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1 中国人兽共患病学报 1098 C J Z 201733 ( 12) 论 DOI: 10 3969/ 1002 2694 2017 009 j 著 深圳地区甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌耐药性 及分子流行病学特征 李文青程锦娥吴伟元周小海卢月梅吴文苑龚文波 摘 要:目的 调查深圳地区甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌的耐药情况 并 了 解 其 分 子 流 行 病 学 特 征. 方 法 收 集 2012 年深圳地区 3 所医院的 112 株甲氧西林耐药金 黄 色 葡 萄 球 菌琼 脂 稀 释 法 测 定 对 10 种 抗 菌 药 物 的 最 低 抑 菌 浓 度 (m mm MIC)聚合酶链反应( PCR)来检 测 杀 白 细 胞 毒 素( P V PVL)基 因并 对 PVL y 基因阳性菌株行多位点基因序列分型(MLST).结果 MRSA 检出率 26 2 112 株 MRSA 对复方新诺明 莫西沙星 环丙沙 星 庆大霉素 红霉素 克林霉素和四环素的耐药率分别为 4 46 50 16 96 19 64 46 42 25 00 和 26 79 未 发 现万古霉素 利奈唑胺和替考拉宁耐药 株; PVL 阴 性 株 和 阳 性 株 对 10 种 抗 菌 药 物 的 耐 药 率 均 无 显 著 性 差 异; 112 株 MRSA 中 PVL 基因阳性 13 株( 11 61 )MLST 分型为 7 种已知序列型和 1 种新的序列型其中 ST338 和 ST25 最多.结论 深圳 地区 MRSA 检出率较低 PVL 基因阳性率处于中等水平具有明显不同于其他地区的独特的遗传背景. 关键词:甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌;琼脂稀释法;耐药性;杀白细胞毒素基因;多位点序列分型. 中图分类号: R378 1 文献标识码: A 文章编号: 1002 2694( 2017) 12 1098 05 A m p m gy m S py Sz LIW gchengj WU W q yzhou X LU Y m WU W ygong W ( SzKyL y M B R Sv Dp m C L y ) SzP p H p S S M J U v y Sz 518020 C A : T m y v m p m gy m g S py (MRSA) S z W 428S py m g S z 20A g m mm (MIC) x 26 2 S p p y ( 112/428)w MRSA TMIC 10 m g w m yg y m P V ( PVL)w yp ( PCR) P v PVLw ym y m g(mlst) Amg 112 m p m m x q yp z mx x x g m my my y w 4 46 50 16 96 p y 19 64 46 42 25 00 26 79 p v v my z p w y N Amg 112 w 13 ( 11 61 ) PVLg T w g PVLp v g v 10k m g Amg 13 PVL 1k w ymlst ST338ST25w m mm g7k q q ypw v MRSA S z g kg m g yp A K :m S py ;g ; ;P V ; yw m g q yp 深圳市知识 创 新 计 划 基 础 研 究 项 目 (N JCYJ 20150403101146287) Spp y S z Kw gi v P j 通讯作者:龚文波 Em : m ggw 163 C p g :Gg W Em :ggw 资助 作者单位:暨南大学第二临床 医 学 院/深 圳 市 人 民 医 院 检 验 科/深 圳 市病原微生物及细菌耐药监控重点实验室深圳 518020 B R P ( N JCYJ 20150403101146287) j 163 m

