1036 第三军医大学学报,2016,38(9) htp://aammt.tmmu.edu.cn groupswerefound.mostmssastrainswereagrⅠ types(56.4%,31/55).thefrequencyofpvlcariagewas 49.1% (27/55)i

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亿奄稳闻人
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1 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2016,38(9) 1035 DOI: /j 乌鲁木齐地区金黄色葡萄球菌分离株的分子分型与耐药性分析杨延成 1, 程航 1, 胡珍 1, 袁文常 2, 尚伟龙 1, 饶青 1, 胡启文 1, 杨杰 1, 刘正祥 2, 袁吉振 1, 张骁鹏 1, 彭华刚 1, 刘慧 1, 朱军民 1, 伏建峰 2 1, 饶贤才 ( 重庆, 第三军医大学基础医学部微生物学教研室, 重庆市微生物工程实验室 1 ; 乌鲁木齐, 兰州军区乌鲁木齐总医院临床检验中心 2 ) [ 摘要 ] 目的了解乌鲁木齐地区金黄色葡萄球菌临床分离株的分子特征及其对临床常用抗生素的耐药情况方法收集 2010 年 6 月至 2012 年 12 月期间乌鲁木齐地区一所大型综合医院临床分离的 86 株金黄色葡萄球菌, 在鉴定区分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicilin resistantstaphylococus aureus,mrsa) 和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌 (methicilin susceptiblestaphylococusaureus,mssa) 的基础上, 应用 SCCmec 分型 spa 分型多位点序列分型 (multilocussequencetyping,mlst) 脉冲场凝胶电泳分型 (pulsed fieldgelelectrophoresis,pfge) agr 分型等葡萄球菌分子分型方法进行分析, 检测 pvl 毒力基因的携带率, 检测菌株对苯唑西林红霉素四环素等 13 种临床常用抗生素的耐药性, 分析菌株的耐药情况及耐药基因结果 86 株金葡菌中 31 株为 MRSA,55 株为 MSSA 31 株 MRSA 分为 8 种 spa 型和 7 种 ST 型, 优势流行克隆为 ST239 MRSA Ⅲ t030(71%,22/31) 55 株 MSSA 分为 23 种 spa 型 16 种 ST 型和 8 个 PFGE 聚类组,agrⅠ 型占 56.4% (31/55) MSSA 菌株的 pvl 毒力基因检出率为 49 1%(27/55),MRSA 为 38.7% (12/31) 药敏结果显示 31 株 MRSA 均为多重耐药 (multidrug resistant,mdr) 菌株,55 株 MSSA 中有 31 株为 MDR 菌株结论乌鲁木齐地区流行的 MRSA 以 ST239 MRSA Ⅲ t030 为主, 而 MSSA 表现出较高遗传多样性, 发现有 t11413,st121 等新的型别流行 [ 关键词 ] 金黄色葡萄球菌 ; 分子分型 ; 耐药谱 ; 多重耐药 ; 乌鲁木齐 [ 中图法分类号 ] R181.34,R372,R [ 文献标志码 ] A Moleculartypingand antimicrobialresistancesofstaphylococcusaureusisolated from ahospitalinurumqi,china YangYancheng 1,ChengHang 1,HuZhen 1,YuanWenchang 2,ShangWeilong 1,RaoQing 1,HuQiwen 1,YangJie 1, LiuZhengxiang 2,YuanJizhen 1,ZhangXiaopeng 1,PengHuagang 1,LiuHui 1,ZhuJunmin 1,FuJianfeng 2,Rao Xiancai 1 ( 1 DepartmentofMicrobiology,ChongqingLaboratoryofMicrobiologicalEngineering,ColegeofBasicMedical Sciences,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing,400038; 2 ClinicalLaboratoryDiagnosticCenter,Urumqi GeneralHospitalofLanzhouMilitaryCommand,Urumqi,XinjiangUygurAutonomousRegion,830000,China) [Abstract] Objective TodeterminethemoleculartypesandresistanceofStaphylococusaureus(S. aureus)strainstocommonlyusedantibioticsisolatedinurumqi,china.methods Atotalof86S.aureus isolateswerecolectedfrom alarge scalegeneralhospitalinurumqiduringjune2010anddecember2012. Themethicilin resistants.aureus(mrsa)andmethicilin susceptibles.aureus(mssa)weredetermined. Themoleculartyping,includingstaphylococcalcasetechromosomemec(SCCmec)typing,staphylococcal proteina(spa)genetyping,multilocussequencetyping(mlst),pulsed fieldgelelectrophoresis(pfge), andaccesorygeneregulator(agr)typingwereappliedforthestrains.thecariageofpanton Valentine Leukocidin(pvl)genesanddrugsusceptibilitiesofS.aureusstrainsagainst13kindsofantibioticswere determined.results In the86 S. aureusisolates,31 weremrsa (36.0%) and55 weremssa (64 0%).TheMRSAstrainsweredividedinto8spatypesand7STtypes,ST239 MRSA Ⅲ t030wasthe mostprevalentclone(71%,22/31).among55mssa strains,23spatypes,16sttypesand8pfge [ 基金项目 ] 国家自然科学基金面上项目 ( ) [ 通信作者 ] 饶贤才, 电话 :(023) ,E mail:raoxiancai@126.com [ 优先出版 ] htp:// )

