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曲刘
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1 . 48. 中国抗生素杂志 8 年 4 月第 43 卷第 4 期文章编号 :-8689(8) 药理与临床 mazef 基因在肠球菌中的分布及与耐药的相关性研究张利霞王占黎,* 王翠峰胡同平徐军牛海英 3 邹绍伟菅建国 ( 内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院检验科, 包头 4; 内蒙古科技大学包头医学院第二附属医院检验科, 包头 43;3 内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院呼吸内科, 包头 4) 摘要 : 目的研究 mazef 基因在肠球菌临床分离株的分布特征, 并探讨其与肠球菌耐药的相关性方法收集包头地区 3 年月 6 年月临床来源的肠球菌 87 株, 随机选出 9 株作为实验菌株, 采用聚合酶链反应 (PCR) 法及基因测序技术检测 mazef 基因,VITEK- Compact 全自动微生物鉴定及药敏系统鉴定肠球菌并同步测定种抗菌药物 ( 氨苄西林青霉素四环素替加环素左氧氟沙星环丙沙星万古霉素利奈唑胺高水平庆大霉素和红霉素 ) 最低抑菌浓度 (minimal inhibititory concentration, MIC), 分析 mazef 基因在肠球菌基因组中的分布及与耐药之间的关联结果 9 株肠球菌属,mazEF 基因在肠球菌属基因组的阳性率为 86.7% 在对氨苄西林左氧氟沙星青霉素四环素高水平庆大霉素红霉素环丙沙星和万古霉素耐药的肠球菌中,mazEF 基因阳性率分别为 88.7% 86.% 89.% 84.6% 8.5% 85.% 89.4% 和 6.%, 敏感的肠球菌中,mazEF 基因阳性率分别 83.7% 87.5% 8.6% 9.% 94.4%.% 87.% 和 88.%, 耐药株和敏感株中,mazEF 基因阳性率无统计学差异 (P>.) 结论 mazef 基因在肠球菌基因组中分布的阳性率为 86.7%(78/9), 其分布与对氨苄西林左氧氟沙星青霉素四环素高水平庆大霉素红霉素和环丙沙星耐药无显著相关性, 与天然耐万古霉素也无显著相关性关键词 : 肠球菌属 ;mazef 基因 ; 耐药中图分类号 :R978. 文献标志码 :A Study on the distribution of mazef gene in enterococci and its relationship with drug resistance Zhang Li-xia, Wang Zhan-li, Wang Cui-feng, Hu Tong-ping, Xu Jun, Niu Hai-ying 3, Zou Shao-wei and Jian Jian-guo ( Department of Laboratory Medicine, the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science &Technology, Baotou 4; Department of Laboratory Medicine, the Second Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science &Technology, Baotou 43; 3 Department of Respiratory Medicine Medicine, the First Affiliated Hospital of Baotou Medical College, Inner Mongolia University of Science &Technology, Baotou 4) Abstract Objective To study the distribution of mazef gene in the clinical isolates of Enterococci and its relationship with drug resistance. Methods A total of 87 clinical isolates of enterococci were collected in Baotou from January 3 to December 6. 9 were selected for further detections and determinations of the distribution of mazef gene using PCR and gene sequencing methods. The isolates were identified as enterococci by conventional biochemical tests and VITEK Compact. The antimicrobial susceptibility of the isolates was determined using 收稿日期 :7-4-6 基金项目 : 内蒙古自治区高等学校青年科技英才支持计划项目 (No. NJYT-4-A3); 内蒙古自治区高等学校科学研究项目 (No. NJZY6); 包头医学院科学研究基金项目 (No. BYJJ-QM 64) 作者简介 : 张利霞, 女, 生于 976 年, 副主任检验师, 硕士, 主要从事细菌耐药机制研究, zhanglixia97638@63.com * 通讯作者, wang.zhanli@hotmail.com