2 12 期李文青等 : 深圳地区甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学特征 1099 甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌 (MRSA) 已成为全球范围院内感染的重要病原菌 可引起皮肤软组织感染以及多种致死性全身感染. 据报道 2012 年全国 15 所医院的 MRSA 检出率平均 47.9% [1] 北京某医院甚至高达 82.9% [1].MRSA 通常呈多重耐药 以致于严重影响临床治疗 而且携带有 PVL 基因的 MRSA 主要引起化脓性的皮肤感染以及坏死性肺炎 从而使治疗更为棘手. 本研究旨在对深圳地区三家医院 2012 年临床分离的 112 株 MRSA 进行耐药性分析及 PVL 基因检测 并对 PVL 基因阳性的菌株应用多位点基因序列分型 (MLST) 技术进行序列分型 以了解深圳地区 MRSA 的耐药情况和分子流行病学特点 从而指导临床医生能够合理选择抗生素 为今后控制 MRG SA 的感染以及暴发提供有力的依据. 1 材料与方法 1.1 菌株来源本次研究收集深圳市 8 家医院 2012 年全年的 428 株金黄色葡萄球菌 其中 112 株非重复 MRSA 分离自分泌物 肺泡灌洗液 尿液 痰液 导管 血液等标本.112 株 MRSA 来自深圳地区 3 家医院 其中深圳市人民医院 59 株 深圳市第二医院 35 株 北大深圳医院 18 株. 1.2 仪器与试剂以金黄色葡萄球菌 ATCC29213 为质控菌株. 菌株鉴定采用法国 BMx 公司的 VITEKG2 应用英国 DENLY 公司的多点接种仪 C1000TMPCR 仪来源于美国 BGR 公司 ; 琼脂糖凝胶电泳仪和图像处理系统来于上海天能科技有限公司 PCR 引物为扩增引物 由广州英潍捷基公司完成引物合成及扩增产物的测序 ; 利奈唑胺购自辉瑞中国有限公司 ; 替考拉宁 万古霉素 头孢西丁 红霉素都购自美国 Sgm 公司 ; 莫西沙星 庆大霉素 复方新诺明 四环素和克林霉素购自中国药品生物制品检定所. 采用英国 Ox 公司的哥伦比亚血培养基和药敏培养基 (MGH 琼脂 ); 采用北京天根生化科技有限公司生产的细菌基因组提取试剂盒. 1.3 MRSA 确证首先通过 VITEKG2 鉴定为金黄色葡萄球菌 再用琼脂稀释法测定头孢西丁的 MIC 参照美国临床实验室标准协会 (CLSI)M100G [2] S23 文件 对头孢西丁的 MIC 8mg/L 的菌株确认 MRSA. 1.4 药物敏感性实验用金黄色葡萄球菌 ATCC29213 作为质控菌 用琼脂稀释法测定所有 MRSA 对 10 种抗菌药物的 MIC. 其结果依临床实验室标准协会 (CLSI)2013 年的标准判定为敏感 (S) 耐药 (R) 和中介 (I). 1.5 PVL 基因检测所有菌株均用 PCR 技术检测 PVL 基因 扩增反应条件和引物序列参考文献 [3]. 1.6 MLST 分型对 PVL 基因阳性菌株进行 MLST 分型. 合成引物 并扩增 7 个管家基因 (C E gpf gmk p p 和 yql) 具体条件参考文献 [4] 扩增的产物送至广州英潍捷基公司进行测序 测序结果在网站 p://.m. 进行比对和分析 然后得出每株细菌的序列型. 新的序列型通过 p://pm.g// 提交以确认. 1.7 统计学分析用 WHONET5.6 软件进行药敏数据处理和计算 使用 SPSS22.0 进行统计分析 进行卡方检验 以 P<0.05 为差异有统计学意义. 2 结果 2.1 MRSA 鉴定结果 428 株金黄色葡萄球菌中 112 株头孢西丁 MIC 8 mg/l 确认为 MRSA MRSA 检出率 26.2%. 2.2 菌株分布 112 株 MRSA 来自深圳地区 3 家医院 其中来自分泌物 75 株 痰和血液各 11 株 尿液 6 株 肺泡灌洗液 5 株 导管 2 株 其他标本 2 株 ; 来自普通外科 18 株 内分泌科 13 株 手外科和门诊急诊各 11 株 皮肤科和骨科各 10 株 呼吸科 7 株 康复科 4 株 神经内科 新生儿科和耳鼻喉科各 3 株 儿科 泌尿外科 心内科 血液科和肿瘤科各 2 株 其他包括妇科 风湿科 ICU 老年病科 烧伤科 心外科 胸外科等科室各 1 株. 2.3 MRSA 耐药特点 112 株 MRSA 对万古霉素 利奈唑胺 替考拉宁的抗菌活性最强 敏感率均为 100% 其次为复方新诺明 对莫西沙星 庆大霉素也比较敏感 对红霉素耐药率较高 见表 MRSA 的 PVL 基因检测结果 112 株 MRSA 中 13 株检出 PVL 基因 阳性率 11.61%.3 家医院 MRSA 的 PVL 基因阳性率分别为深圳市人民医院 11.86% (7/59) 深圳市第二人民医院 8 57% (3/35) 北大深圳医院 16.66%(3/18).13 株 PVL 基因阳性的 MRSA76.92%(10/13) 来源于分泌物 15.38%(2/13) 来源于尿液 7.69%(1/13) 来源于肺泡灌洗液. 另外 来源于骨科和普通外科各 2 株 其余 9 株分别来自康复科 泌尿外科 心内科 内分泌科 手外科 胸外科 新生儿科 肿瘤科和其它科室.