2 1036 第三军医大学学报,2016,38(9) htp://aammt.tmmu.edu.cn groupswerefound.mostmssastrainswereagrⅠ types(56.4%,31/55).thefrequencyofpvlcariagewas 49.1% (27/55)inMSSA strains,andwas38.7% (12/31)inMRSA strains.almrsa strainswere multidrug resistant(mdr), whereas31 outofthe55 MSSA strains(56.4%) belonged tomdr. Conclusion ST239 MRSA Ⅲ t030isstilthemostpredominantmrsainurumqi.mssaisolatesshowwide geneticdiversity.newtypest11413andst121arealsodominant. [Key words] Staphylococusaureus; molecularcharacterization; drug susceptibility testing; multidrug resistance;urumqi SupportedbytheGeneralProgramofNationalNaturalScienceFoundationofChina( ).Corespondingauthor:RaoXiancai,E 金黄色葡萄球菌 (Staphylococusaureus), 简称金葡菌, 是一种重要的人类机会致病菌, 常引起皮肤软组织感染, 关节骨感染, 心内膜炎败血症以及中毒性休克等多种疾病, 病死率高 [1] 明确特定区域的金葡菌主要流行克隆切断其传播途径终止耐药菌株在人群中传播是控制金葡菌流行的重要策略, 故检测金葡菌流行菌株的分子特征及耐药谱对控制金葡菌感染有重要意义按菌株耐药性的差异, 金葡菌通常被分为耐甲氧西林金葡菌 (methicilin resistants.aureus,mrsa) 和甲氧西林敏感金葡菌 (methicilin susceptibles.au reus,mssa), 其区别在于前者染色体中携带一葡萄球菌盒式染色体 (staphylococcalcasetechromosomemec, SCCmec), 其中的耐药基因 meca 可编码对甲氧西林等 β 内酰胺类抗生素耐药的决定簇, 介导 MRSA 的耐药性多种分子分型技术, 如脉冲场凝胶电泳 (PFGE), 多位点序列分析 (MLST), 葡萄球菌 A 蛋白 (spa) 基因分型以及附属基因调节子 (agr) 分型等已被广泛应用于 MRSA 的进化和流行病学研究 [2-5] 研究证实, ST5,ST239 和 ST8 是世界范围内流行的主要 MRSA 克隆群 [6] 在我国,MRSA 分离率虽因地区不同而有较大差异, 总体上约占金葡菌感染的 60% 左右,ST239 和 ST5 也是我国 MRSA 优势流行克隆 [7-8] ;MSSA 在我国占金葡菌感染的 40% 左右, 但目前对 MSSA 的研究报道非常有限, 相对于 MRSA 而言, 通常认为 MSSA 不存在优势克隆, 而表现出更高的遗传多样性及更高的毒力因子表达 [9-10], 并且与菌血症心内膜炎以及败血症关联更密切 [11] 葡萄球菌杀白细胞毒素(Panton Valentineleucocidin,PVL) 是由 luks lukf 两个基因编码的双组份细胞成孔毒素, 可破坏中性粒细胞单核细胞和巨噬细胞等免疫细胞, 在金葡菌感染过程中起重要作用, 也是评价金葡菌毒力的常用指标之一 [12-14] 自 1961 年发现 MRSA 以来, 耐药金葡菌感染一直倍受关注 [3,5] 分子流行病学研究表明,MRSA 菌通常携带较多的耐药基因, 毒力较弱, 常引起医院内感染 ; 而 MSSA 菌携带的耐药基因较少, 毒力较强, 常引起社区人群感染 [6-7] 在本研究中, 我们运用多种金葡菌分子分型方法, 结合 pvl 毒力基因检测和耐药谱分析, 对 2010 年 6 月至 2012 年 12 月从乌鲁木齐地区分离的 86 株金葡菌进行了分析研究, 不仅从一定程度上揭示了我国西北地区金葡菌的流行特征, 而且可为我国其他地区金葡菌感染和流行的检测提供借鉴 1 材料与方法 1.1 材料菌株来源 86 株金葡菌分离自乌鲁木齐地区的一所综合教学医院, 主要源自 2010 年 6 月至 2012 年 12 月期间 86 位住院患者的分泌物痰液血液脓等标本其分离的标本类型和科室来源见表 1 表 1 金葡菌临床分离株的科室来源和标本类型科室菌株总数标本类型及标本数 (MRSA 菌株数 / 分泌物痰液血液其他 MSSA 菌株数 ) 标本数标本数标本数标本数骨科 12(5/7) 烧伤整形科 10(10/0) 神经外科 3(2/1) 耳鼻喉科 5(1/4) 颌面外科 5(0/5) 创伤科 4(1/3) 泌尿外科 1(0/1) 普外科 2(1/1) 急诊科 2(1/1) ICU 3(2/1) 血液科 3(0/3) 肿瘤科 3(0/3) 呼吸内科 4(2/2) 消化内科 1(0/1) 神经内科 2(1/1) 心血管内科 1(0/1) 中医科 2(0/2) 肾病科 1(0/1) 干部科 6(2/4) 儿科 4(0/4) 综合科 1(0/1) 门诊 11(3/8) 合计 86(31/55)