2 mazef 基因在肠球菌中的分布及与耐药的相关性研究张利霞等 VITEK Compact. Results The mazef gene was found is 86.7% of the genomes in enterococcal isolates. The positive rate of mazef gene in the susceptible strains against ampicillin, levofloxacin, penicillin, tetracycline, highlevel gentamicin, erythromycin, ciprofloxacin, and vancomycin were 83.7%, 87.5%, 8.6%, 9.%, 94.4%,.%, 87.%, and 88.%, respectively. The positive rate of mazef gene in the resistant strains against the eight antibacterials mentioned above were 88.7%, 86.%, 89.%, 84.6%, 8.5%, 85.%, 89.4%, and 6.%, respectively. Conclusion There were no significant correlations between the distribution of mazef gene and resistance against ampicillin, levofloxacin, penicillin, tetracycline, high-level gentamicin, erythromycin, ciprofloxacin, and innate vancomycin. Key words Enterococcus; mazef gene; Resistance 肠球菌为条件致病菌, 近年来由于人口的老龄化介入性治疗手段的飞速发展广谱抗菌药物的不合理使用, 其引起的感染逐年增加, 耐药程度日趋严重 [] 尤其是耐万古霉素肠球菌的出现, 使得临床上抗菌药物选择更加局限耐药基因和致病基因分布的研究一直是探讨细菌耐药机制的重要方面 mazef 基因是细菌遗传物质中毒素 - 抗毒素基因, 可介导胁迫细菌细胞程序性死亡, 而且 mazef 的存在可以增加细菌对环境压力的耐受性, 参与抗生素引起的细胞死亡, 在细菌耐药性中发挥重要作用最新研究表明 mazef 基因与肠球菌的耐药密切相关, 但是肠球菌中 mazef 基因分布特征及与耐药性之间的详细情况尚不明确, 本研究中收集了包头地区有临床意义的肠球菌 87 株, 检测 mazef 基因在肠球菌基因组中的分布特征并探讨其与临床常用抗菌药物耐药间的相关性, 旨在为临床抗菌药物的选择提供更多理论参考资料与方法. 资料对象菌株来源 : 收集包头地区 3 年月 6 年月住院及门诊病人标本, 病人来自不同科室如泌尿外科肾内科肝胆外科神经内外科儿科 ICU 呼吸科和烧伤外科等, 标本有血尿皮肤伤口分泌物腹腔引流物胆汁及局部脓肿分泌物痰和其他体液标本留取过程规范, 送检及时, 剔除不符合标准者 ( 痰标本涂片应 : 上皮细胞 </HP, 白细胞 >5/HP), 结合临床及标本涂片确定感染菌, 剔除污染菌本课题共收集临床来源的肠球菌 87 株, 随机选出 9 株作为实验菌株, 其中屎肠球菌 (E. faecium)5 株粪肠球菌 (E. faecalis)3 株鸟肠球菌 (E. avium)3 株鹑鸡肠球菌 (E. gallinarum)4 株铅黄肠球菌 (E. casseliflavus) 株. 方法.. 肠球菌的培养与鉴定菌株接种哥伦比亚血琼脂培养基 (Columbia Agar + 5% sheep blood), 培养基购自法国 BioMerieux 公司 ( 上海 ),37 孵育培养 4h 后, 挑选可疑菌落, 经涂片革兰染色和触酶实验初步鉴定,VITEK 全自动微生物鉴定系统鉴定到种, 仪器购自 BioMerieux 公司, 难以鉴定的菌株采用 PCR 的方法进行鉴定.. 肠球菌的药敏实验采用法国 BioMerieux 公司生产的 VITEK- Compact 全自动微生物鉴定及药敏系统测定最低抑菌浓度 (minimal inhibititory concentration, MIC), 实验的 GP67 卡购自法国 BioMerieux 公司 ( 上海 ), 卡片的质控菌株是该公司推荐的金黄色葡萄球菌 (ATCC93) 万古霉素中介或耐药者以琼脂稀释试验证实, 其操作及判读严格按照美国临床实验室标准化研究 [3] 所 (CLSI)6 年标准, 替加环素的体外药敏实验及判读标准严格执行新型甘氨酰环素类抗菌药物替加环素的体外药物实验的操作规程 [4] 肠球菌药敏实验质控菌株执行 6 年 CLSI 标准, 采用粪肠球菌 (ATCC9) 及高浓度庆大霉素质控菌株 (ATCC599), 由卫生部临床检验中心提供..3 肠球菌基因组 DNA 提取在超净工作台或安全柜中, 取单克隆菌株, 接种于 5mL LB 液体培养基, 置于摇床中,37,r/min, 摇菌 6h 使用细菌基因组 DNA 提取试剂盒 ( 杭州宝赛生物科技有限公司提供 ), 按试剂盒说明书的操作步骤进行操作, 提取分离纯化后的细菌基因组 DNA..4 基因 mazef 引物两对引物见表, 参考国外文献 [5] 设计引物, 委托上海生工生物工程股份有限公司合成..5 PCR 反应体系及条件反应总体积为 5μL, 包括 Taq PCR MasterMix 5μL, 引物各 μl 模板( 基因组 μl),ddh O( 基因组 9μL) 循环条件:94 预变性 min,94 3s, 58 ( 退火温度随引物的不同而改变, 表 ) 3s,7 min,35 个循环, 最后 7 延长 5min 扩增产物在 % 琼脂糖凝胶,5V 电压电泳 3min, 将凝胶板置

