, 目前临床较为理想的药物并不多 MRSA 的快速检 测, 可使临床医师及时选择有效抗生素, 治疗烧伤 MRSA 感染患者, 控制感染扩散 对 β 内酰胺抗生 素, 如青霉素和头孢菌素均不敏感, 对庆大霉素 环 丙沙星 大环内脂类 四环素类抗生素的敏感性很

5 中华损伤与修复杂志 ( 电子版 )2012 年第 7 卷第 6 期 ChinJInjuryRepairandWoundHealing(ElectronicEdition),December2012,Vol7,No 低, 但是, 至今尚无 MRSA 耐万古霉素 利奈唑胺和 替考拉宁的, 应是 MRSA 感染治疗的较好选择 因 此, 对于 MRSA 造成的烧伤严重感染, 应首选万古霉 素 替考拉宁或利奈唑胺, 而不考虑其他 β 内酰胺 类抗菌药物 多肽类抗生素万古霉素与细胞壁前体 肽聚糖结合, 阻断细胞壁合成造成细胞壁缺陷而杀灭细菌, 尤其对 MRSA 和 MRSE 有效 [7] 由于 MRSA 的多重耐药性, 对于 MRSA 感染患 者, 应注意将烧伤外科干预与抗生素应用相结合, 加 强对细菌耐药性产生的检测, 合理并慎用抗生 素 [8 9] 早期正确处理烧伤创面, 缩短住院时间, 及时治疗 MRSA 感染并控制其传播流行, 防止 MRSA 引起的医院感染 [10] 在烧伤后期残留创面中常可检出 MRSA 株, 且 往往表现出多重耐药, 抗感染治疗效果不佳, 治疗棘 手 可定期留取创面分泌物培养, 根据体外药敏鉴 定结果, 合理应用抗生素 ; 对于烧伤后期残留感染创 面可采用换药 浸浴水疗 植皮等综合治疗的方 法 [11], 不仅可以清洁创面 去除死皮 减少创面细菌 定植及细菌数量, 还能减少抗生素用量, 减少烧伤病区 MRSA 菌株引起的医院感染发生 发挥多重 PCR 微流体芯片检测新技术的优势, 同时快速检测 meca 与 fema 基因, 既可检测细菌耐 药性, 加强耐药菌株的监测, 指导临床医生正确使用 抗生素, 又能用于金黄色葡萄球菌与 CNS 种间鉴 别, 为临床诊断和治疗提供科学可靠依据, 更好地为 临床服务 参考文献 1 赵超莉, 谢卫国, 刘淑华, 等. 烧伤重症监护病房铜绿假单胞菌感染患者体外耐药性试验研究 [J/CD]. 中华损伤与修复杂志 : 电子版,2010,6(5):15. 2 刘敏, 史莉, 董明驹, 等. 耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌基因检测 [J]. 中华医院感染杂志,2009,19(1): 马晓波.mecA fema 基因与 MRSA 及 MRCNS 的相关性研究 [J]. 微生物学学免疫学进展,2006,36(4): 叶应妩, 王毓三, 申子瑜. 全国临床检验操作规程 [M].3 版. 南京 : 东南大学出版社,2006: 张秀珍, 陈东科, 胡云建, 等. 国产利福霉素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌及其他致病菌抗菌活性研究 [J]. 中华医院感染学杂志,2011,11(1): NationalCommiteeforClinicalLaboratoryStandards.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; fourteenth informationalsupplement[j].mi100s14,47.nccls, 杨宝峰. 药理学 [M].7 版. 北京 : 人民卫生出版社,2008: 戴睿, 谭明, 耿兴荣. 烧伤患者创面感染变化趋势及应对 [J]. 实用临床医学杂志,2009,13(21): 刘行超, 贺英, 李新军, 等. 烧伤患者大肠埃希氏菌和肺克超广谱 β 内酰胺酶检测及耐药性分析 [J]. 华南国防医学杂志, 2007,20(4): 冕生武. 烧伤创面耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染分析 [J]. 中华医院感染学杂志,2004,14(7): 赵鹏, 李笑丰, 程秀平. 烧伤残留创面金黄色葡萄球菌感染的综合治疗 [J/CD]. 中华损伤与修复杂志 : 电子版,2008,3(1):37. ( 收稿日期 : ) ( 本文编辑 : 蒋妍 ) 赵超莉, 谢卫国, 金文平, 等. 烧伤创面分离葡萄球菌 meca fema 基因检测及耐甲氧西林金黄色葡萄糖球菌耐药相关性研 究 [J/CD]. 中华损伤与修复杂志 : 电子版,2012,7(6):

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