3 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2016,38(9) 仪器与试剂 Bio RadPCR 仪,Bio Rad 垂直电泳仪,Bio Rad 凝胶成像仪,Bio Rad 凝胶脉冲场电泳仪,Bio Fosum 微生物鉴定药敏分析仪 ( 上海复星佰珞公司 );OXOIDTryptoneSoyaBroth(TSB) 培养基引物分子分型及毒力耐药基因检测引物均参照文献设计 [15-22], 由华大基因合成 1.2 方法细菌培养基因组制备及菌株鉴定细菌的分离培养按全国临床检验操作规程进行, 按照文献所述方法提取基因组 DNA [23] 金葡菌及 MRSA [24] MSSA 的鉴定参照文献所述, 通过 PCR 方法检测金葡菌分离菌株的 meca 与 femb 基因若 femb 基因为阳性,mecA 基因为阴性则判断为 MSSA 菌株 ; 若 meca 与 femb 基因皆为阳性, 则判断为 MRSA 菌株 MRSA 菌株的 SCCmec 分型根据文献 [16] 所述方法, 应用 5 对特异性引物通过 PCR 方法扩增 MRSA 菌株基因组, 对菌株进行 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ 和 Ⅴ 型的 SCCmec 分型, 未扩增出特异性条带或者扩增出条带不符合判定标准的判定为未定型别 (non typable,nt) spa 分型用特异性引物通过 PCR 扩增出金葡菌 spa 基因的 X 区 [17,25],PCR 产物送上海英俊生物技术服务公司测序, 将获得的序列提交 spa 基因分型数据库 (htp:// 参照已公布的重复序列, 根据重复序列出现的次数和排列方式确定 spa 型别 [26] MLST 分型采用 PCR 的方法分别扩增金葡菌 7 个看家基因 (arc aroe glp gmk pta tpi yqil) 序列, 产物送上海英俊生物技术服务公司测序, 所获序列提交 MLST 数据库 (htp://saureus.mlst.net/) 进行分析得出其 MLST 型别, 即序列型 (sequencetype, ST) [15] 因 MSSA 菌株存在遗传多样性, 定义所占比例 5% 以上的 ST 型为主要流行型别,spa 主要流行型别同样如此定义 MSSA 菌株的 agr 分型参照文献 [19] 所述方法, 通过多重 PCR 扩增 MSSA 菌株基因组,PCR 产物进行电泳, 和 659bp 大小的条带分别代表 agrⅠ 型 Ⅱ 型 Ⅲ 型和 Ⅳ 型脉冲场凝胶电泳 (PFGE) 分析按照文献 [27] 所述, 将新鲜培养的金葡菌包埋于 1% 低熔点琼脂中, 然后用溶葡萄球菌素及溶菌酶进行破壁, 蛋白酶 K 消化, 最后经限制性内切酶 SmaⅠ 酶切后制胶电泳结果用软件 BioNumericsversion6.6(AppliedMaths) 进行聚类分析, 将同源性超过 90% 者定义为同一型 pvl 毒力基因及耐药基因检测通过 PCR 方法, 分别用特异性引物扩增所有金葡菌的 pvl 基因 [21], 以及 MSSA 菌株的青霉素耐药基因 blaz 和红霉素克林霉素耐药基因 erma ermc [20,22],PCR 产物经电泳进行判断药敏实验菌株的耐药情况用 Bio Fosum 微生物鉴定药敏分析仪 ( 上海复星佰珞公司 ) 进行测定, 按照美国临床实验室标准化协会 (CLSI)2011 出版的琼脂稀释法药敏实验解释标准判断菌株对抗生素的耐药状态 [28], 以耐药 (R) 和敏感 (S) 表示按照文献 [29], 某株金葡菌如果对至少三类抗生素耐药 ( 每类抗生素中至少有一种代表药物耐药 ), 则定义该菌株为多重耐药 (multidrug resistant,mdr) 菌株 2 结果 2.1 MRSA 与 MSSA 鉴定 86 株临床金葡菌经 PCR 扩增 meca 和 femb 基因检出 MRSA 菌株 31 株, 占 36.0%,MSSA 菌株 55 株, 占 64.0% 2.2 分子分型 MRSA 菌株的 SCCmec 分型 31 株 MRSA 菌株经多重 PCR 扩增, 检出 SCCmecⅢ 型 25 株 (80 6% ),SCCmecⅤ 型 4 株 (12.9%),SCCmecⅠ 型 1 株 (3.2%), 未分型 1 株 (3.2%) 见表 spa 分型对扩增产物的测序结果进行分析,86 株金葡菌株可分为 31 种 spa 基因型 ( 表 2) 其中 31 株 MRSA 分为 8 种 spa 基因型, 优势型别为 t030 (71.0%,22/31);55 株 MSSA 分为 23 种 spa 基因型, 主要型别有 t11413(18.2%,10/55),t571(9.1%, 5/55),t030(9.1%,5/55),t2592(9.1%,5/55),t284 (7.3%,4/55),t002(5.5%,3/55) 另外有两株 MSSA 菌株未能分型, 可能为新的 spa 型别 MLST 分型 86 株金葡菌可分为 23 种 ST 型 ( 表 2) 在 31 株 MRSA 中, 优势型别为 ST239 (71 0%,22/31), 且均为 spat030 型, 另外发现 6 种 ST 型和 1 种新的 ST 型 ;55 株 MSSA 分为 16 种 ST 型, 主要型别有 ST22(21.8%,12/55),ST121(18.2%,10/ 55),ST88(9.1%,5/55),ST15(9.1%,5/55),ST398 (7 3%,4/55) 和 ST1920(5.5%,3/55) agr 分型将 55 株 MSSA 菌株进行 agr 分型,agrⅠ 占 56.4% (31/55),agrⅡ 占 12.7%(7/55), agrⅢ 占 16.4%(9/55),agrⅣ 为 14.5%(8/55) 7 株 agrⅡ 型菌株有 5 株为 ST15 型,2 株为 ST5 型 ;8 株 agr Ⅳ 菌株均为 ST121 型 PFGE 分型 MSSA 菌株基因组 DNA 经 SmaⅠ 酶切后,DNA 大片段可得到很好的分离, 聚类分析表明 55 株 MSSA 菌株可分为 8 个聚类组, 依次命名为 A~H 型, 见图 1 其中 F 型,B 型,A 型为优势型

1038 第三军医大学学报,2016,38(9) htp://aammt.tmmu.edu.cn 别, 分别占 34.5% (19/55),18.2% (10/55), 和 16 4% (9/55) 此外,4 株 ST398 菌株未能分型, 可能因为这些菌株的基因组存在 DNA 甲基化而导致不能被 SmaⅠ 酶切和分离 [30] 2.2.6 pvl 基因检测 31 株 MRSA 菌株中,pvl 毒力基因检出率为 38.