3 中国抗生素杂志 8 年 4 月第 43 卷第 4 期表 mazef 基因 PCR 扩增引物序列 Tab. Primer sequence of PCR amplification of mazef gene mazef 引物序列 (5' 3') 产物大小 /bp T/ mazef A: F-CTTCGTTGCTCCTCTTGC A:R-CGTTGGGGAAATTCACCG ~58 mazef B:F-CAACTGTTCCTTTCTTCGTTGCTCC B:R-GATGATGAAGTGAAGATTGACCTGG ~58 于 54nm 波长紫外灯下进行观察, 全自动凝胶图像分析系统显像, 拍照并记录结果..6 DNA 测序基因组所有 PCR 阳性产物送上海生工生物工程股份有限公司测序,DNA 序列利用 NCBI( 网站的 Blastn 程序比对以确定基因序列..7 统计学方法实验数据采用 WHONET 5.6 软件进行耐药性分析和 χ 检验进行抗菌药物敏感株和耐药株 mazef 基因阳性率的比较结果. 菌株来源及分布实验收集肠球菌共 9 株, 其中屎肠球菌 5 株, 粪肠球菌 3 株, 占肠球菌属的 9.%, 临床分离菌株的主要标本来源为尿液 (5.%), 胆汁 (5.6%), 腹腔引流液 (7.8%), 其他较少, 具体见表. 肠球菌对种抗菌药物耐药性分析肠球菌对种常用抗菌药物耐药情况见表 3, 其中红霉素的耐药率最高 (88.9%), 未检出对利奈唑胺替加环素耐药的肠球菌, 万古霉素耐药株 5 株, 分别是 4 株鹑鸡肠球菌和株铅黄肠球菌, 均为天然耐药.3 基因 mazef 在肠球菌中的分布.3. A 引物扩增 mazef 基因其中 78 株扩增条带与目的条带分子量相符, 部分 PCR 产物电泳结果见图, 扩增产物的分子量大小 [5] 为 496bp, 与文献报道一致.3. B 引物扩增 mazef 基因其中 74 株扩增条带与目的条带分子量相符, 部分 PCR 产物电泳结果见图, 扩增产物的分子量大小 [5] 为 443bp, 与文献报道一致.4 基因测序部分测序结果见图 3 将 A B 引物扩增产物测序结果运用 blast 软件进行同源性比较, 同源性达到 99%.5 基因 mazef 的分布及与药敏的相关性在 9 株收集到的临床分离株中,mazEF 基因阳性标本有 78 株, 阳性率为 86.7%, 对 8 种抗菌药物敏感和耐药的菌株中 mazef 基因的阳性情况见表 3 结果表明对 8 种抗菌药物敏感和耐药的菌株中,mazEF 基因的阳性率差异均无统计学意义 (P>.), 因此本表临床来源的 9 株肠球菌菌株在临床标本中的分布 Tab. Distribution of Enterococcus species from various specimens of clinical (n=9) 肠球菌菌株 (n=7) 标本来源屎肠球菌粪肠球菌鸟肠球菌鹑鸡肠球菌铅黄肠球菌合计株数构成比 /% 株数构成比 /% 株数构成比 /% 株数构成比 /% 株数构成比 /% 株数构成比 /% 尿液胆汁腹腔引流液痰液血液脓伤口分泌物其他合计表 3 9 株肠球菌属细菌对常用种抗菌药物的耐药率 Tab. 3 The resistance rates of 9 strains of Enterococcus to antimicrobial agent 抗菌药物氨苄西林青霉素四环素左氧氟沙星万古霉素替加环素利奈唑胺环丙沙星高水平庆大霉素红霉素耐药株数耐药率 /%

mazef 基因在肠球菌中的分布及与耐药的相关性研究张利霞等 bp 6 5 4 3 注 :M:bp DNA marke;~: 代表菌株编号图 A 引物 mazef 基因 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图谱 Fig.