3 1100 中国人兽共患病学报 (12) 表 株 MRSA 对 10 种抗菌药物敏感性 T.1 MRSA10kgvy112 抗生素 A 耐药率 R(%) 敏感率 Svy(%) 中介率 Imy(%) 复方新诺明 Smxz 莫西沙星 Mxx 环丙沙星 Cpx 庆大霉素 Gm 红霉素 Eymy 克林霉素 Cmy 四环素 Ty 利奈唑胺 Lz 替考拉宁 Tp 万古霉素 Vmy PVL 基因阳性和阴性 MRSA 株耐药特点如 表 2 所示 13 株 PVL 基因阳性株和 99 株阴性株对 10 种抗菌药物耐药率均无统计学差异. 表 2 PVL 基因阳性和阴性 MRSA 对 10 种抗菌药物敏感性 T.2 PVLgpvgv10kgvy 抗生素 A 复方新诺明 TmpmGG mxz 耐药率 敏感率 PVL+MRSA(=13) PVLGMRSA(=99) R(%) Svy(%) 莫西沙星 Mxx 环丙沙星 Cpx 庆大霉素 Gm 红霉素 Eymy 克林霉素 Cmy 四环素 Ty 利奈唑胺 Lz 替考拉宁 Tp 万古霉素 Vmy χ 2 P 2.6 PVL 基因阳性 MRSA 株的 MLST 分型结果通过对 13 株 PVL 基因阳性的 MRSA 进行 MLST 分析 共检出 8 种不同序列 包括 7 种已知序列型和 1 种新序列型 其中 ST338 和 ST25 最多 各 3 株 (23.08%3/13) 其次 2 株 (15.38%2/13)ST59 另外 ST398 ST88 ST22 和 ST30 各 1 株 (7.69%1/13). 本研究发现 1 株新的序列型 被命名为 ST3966.ST3966 是 ST398 的单位点变异体. 3 讨论 目前 因 MRSA 感染率高 多重耐药和致死率 高 故其仍旧是具有全球性的非常重要的公共卫生 问题 [5]. [1] 本研究 MRSA 检出率 26.2% 远低于汪复等 报道的 2012 年全国 15 所医院的 47.9% 的平均检出 率 也低于新疆地区的 39.3% [6] 推测其可能与深圳 地区近年来加强医院感染控制有关.112 株 MRSA 广泛分布于深圳地区 3 家医院各个专业科室 标本 来源种类很多 说明 MRSA 分布广泛 容易经手在

4 12 期李文青等 : 深圳地区甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌耐药性及分子流行病学特征 1101 医院里广泛传播 所以仍要强调医务人员加强手卫 生 避免交叉感染的发生 进一步降低 MRSA 的发 生率. 112 株 MRSA 对红霉素的敏感率只有 46 43% 虽高于熊祝嘉等报道的中国 7 所医院的 红霉素 8.8% 的敏感率 不过红霉素仍不能作为 MRSA 的经验用药 本研究中 MRSA 对环丙沙星 和克林霉素敏感率分别为 84.82% 和 74.11% 远高 于熊祝嘉等报道的 3.5% 和 13.2% 的敏感率 深圳 市 MRSA 对大多数抗生素的耐药率也远低于全国 平均水平 ; 本研究发现 MRSA 对复方新诺明敏感率 高达 95.54% 也高于熊祝嘉等报道的 85.1% 都 属于高度敏感 可能与复方新诺明在临床使用较少 有关 ; 未发现万古霉素 利奈唑胺 替考拉宁的耐药 株 与熊祝嘉等报道的一致 可见万古霉素仍是治 疗 MRSA 的王牌药物. 但自从美国在 2002 年从临 床分离出世界上第一株万古霉素耐药的金黄色葡萄 球菌以来 虽然我国尚无万古霉素耐药的 MRSA 出 现 但国内外报道的万古霉素不敏感 MRSA 不断增 多 且万古霉素对 MRSA 的 MIC 正逐年增高 [8] 提 示我们对万古霉素的耐药监测不能放松. PVL 属于膜穿孔毒素家族 是金黄色葡萄球菌 产生的一种外毒素 其由 ksgpv 和 kfgpv 两个 基因转录.PVL 可引起白细胞死亡和组织坏死 感 染了产 PVL 的金黄色葡萄球菌常常与疖肿 蜂窝组 织炎 脓肿以及坏死性肺炎等密切相关 PVL 对炎 症的进一步扩散起重要作用 [9] 可导致其引起的侵 袭性感染患者住院时间延长 [10]. 文献报道全球 MRSA 的 PVL 阳性率各不相同 : 韩国 0.9% [11] 爱 尔兰 1.8% [12] 土耳其 4% [13] 新加坡 11.6% [14] 中 国温州 12.8% [15] 伊朗 20% [16] 德国 30% [17] 而美 国高达 97% [18] 携带 PVL 基因的社区获得性 MRG SA 在欧洲 美国 非洲及亚洲都曾有引起严重感染 的报道 甚至引起克隆株的播散 而当这些患者在医 院治疗时可能造成携带 PVL 基因的 MRSA 在医院 的播散 由于住院患者大多具有基础疾病 免疫力低 下 更易感染 以致病情加重 从而造成预后不良. 