4 1038 第三军医大学学报,2016,38(9) htp://aammt.tmmu.edu.cn 别, 分别占 34.5% (19/55),18.2% (10/55), 和 16 4% (9/55) 此外,4 株 ST398 菌株未能分型, 可能因为这些菌株的基因组存在 DNA 甲基化而导致不能被 SmaⅠ 酶切和分离 [30] pvl 基因检测 31 株 MRSA 菌株中,pvl 毒力基因检出率为 38.7%(12/31),12 株 pvl 阳性菌株中有 10 株为 ST239 型, 表明乌鲁木齐地区主要流行克隆 ST239 有较高的 pvl 毒力基因携带率 (45.5%,10/22); 55 株 MSSA 菌株中有 27 株为 pvl 阳性 (49.1%), 其中 ST121 型有 8 株,ST22 型有 10 株 ( 表 2), 可见 MSSA 菌株中,ST121(80.0%,8/10) 和 ST22(83.3%,10/ 12) 有较高的 pvl 毒力基因携带率表 2 MRSA/MSSA 的分子分型菌株类型 MLST 型别 spa 型别 SCCmec 型别 agr 型别 pvl+ 菌株数 MRSA(31) ST239(22) t030(22) Ⅲ(22) 10 ST5(2) t002(2) Ⅲ(2) 0 ST188(2) t189(2) Ⅴ(2) 1 ST22(1) t11413(1) Ⅴ(1) 1 ST59(1) t437(1) Ⅴ(1) 0 ST217(1) t3668(1) Ⅰ(1) 0 ST398(1) t034(1) Ⅲ(1) 0 new(1) t2592(1) 未分型 0 MSSA(55) ST22(12) t11413(9),t571(1),t284(1),new(1) Ⅰ(12) 10 ST121(10) t284(3),t030(2),t159(2),t435(2),t850(1) Ⅳ(8),Ⅰ(2) 8 ST88(5) t2592(5) Ⅲ(5) 3 ST15(5) t002(1),t571(1),t2325(1),t11518(1),new(1) Ⅱ(5) 0 ST398(4) t571(2),t030(1),t2876(1) Ⅰ(4) 1 ST1920(3) t5356(2),t030(1) Ⅲ(2),Ⅰ(1) 0 ST217(2) t571(1),t11413(1) Ⅰ(2) 0 ST5(2) t002(2) Ⅱ(2) 1 ST59(2) t163(1),t172(1) Ⅰ(2) 0 ST630(2) t377(2) Ⅰ(2) 0 ST7(2) t2663(1),t6193(1) Ⅰ(2) 1 ST97(2) t267(1),t359(1) Ⅰ(2) 1 ST1(1) t127(1) Ⅲ(1) 1 ST188(1) t030(1) Ⅰ(1) 0 ST30(1) t1130(1) Ⅲ(1) 1 ST943(1) t2617(1) Ⅰ(1) 0 PFGE 型别 MLST 型别 spa 型别 agr 型别 pvl+ 菌株数 MDR 菌株数 A(9) B(10) ST22(4),ST1(1),ST5(1),ST7(1), ST188(1),ST1920(1) ST15(3),ST88(2),ST630(2),ST5 (1),ST22(1),ST59(1) t11413(2),t030(2),t002(1),t127(1), Ⅰ(7),Ⅱ(1),Ⅲ(1) 5 3 t571(1),t6193(1), 未分 (1) t377(2),t2592(2),t002(1),t163(1),t571 Ⅰ(4),Ⅱ(4),Ⅲ(2) 1 5 (1),t2325(1),t11413(1), 未分 (1) C(3) ST15(1),ST88(1),ST1920(1) t002(1),t2592(1),t5356(1) Ⅲ(2),Ⅱ(1) 1 2 D(3) ST59(1),ST97(1),ST121(1) t172(1),t267(1),t435(1) Ⅰ(2),Ⅳ(1) 2 0 E(1) ST88(1) t2592(1) Ⅲ(1) 1 1 F(19) ST121(9),ST22(5),ST217(2),ST15 t11413(6),t284(3),t030(2),t159(2), Ⅰ(10),Ⅳ(7),Ⅱ(1), t435(1),t571(1),t850(1),t1130(1), (1),ST30(1),ST943(1) Ⅲ(1) t2617(1),t11518(1) G(3) ST22(1),ST97(1),ST1920(1) t359(1),t5356(1),t11413(1) Ⅰ(2),Ⅲ(1) 1 0 H(3) ST7(1),ST22(1),ST88(1) t284(1),t2663(1),t2592(1) Ⅰ(2),Ⅲ(1) 3 2 图 1 51 株 MSSA 菌株的分子分型结果及其多重耐药菌检出情况 ( 除去 4 株 PFGE 未分型菌株, 括号内数字为菌株数 )

5 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2016,38(9) 药敏实验分析 86 株金葡菌对 13 种抗生素的药敏实验结果见表 3 MRSA 对糖肽类抗生素 ( 万古霉素替考拉宁 ) 全部敏感, 仅有 1 株菌株对利奈唑胺耐药,2 株对复方新诺明耐药, 但是对其余被检抗生素的耐药率则较高 ( 表 3) 相对于 MRSA 菌株而言,MSSA 菌株对大多数抗生素敏感, 但是对复方新诺明的耐药率 (18.2%, 10/55) 高于 MRSA 菌株 (6.5%,2/31) 此外,MSSA 菌株主要对青霉素红霉素克林霉素 3 种抗生素耐药, 耐药率分别为 89.1%(49/55),67.3%(37/55) 和 63 6%(35/55)( 表 3) 表 3 金葡菌临床分离株抗生素药敏实验结果 ( 耐药菌株数 / 菌株数 ) 抗生素类别抗生素 MRSA 耐药率 MSSA 耐药率 β 内酰胺类苯唑西林 (OXA) 90.3(28/31) 0 青霉素 (PEN) 100(31/31) 89.1(49/55) 氨基糖苷类庆大霉素 (GEN) 87.1(27/31) 5.5(3/55) 糖肽类万古霉素 (VAN) 0 0 替考拉宁 (TEC) 0 0 利福霉素类利福平 (RIF) 83.9(26/31) 0 四环素类四环素 (TET) 87.1(27/31) 12.7(7/55) 喹诺酮类环丙沙星 (CIP) 87.1(27/31) 5.5(3/55) 左氧佛沙星 (LEV) 83.9(26/31) 1.8(1/55) 林可胺类克林霉素 (CLI) 71.0(22/31) 63.6(35/55) 大环内酯类红霉素 (ERY) 74.2(23/31) 67.3(37/55) 磺胺类复方新诺明 (SXT) 6.5(2/31) 18.2(10/55) 