讨论 M 3 4 5 6 7 8 9. 485. 近年来研究表明, 肠球菌目前已成为医院感染的重要病原菌, 且临床分离常见的是粪肠球菌和屎肠球菌本研究 9 株肠球菌属中, 屎肠球菌 5 株, 粪肠球菌 3 株, 占肠球菌属 9.

95%, 其中耐药率最高的为红霉素, 与国内报道 [6] 一致, 未检出耐万古霉素的粪肠球菌和屎肠球菌, 低于国内报道据 6 年中国 CHINET 细菌耐药监测 [6] 网显示,5 年全国家医院检出 3949 株屎肠球, 95 株耐万古霉素, 耐药率.4%, 粪肠球对万古霉素的耐药率为.

4 mazef 基因在肠球菌中的分布及与耐药的相关性研究张利霞等 bp 注 :M:bp DNA marke;~: 代表菌株编号图 A 引物 mazef 基因 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图谱 Fig. Amplification products of mazef genes were separated by agarose gel electrophoresis use primers A 文认为 mazef 基因在肠球菌中的存在与肠球菌属耐氨苄西林青霉素四环素左氧氟沙星环丙沙星高水平庆大霉素红霉素和天然耐万古霉素无显著相关 3 讨论 M 近年来研究表明, 肠球菌目前已成为医院感染的重要病原菌, 且临床分离常见的是粪肠球菌和屎肠球菌本研究 9 株肠球菌属中, 屎肠球菌 5 株, 粪肠球菌 3 株, 占肠球菌属 9.% 菌株主要来源于尿液胆汁腹腔引流液等无菌部位非污染标本在精确鉴定的基础上, 采用可靠的药敏试验方法, 严格的判读标准进行药敏试验临床常用抗菌药物 : 氨苄西林青霉素四环素左氧氟沙星环丙沙星高水平庆大霉素和红霉素的耐药率分别为 58.9% 6.% 7.% 64.4% 65.6% 6% 和 88.95%, 其中耐药率最高的为红霉素, 与国内报道 [6] 一致, 未检出耐万古霉素的粪肠球菌和屎肠球菌, 低于国内报道据 6 年中国 CHINET 细菌耐药监测 [6] 网显示,5 年全国家医院检出 3949 株屎肠球, 95 株耐万古霉素, 耐药率.4%, 粪肠球对万古霉素的耐药率为.%(7/3363) mazef 基因是细菌毒素 - 抗毒素系统的一对重要 bp M 注 :M:bp DNA marker;5~7: 代表菌株编号图 B 引物 mazef 基因 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图谱 Fig. Amplification products of mazef genes were separated by agarose gel electrophoresis use primers B 图 3 菌株编号的一株粪肠球菌 mazef 基因测序图 Fig. 3 Sequence of mazef gene of Enterococcus faecalis strain