本次研究的 112 株 MRSA 由于缺乏流行病学 资料 没有区分是社区获得还是医院获得 测得 [19] PVL 基因阳性率 11.61% 低于杨延成等报道的 [20] 乌鲁木齐地区 38.7% 高于赵焕强等报道的沪浙 两地的 2.1% 与温州地区的检出率相近 说明地 区间 MRSA 的 PVL 基因携带率差异非常显著. PVL 基因阳性的 MRSA 具有多重耐药性且毒性 强 有一定的致死性 所以必须要加强对 MRSA 的 PVL 基因的监测 及时提醒临床采取有效的隔离措 施 以防此类菌株的播散. 3 家医院 MRSA 的 PVL 基因阳性率各不相 同 分别为 16.66% 11.86% 和 8.57% 可能与每家 医院的医院感染控制情况不同有关.13 株携带 PVL 基因的 MRSA 分别来源于 11 个专业科室的 住院病人的分泌物 尿液 肺泡灌洗液 说明携带 PVL 基因的 MRSA 在各个专业科室分布广泛 更 易引起皮肤化脓性感染 尿路感染以及呼吸系统感 染 因此每个专业科室都要对携带 PVL 基因的 MRSA 足够重视. 与张传颂等报道的浙江地区 PVL 阴性株对 庆大霉素等抗菌药物的耐药率明显高于阳性株不 同 本研究显示 MRSA 的 PVL 阳性株对莫西沙 星 环丙沙星 庆大霉素 红霉素 克林霉素和四环素 的耐药率高于 PVL 阴性株 但均无统计学差异 可 能与地区性抗生素选择差异有关 也说明 PVL 基因 并没有增强金黄色葡萄球菌的耐药性 而只是增强 毒力 加重感染. MLST 是近年发展起来的新型 DNA 序列分型 方法 用于细菌临床分离株基因分型 具有数据可 靠 分辨率高 重复性好等优点. 其结果可通过互联 网与全世界不同的研究结果比较 从而探明本地区 流行株与其它地区流行株之间的关系. 据报道 除韩国 日本 我国台湾外 在亚洲大部 分地区 ST239 是最主要的流行克隆株 [22G26] ; 日本与 韩国主要流行的克隆型是 ST5 [25G26] ST5 是多个亚 洲地区的第二多的流行克隆 [22G2326]. 在我国 袁文 [6] 常等报道的乌鲁木齐地区 张传颂等报道的浙 [27] 江地区以及王俊瑞等报道的内蒙古某医院 [28] ST239 最多 而余方友等报道的温州某医院 ST88 最多 其次是 ST239. 本研究对 13 株 PVL 基 因阳性的 MRSA 进行 MLST 分型 检出 8 种不同 的序列型 其中 ST338 和 ST25 最多 其它分别为 ST59 ST398 ST88 ST22 ST30 和 ST3966 偶发 株 并未检出 ST239 和 ST5. 说明 3 家医院分离的 PVL 基因阳性的 MRSA 存在多个克隆株. 也说明 深圳地区具有明显不同于其他地区的独特的遗传 背景. 本次研究发现 1 种新的序列型 被命名为 ST3966ST3966 是已知序列 ST398 的单位点变异 体. 说明新发现的 ST3966 与已知序列 ST398 间有 亲缘关系. 综上所述 本研究在一定程度上揭示了深圳地 区 MRSA 的耐药情况和 PVL 基因的携带情况以及

5 1102 中国人兽共患病学报 (12) MLST 分型特征 显示深圳地区具有明显不同于其他地区的独特的遗传背景. 提示在 MRSA 感染的防控中 要严格执行消毒隔离制度 并依据 MRSA 的分子分型特征和耐药性合理使用抗生素 以控制 MRSA 的感染和暴发流行. 参考文献 : [1]WgFZDMHFP.Mgm CHINETC2012[J].CJICG m201313(5):321g330.doi: /j.1009g (C) 汪复 朱德妹 胡付品 等.2012 年中国 CHINET 细菌耐药性监测 [J]. 中国感染与化疗杂志 (5):321G330. [2]CLySI.M100GS23PmG mpyg;twyg mppm[s].wy:clsi2013. [3]ZgKMCJAEyS.NvmpxPCR ym mmyg mgspyusa300 USA400mAPGVk gwmspymgg Ggvpy[J].JCM200846(3): 1118G1122.DOI: /JCM.01309G07 [4]Eg MCDy NPDvCE.Mq ypgzmg mg GpSpy[J].JC MG (3):1008G1015. [5]YgSSWgJFKW.Pgm mgspy[j].cj Z201632(12):1117G1121.DOI: /j..1002G (C) 杨守深 王晶 范克伟 等. 