唑烷酮类利奈唑胺 (LZD) 3.2(1/31) MDR 菌株的耐药谱及分子特点所有的 MRSA 菌株均为 MDR 菌株, 而 55 株 MSSA 菌株中有 31 株为 MDR 菌株 22 株 ST239 MRSA 菌株有共同的耐药谱 PEN/CIP/GEN/RIF/TET/ LEV( 表 3) 31 株 MSSA 多重耐药菌株中, 有 23 株对三类抗生素耐药, 并且耐药谱都为 PEN/ERY/CLI ( 表 4), 相应的 31 株 MDR 菌株青霉素红霉素克林霉素耐药基因检出率分别为 blaz(100%,31/31), ermc(96.8%,30/31),erma(12.9%,4/31), 另外有 8 株 MSSA 对四类以上的抗生素耐药 10 株 ST121 菌株中有 8 株为 MDR 菌株 ;4 株 ST398 菌株中有 2 株对四类以上抗生素耐药, 其中 1 株对 6 类抗生素耐药 (PEN/ERY/CLI/SXT/CIP/TET), 并且对左氧佛沙星和庆大霉素中介耐药在 19 株 PFGE 聚类组 F 型菌株中有 16 株为 MDR 菌株, 远高于其他聚类组 3 讨论自 20 世纪 80 年代开始,MRSA 因其具有较强的外界环境适应能力和定植能力, 以及对抗生素的耐受能力, 在全球范围内迅速传播, 成为医院和社区感染的重要病原菌在我国, 临床金葡菌中的 MRSA 检出率从 1980 年的 20% 迅速升高到 2008 年的约 60% [31], 且不同地区存在较大差异, 引起了国内科技工作者的高度关注近年来的研究发现 ST239 MRSA Ⅲ t030/ t037 ST5 MRSA Ⅱ t002 是我国 MRSA 优势流行型别 [7-8] 本研究中, 来自乌鲁木齐地区的 MRSA 检出表 4 MSSA 多重耐药菌株株耐药谱及其分子特点 ( 括号内数字为菌株数 ) 耐药谱 MLST 型别 spa 型别 agr 型别 PFGE 型别 pvl+ 菌株数 PEN/ERY/CLI(23) ST121(7) t284(3),t030(1),t159(1),t435(1),t850(1) Ⅳ(6),Ⅰ(1) F(7) 6 ST22(6) t11413(4),t284(1),new(1) Ⅰ(6) A(1),B(1),F(3),J(1) 5 ST15(2) t571(1),t11518(1) Ⅱ(2) B(1),F(1) 0 ST88(2) t2592(2) Ⅲ(2) C(1),J(1) 2 ST217(2) t571(1),t11413(1) Ⅰ(2) F(2) 0 ST1(1) t127(1) Ⅲ(1) A(1) 1 ST5(1) t002(1) Ⅱ(1) A(1) 1 ST630(1) t377(1) Ⅰ(1) B(1) 0 ST943(1) t2617(1) Ⅰ(1) F(1) 0 PEN/ERY/CLI/SXT(3) ST88(1),ST59(1),ST398(1) t163(1),t2592(1),t2876(1) Ⅰ(2),Ⅲ(1) B(1),E(1) 1 PEN/ERY/CLI/TET(2) ST30(1),ST121(1) t030(1),t1130(1) Ⅰ(1),Ⅲ(1) F(2) 2 PEN/ERY/CLI/CIP(1) ST630(1) t377(1) Ⅰ(1) B(1) 0 PEN/ERY/CLI/SXT/GEN(1) ST1920(1) t5356(1) Ⅲ(1) C(1) 0 PEN/ERY/CLI/SXT/CIP/TET(1) ST398(1) t030(1) Ⅰ(1) 未分型 0 PEN: 青霉素 ;ERY: 红霉素 ;CLI: 克林霉素 ;SXT: 复方新诺明 ;CIP: 环丙沙星 ;TET: 四环素

6 1040 第三军医大学学报,2016,38(9) htp://aammt.tmmu.edu.cn 率为 36%(31/86), 低于全国平均水平, 该地区的 MRSA 优势流行型别为 ST239 MRSA Ⅲ t030(71%,22/ 31), 这些结果与文献 [32] 报道的对乌鲁木齐地区 MRSA 研究结果相一致 ST239 MRSA Ⅲ 源于 Brazili/ Hungarian 克隆株, 首先发现于巴西 [33], 随后蔓延到邻近的南美和欧洲一些国家, 并很快取代了当地流行克隆成为优势克隆,ST239 也是大部分亚洲国家的主要流行克隆 [34] 在 2000 年之前,ST239 t037 是我国的主要克隆, 但是后来逐渐被 ST239 t030 取代 [35], 本研究中 ST239 t030 仍然是最优势克隆, 未检出 ST239 t037 菌株, 这可能是因为 ST239 t030 型菌株在乌鲁木齐地区有更强的适应能力和传播能力药敏试验结果表明,ST239 MRSA Ⅲ 型金葡菌有共同的耐药谱 OXA/ PEN/CIP/GEN/RIF/TET/LEV, 对红霉素克林霉素也表现出较高程度的耐药相对于 MRSA 而言,MSSA 菌株拥有更高的遗传多样性 [36], 在我国的研究报道中, 主要的 MSSA 型别因地区不同而差异较大 [35,37] 本研究中 55 株 MSSA 菌株可分为 16 种 ST 型别和 23 种 spa 型, 相对于 MRSA 菌株 (6 种 ST 型别,8 种 spa 型 ) 来看,MSSA 具有更多的克隆多态性 t11413 t571 t030 t2592 t284 和 t002 是主要的 spa 型别, 而 ST22 ST121 ST88 ST15 ST398 和 ST1920 是主要的 MLST 型别其中 t11413 ST121 在以前我国的研究中鲜有报道, 可能是在乌鲁木齐地区新流行的克隆 t571 型 MSSA 一般与 ST398 相关联, 是欧洲及我国牲畜来源的主要流行克隆群, 常引起皮肤和软组织感染 [38] t2592 型 MSSA 主要在我国东北地区流行 [39], 本研究中有 5 株此型菌株检出, 成为乌鲁木齐地区主要克隆群, 并且都为 ST88 agrⅢ 型 ST121 是在全球广泛分布的社区获得性克隆群, 因其高毒力而引起研究者关注 [40] 我国对于 ST121 金葡菌的报道较少, 在本研究中, 有 10 株 MSSA 菌株检测为 ST121 型 (18.2%,10/55), 成为主要流行克隆群, 并且有 8 株携带 pvl 毒力基因 (80.0%,8/10), 高 pvl 携带率可能是 ST121 型 MSSA 具有高毒力的重要因素之一 agr 系统位于金葡菌基因组的核心区域, 因此一般与菌株的 MLST 型别相关联本研究中发现,agrⅠ 为 MSSA 主要型别, 并且与 ST22 ST398 型别相关 ;agr Ⅱ 型与 ST15 ST5 型相对应 ;agrⅢ 主要为 ST88 型 ; 8 株 agrⅣ 型菌株都为 ST121 型, 这些结果与文献 [38,41] 