5 中国抗生素杂志 8 年 4 月第 43 卷第 4 期表 4 mazef 基因在肠球菌敏感株及耐药株中的分布情况 ( 利奈唑胺和替加环素无耐药株 ) Tab. 4 The posive rates of mazef in sensitive and resistant strains of Enterococcus 抗菌药物敏感株耐药株总株数阳性株数阳性率 /% 总株数阳性株数阳性率 /% c 值 P 值氨苄西林左氧氟沙星青霉素四环素高水平庆大红霉素环丙沙星万古霉素基因, 可以存在于细菌的染色体基因上, 也可以存在于质粒外源 DNA 岛如噬菌体转座子超级内 [7] 含子中它的存在可以增加细菌对环境压力的耐受性, 在细菌的生长调控和细胞的程序性死亡中发挥着重大作用, 也参与抗生素引起的细胞死亡, 与细菌耐药密切相关该基因最初是在革兰染色阴性的 [8] 大肠埃希菌中发现, 且研究较为深入然而 mazef 基因在其他病原菌中的真实身份及确切作用到目前 [9] 研究仍然较少 4 年,Sadeghifard 等提出 mazef 可能与肠球菌耐万古霉素相关,5 年,Soheili 等明确发现 mazef 是 (vancomycin resistant Enterococcus) VRE 的耐药基因, 并且沉默 mazef 基因后, 肠球菌相关毒力基因表达受抑 Soheili 等 PCR 分析结果表明,mazEF 基因存在于粪肠球菌和屎肠球菌的染色体和质粒上, 其中该基因在染色体上的阳性率为 59.4% 本课题组 A 引物扩增 mazef 基因, 扩增阳性为 78 株,B 引物扩增 mazef 基因, 阳性株数为 74 株, A B 引物同时扩增阳性的是 74 株, 另外 4 株虽然 B 引物扩增阴性, 但 A 引物扩增后, 电泳图谱条带清晰, 产物的分子量大小与之前的 74 株一致, 最后测序结果也证实为扩增阳性至于为何 B 引物扩增阳性株数会比 A 引物少了 4 株, 原因有待探讨我们的结果是临床来源肠球菌基因组 mazef 基因阳性率为 86.7%(78/9), 与国外文献报道有差异, 笔者认为菌株分布的地区差异可能是构成这一差别的主要原因, 本研究标本是来源于内蒙古包头市两所三甲综合型医院过去文献着重描述了 mazef 基因在肠球菌中的分布与粪肠球菌和屎肠球菌耐万古霉素的相关性, 遗憾的是, 本次研究我们未收集到耐万古霉素粪肠球菌和屎肠球菌, 只收集到天然耐万古霉素的鹑鸡肠球菌 4 株和铅黄肠球菌株那么 mazef 基因在肠球菌中的分布是否与肠球菌对其他抗菌药物耐药相关, 值得进一步研究本研究结果表明,mazEF 基因在肠球菌基因组中的分布与肠球菌耐氨苄西林青霉素四环素左氧氟沙星环丙沙星高水平庆大霉素红霉素天然耐万古霉素无显著相关性 mazef 基因在其他细菌的分布及与抗菌药物间的关联, 有待进一步探讨参考文献 [] 熊域皎, 贾蓓, 赵启全. 395 株临床分离肠球菌属细菌耐药性分析 [J]. 中国抗生素杂志, 4, 39(8): S-S5. Soheili S, Ghafourian S, Sekawi Z. The mazef toxinantitoxin system as an attractive target in clinical isolates of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis[j]. Drug Des Devel Ther, 5, 9: [3] Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing[s]. Twenty Third Informational Supplement, 6: M-6. [4] 王辉, 俞云松, 王明贵, 等. 替加环素体外药敏实验操作规程专家共识 [J]. 中华检验医杂志, 3, 3(7): [5] Moritz E M, Hergenrother P J. Toxin-antitoxin systems are ubiquitous and plasmid-encoded in vancomycin-resistant enterococci[j]. Proc Natl Acad Sci U S A, 7, 4(): [6] 胡付品, 朱德妹, 汪复, 等. 5 年中国 CHINET 细菌耐药性监测 [J]. 中国感染与化疗杂志, 6, 6(6): [7] Hazan R, Sat B, Engelbergkulka H. Escherichia coli mazef mediated cell death is triggered by various stressful conditions[j]. J Bacteriol, 4, 86(): [8] 叶露, 韦艳霞. 大肠埃希菌 TA 系统 mazef 的研究进展 [J]. Chin J Microecol,, 4(): [9] Sadeghifard N, Soheili S, Sekawi Z, et al. Is the mazef toxin-antitoxin system responsible for vancomycin resistance in clinical isolates of Enterococcus faecalis[j]. Gms Hyg Infect Contr, 4, 9(): Doc5.

Syngene GBOXHR Retsch MM400 KQ DE Eppendorf Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix No. 1 AMM2011_NMGTY Astr

Syngene GBOXHR Retsch MM400 KQ DE Eppendorf Table 1 The sources of Astragali Radix and Hedysarum Radix No. 1 AMM2011_NMGTY Astr PCR 龙平, 崔占虎, 李虔全, 徐建平, 张春红, 周立社 * *, 李旻辉 ( 包头医学院, 内蒙古包头 014060) DNA 30 28 DNA trnl-trnf PCR PCR 136 bp 323 bp 10% PCR PCR Astragalus membranaceus Fisch. Bge. var. mongho- licus Bge. Hsiao A. membranaceus