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的治疗研究进展 [J]. 中国人兽共患病学报 (12):1117G1121. [6]Y WCWWZQ.Mypgg MRSA Umq[J].MJNDg FNwC201435(5):449G452.(C) 袁文常 卫玮 周琴 等. 乌鲁木齐地区 MRSA 的分子分型及耐药性研究 [J]. 西北国防医学杂志 (5):449G452. XgZJXMWgH.Mpmgy gmgspy vgpc[j].cjicm (1):22G26.DOI: /j.1009G ( C) 熊祝嘉 肖盟 王贺 等. 中国七所教学医院耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分子流行病学及耐药性研究 [J]. 中国感染与化疗杂志 (1):22G26. [8]ZXLCGS.VmymG Spy(VISA)mpwv vvmym[j].ijid201533: 185G190.DOI: /j.j [9]LGRy MCzFBS.Spy PGVkzgpmG [J].S (5815):1130G1133.DOI: / [10]CpLPgvNBzD.PwPG VkpvSpy kgp[j].ijmepg mg20123(1):48g55. [11]KmJSPkJSSg W.PGV pvspym K [J].KJLM200727(4):286G291.DOI: / kjm [12]Ry ASSACMgPM.Tmg mp vgyp mg Spy (MRSA)gpGvG g(pv)vpvpmk mmyqmrsai[j].jcmg (8):2554G2563.DOI: /JCM.00245G07 [13]KZCTkAAR.IvgPG GVkg SCCmyp Spy m Tky[J].M DgR200814(3):203G210.DOI: /m [14]HLYKTHKpA.HgPG VpgSpyG ypp Sgp[J].CI D (3):486G489.DOI: / [15]YFCZLC.PvSpyG ygpgvkgmg mppc[j].c MIG (4):381G DOI: /j.1469G x [16]MgmSOPm MRMmM.MG zmgspyg :z mjmgpg mqyp(st)36st121tig [J].FEMS ML (8):v043.DOI: /m/v043 [17]MkSSkPEg MJ.Hgvy PGVpvmGpG SpympvG mmy mgs. [J].C MI200713(12):1157G1164.DOI: /j.1469G x [18]SkDJBwKCpTW.PpvmpG mgp mgmmg yspypz p[j].ji200754(5):427g434.doi: /j. j [19]YgYCCgHHZ.Mypgg SpyUmq[J]. A Am M M T201638(9): 1035G1042.DOI: /j.1000G (C) 杨延成 程航 胡珍 等. 乌鲁木齐地区金黄色葡萄球菌分离株的分子分型及耐药性分析 [J]. 第三军医大学学报 (9): 1035G1042. ( 下转第 1109 页 )

目录 一 2014 年全院 5533 株细菌分布及前 10 位主要细菌耐药性结果 二 按照标本类型 ( 或感染部位 ) 进行的病原菌构成及药敏分析 1 呼吸道标本病原菌构成及药敏分析 2 尿液标本病原菌构成及药敏分析 3 血流 骨髓标本病原菌构成及药敏分析 4 皮肤软组织标本病原菌构成及药敏分析 5

目录 一 2014 年全院 5533 株细菌分布及前 10 位主要细菌耐药性结果 二 按照标本类型 ( 或感染部位 ) 进行的病原菌构成及药敏分析 1 呼吸道标本病原菌构成及药敏分析 2 尿液标本病原菌构成及药敏分析 3 血流 骨髓标本病原菌构成及药敏分析 4 皮肤软组织标本病原菌构成及药敏分析 5 2014 年安医大一附院病原菌分布及药物敏感性分析 编者 : 沈继录 编审 : 王中新徐元宏 1 目录 一 2014 年全院 5533 株细菌分布及前 10 位主要细菌耐药性结果 二 按照标本类型 ( 或感染部位 ) 进行的病原菌构成及药敏分析 1 呼吸道标本病原菌构成及药敏分析 2 尿液标本病原菌构成及药敏分析 3 血流 骨髓标本病原菌构成及药敏分析 4 皮肤软组织标本病原菌构成及药敏分析 5 伤口引流液标本病原菌构成及药敏分析

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