报道相一致本研究还发现 MSSA 的 pvl 携带率 (49.1%) 高于 MRSA(38.7%) 菌株, 尤其以 MSSA 菌株 ST22(83.3%,10/12) 和 ST121(80%, 8/10) 的 pvl 阳性率为突出, 提示在乌鲁木齐地区应重点加强对这些菌株所致临床感染的防控在欧美地区, 临床分离的 MSSA 对除青霉素之外的大多数常用抗生素敏感 [36,42], 因此 MSSA 的耐药情况并未引起足够重视在我国的报道中, 已发现 MSSA 除对青霉素耐药外, 还对红霉素克林霉素等存在不同程度的耐药 [39] 在本研究的 55 株 MSSA 菌株中检出了高比例的多重耐药菌株 (56.4%,31/55), 这些 MDR 菌有共同的耐药谱 PEN/ERY/CLI 31 株 MDR 中有 23 株对三类抗生素耐药,6 株对四类抗生素耐药,1 株耐五类抗生素, 另外有 1 株菌株对六类抗生素耐药, 提示 MSSA 的耐药性在乌鲁木齐地区不容乐观 MSSA 菌株对复方新诺明的耐药率 (18.2%,10/ 55) 高于 MRSA 菌株 (6.5%,2/31);10 株 ST121 型菌株有 7 株 ( 均为 pvl 阳性 ) 为多重耐药菌株, 此型菌株在乌鲁木齐地区的流行可能与其高毒力多重耐药相关综上所述, 本研究在一定程度上揭示了乌鲁木齐地区 MRSA 和 MSSA 的种群分子特征及耐药情况, 其中 MRSA 以 ST239 MRSA Ⅲ t030 占绝对优势 ; 而 MSSA 分子型别则呈现出多样性,ST121 ST22 成为该地区的优势克隆, 并且表现出高毒力高耐药性罕见报道的 spa 型别 t11413 在本研究的 MSSA 中检出比例最高, 对于其来源还需进一步研究我们的研究提示, 在我国金葡菌感染的防控中, 除关注 MRSA 外,MSSA 以其较高的毒力以及越来越严峻的耐药形势同样需要给予高度重视参考文献 : [1] LowyFD.Staphylococusaureusinfections[J].N EnglJ Med,1998,339(8): DOI: /NE JM [2] RobinsonD A,EnrightM C.Evolutionarymodelsofthe emergenceofmethicilin resistantstaphylococusaureus[j]. AntimicrobAgentsChemother,2003,47(12): [3]StefaniS,ChungDR,LindsayJA,etal.Meticilin resist antstaphylococusaureus(mrsa):globalepidemiologyand harmonisation oftyping methods[j]. IntJ Antimicrob Agents,2012,39(4): DOI: /j.ijantim icag [4]DeurenbergRH,StobberinghEE.TheevolutionofStaphy lococusaureus[j].infectgenetevol,2008,8(6): doi: /j.meegid [5]EnrightMC,RobinsonDA,RandleG,etal.Theevolution

7 htp://aammt.tmmu.edu.cn 第三军医大学学报,2016,38(9) 1041 aryhistoryofmethicilin resistantstaphylococusaureus(mr SA)[J].ProcNatlAcadSciUSA,2002,99(11): DOI: /pnas [6]ChambersHF,DeleoFR.Wavesofresistance:Staphylococ cusaureusintheantibioticera[j].natrevmicrobiol, 2009,7(9): DOI: /nrmicro2200 [7] ChengH,YuanW,ZengF,etal.Molecularandphenotypic evidenceforthespreadofthreemajormethicilin resistant Staphylococusaureusclonesasociatedwithtwocharacteristic antimicrobialresistanceprofilesinchina[j].jantimicrob Chemother,2013,68(11): DOI: / jac/dkt213 [8] LiuY,WangH,DuN,etal.Molecularevidenceforspread oftwomajormethicilin resistantstaphylococusaureusclones withauniquegeographicdistributioninchinesehospitals [J].AntimicrobAgentsChemother,2009,53(2): DOI: /AAC [9]GrundmannH,AanensenDM,van den WijngaardCC,et al.geographicdistributionofstaphylococusaureuscausing invasiveinfectionsineurope:amolecular epidemiologicala nalysis[j].plosmed,2010,7(1):e doi: /journal.pmed [10] LiuM,LiuJ,GuoY,etal.Characterizationofvirulence factorsandgeneticbackgroundofstaphylococusaureusiso latedfrom PekingUniversityPeople shospitalbetween 2005and2009[J].CurMicrobiol,2010,61(5): DOI: /s [11]DavidMZ,Boyle VavraS,ZychowskiDL,etal.Methicil lin susceptiblestaphylococusaureusasa predominantly healthcare asociatedpathogen:aposiblereversalofroles? [J].PLoSOne,2011,6(4):e18217.DOI: / journal.pone [12] YoongP,ToresVJ.TheefectsofStaphylococusaureus leukotoxinsonthehost:cellysisandbeyond[j].cur OpinMicrobiol,2013,16(1):63-69.DOI: /j. mib [13]GoeringRV,ShawarRM,ScangarelaNE,etal.Molecu larepidemiologyofmethicilin resistantandmethicilin sus ceptiblestaphylococusaureusisolatesfrom globalclinical trials[j].jclinmicrobiol,2008,46(9): DOI: /JCM [14] SawanoboriE,HungW C,TakanoT,etal.Emergenceof Panton Valentineleukocidin positivest59 methicilin sus ceptiblestaphylococusaureuswithhighcytolyticpeptideex presioninasociationwithcommunity acquiredpediatricos teomyelitiscomplicatedbypulmonaryembolism[j].jmi crobiolimmunolinfect,2015,48(5): doi: /j.jmi [15]EnrightM C,DayNP,DaviesCE,etal.Multilocusse quencetypingforcharacterizationofmethicilin resistantand methicilin susceptibleclonesofstaphylococusaureus[j].j ClinMicrobiol,2000,38(3): [16] OliveiraDC,MilheiricoC,de LencastreH.Redefininga structuralvariantofstaphylococcalcasete chromosome mec,sccmectypeⅥ[j].antimicrobagentschemother, 2006,50(10): DOI: /AAC [17] KoreenL,RamaswamySV,GravisEA,etal.spatyping methodfordiscriminatingamongstaphylococusaureusiso lates:implicationsforuseofasinglemarkertodetectgenet icmicro andmacrovariation[j].jclinmicrobiol,2004, 42(2): [18] 程航, 曾方银, 胡启文, 等. 广州地区耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子分型及耐药性分析 [J]. 第三军医大学学报,2013,35(8): [19] GilotP,LinaG,CochardT,etal.Analysisofthegenetic variabilityofgenesencodingthernaⅢ activatingcompo nentsagrandtrapinapopulationofstaphylococusaureus strainsisolatedfromcowswithmastitis[j].jclinmicrobi ol,2002,40(11): [20] LeeS,KwonKT,KimHI,etal.Clinicalimplicationsof cefazolininoculumefectandβ lactamasetypeonmethicil lin susceptiblestaphylococusaureusbacteremia[j].microb DrugResist,2014,20(6): DOI: / mdr [21] ReischlU,TuohyM J,HalGS,etal.Rapiddetectionof Panton Valentineleukocidin positivestaphylococusaureus byreal timepcrtargetingtheluks PVgene[J].EurJClin MicrobiolInfectDis,2007,26(2): DOI: /s z [22] StrommengerB,KetlitzC,WernerG,etal.MultiplexPCR asayforsimultaneousdetectionofnineclinicalyrelevant antibioticresistancegenesinstaphylococusaureus[j].j ClinMicrobiol,2003,41(9): [23]UnalS,HoskinsJ,FlokowitschJE,etal.Detectionofme thicilin resistantstaphylococciby using the polymerase chainreaction[j].jclinmicrobiol,1992,30(7): [24] KobayashiN,WuH,KojimaK,etal.DetectionofmecA, fema,andfembgenesinclinicalstrainsofstaphylococciu singpolymerasechainreaction[j].epidemiolinfect,1994, 113(2): [25]HarmsenD,ClausH,WiteW,etal.Typingofmethicil lin resistantstaphylococusaureusinauniversityhospital

8 1042 第三军医大学学报,2016,38(9) htp://aammt.tmmu.edu.cn setingbyusingnovelsoftwareforsparepeatdetermination anddatabasemanagement[j].jclinmicrobiol,2003,41 (12): [26] RuppitschW,IndraA,StogerA,etal.Clasifyingspa typesincomplexesimprovesinterpretationoftypingresults formethicilin resistantstaphylococusaureus[j].jclin Microbiol,2006,44(7): DOI: / JCM [27]BannermanTL,HancockGA,TenoverFC,etal.Pulsed fieldgelelectrophoresisasareplacementforbacteriophage typingofstaphylococusaureus[j].jclinmicrobiol,1995, 33(3): [28] ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute.Performance StandardsforAntimicrobialSusceptibilityTesting:Twenty FirstInformationalSupplement.CLSIDocumentM100 S21 [M].Wayne:ClinicalandLaboratoryStandardsInstitute, [29] MagiorakosA P,SrinivasanA,CareyR B,etal.Multi drug resistant,extensivelydrug resistantandpandrug resist antbacteria: aninternationalexpertproposalforinterim standarddefinitionsforacquiredresistance[j].clinmicro biolinfect,2012,18(3): doi: /j x [30]LiG,WuC,WangX,etal.Prevalenceandcharacteriza tionofmethicilinsusceptiblestaphylococusaureusst398i solatesfrom retailfoods[j].intjfoodmicrobiol,2015, 196:94-97.DOI: /j.ijfoodmicro [31] XiaoYH,GiskeCG,WeiZQ,etal.Epidemiologyand characteristicsofantimicrobialresistanceinchina[j].drug ResistUpdat,2011,14(4/5): DOI: / j.drup [32]ChenY,LiuZ,DuoL,etal.CharacterizationofStaphylo cocusaureusfromdistinctgeographiclocationsinchina:an increasingprevalenceofspa t030andsccmectypeⅢ[j]. PLoSOne,2014,9(4):e96255.DOI: /journal. pone [33] TeixeiraLA,ResendeCA,OrmondeLR,etal.Geo graphicspreadofepidemicmultiresistantstaphylococusau reuscloneinbrazil[j].jclinmicrobiol,1995,33(9): [34]FeilEJ,NickersonEK,ChantratitaN,etal.Rapiddetec tionofthepandemicmethicilin resistantstaphylococusau reusclonest239,adominantstraininasianhospitals[j]. JClinMicrobiol,2008,46(4): DOI: /JCM [35]ChenH,LiuY,JiangX,etal.Rapidchangeofmethicil lin resistantstaphylococusaureusclonesinachinesetertia rycarehospitalovera15 yearperiod[j].antimicroba gentschemother,2010,54(5): doi: /AAC [36]MikoBA,HaferCA,LeeCJ,etal.Molecularcharacter izationofmethicilin susceptiblestaphylococusaureusclini calisolatesintheunitedstates,2004to2010[j].jclin Microbiol,2013,51(3): DOI: /JCM [37] LiuC,ChenZJ,SunZ,etal.Molecularcharacteristics andvirulencefactorsinmethicilin susceptible,resistant, andheterogeneousvancomycin intermediatestaphylococus aureusfromcentral southernchina[j].jmicrobiolimmu nolinfect,2015,48(5): doi: /j. jmi [38]ZhaoC,LiuY,ZhaoM,etal.Characterizationofcommu nityacquiredstaphylococusaureusasociatedwithskinand softtisueinfectioninbeijing:highprevalenceofpvl+ ST398[J].PLoSOne,2012,7(6):e38577.DOI: /journal.pone [39]SunDD,MaXX,HuJ,etal.Epidemiologicalandmolec ularcharacterization ofcommunityand hospitalacquired StaphylococusaureusstrainsprevailinginShenyang,North easternchina[j].brazjinfectdis,2013,17(6): doi: /j.bjid [40] RaoQ,ShangW,HuX,etal.Staphylococusaureus ST121:aglobalydiseminatedhypervirulentclone[J].J MedMicrobiol,2015,64(12): DOI: /jmm [41]HoltfreterS,GrumannD,SchmuddeM,etal.Clonaldistri butionofsuperantigengenesinclinicalstaphylococusaureus isolates[j].jclinmicrobiol,2007,45(8): DOI: /JCM [42]RasmusenG,MoneckeS,BrusO,etal.Longtermmolec ularepidemiologyofmethicilin susceptiblestaphylococus aureusbacteremiaisolatesinsweden[j].plosone,2014, 9(12):e DOI: /journal.pone ( 收稿 : ; 修回 : ) ( 编辑邓强庭 )

福建农业学报材料与方法试验菌株引物主要仪器主要试剂细菌培养模板的制备反应条件扩增产物的检测特异性试验敏感性试验分离菌株检测产物的克隆及序列测定结果与分析

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