社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 RAPD 基因分型及药敏分析陈荣忠等 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 因其传播速度快 耐药谱广以及耐药机制复杂多变成为医院感染的重要致病菌之一 自 20

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1 文章编号 : (2018) 社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 RAPD 基因分型及药敏分析 陈荣忠向蓉 * 莫和国徐宁 ( 南方医科大学附属小榄医院检验科, 中山 ) 况 方法 摘要 : 目的 探讨社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (CA-MRSA) 对临床常用抗菌药物的耐药性及其分子流行病学情 收集从 CA-MRSA 感染患者伤口分泌物分离的金黄色葡萄球菌, 采用 PCR 扩增 meca 基因确定为 MRSA 菌株, 同时对 其进行 17 种抗菌药物耐药性检测 利用随机扩增多态性 DNA(RAPD) 方法对 51 株 CA-MRSA 进行同源性分析 结果 51 株 CA- MRSA 对红霉素 克林霉素 四环素的耐药率均在 30% 以上, 未发现对莫西沙星 利福平 利奈唑胺 替考拉宁 万古霉素 奎奴普丁 / 达托霉素以及呋喃妥因的耐药菌株, 经 RAPD 分型可分为 I~V 个亚型, 以 I 型 (53.70%) 为主 CA-MRSA 感染患者主要分 布于普外科 (39.22%) 和皮肤门诊 (27.45%) 结论 技术对 MRSA 进行同源性分析, 可为基层医院控制感染提供流行病学监测 为有效预防和控制 CA-MRSA 的感染, 临床应合理选用抗菌药物, 采用 RAPD 关键词 : 社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 ; 耐药性 ; 随机扩增多态性 DNA; 流行病学 中图分类号 :R978.1 文献标志码 :A RAPD genotyping and drug sensitivity analysis of community acquired methicillin-resistant Staphylococcus Chen Rong-zhong, Xiang Rong, Mo He-guo and Xu Ning (Affiliated Xiaolan Hospital, Southern Medical University, Zhongshan ) Abstract Objective To investigate the drug resistance of community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA) to antimicrobial agents commonly used in clinical and its molecular epidemiology. Methods Staphylococcus aureus isolated from wound exudates of CA-MRSA patients was collected and the meca gene was used to identify MRSA strains by PCR. At the same time, 17 kinds of antimicrobial resistance were detected. 51 strains of CA-MRSA was typed by random amplified polymorphic DNA (RAPD). Results The resistance rates of 51 strains of CA-MRSA to erythromycin, clindamycin, and tetracycline were more than 30%. There were no strains that were resistant to moxifloxacin, rifampicin, linezolid, teicoplanin, vancomycin, quinuprine/ daptomycin, and nitrofurantoin. RAPD typing could be divided into I~V subtypes, and type I was the major type with the frequency of 53.70%. CA-MRSA infections were mainly distributed in general surgery (39.22%) and skin clinic (27.45%). Conclusion In order to prevent and control the infections of CA-MRSA effectively, antimicrobial agents should be used rationally. Homology analysis of MRSA using RAPD technique can provide epidemiological surveillance for infection control in primary hospitals. Key words Community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus; Drug resistance; Random amplified polymorphic DNA; Epidemiology 收稿日期 : 基金项目 : 中山市医学科研基金项目 (No. 2015A020100); 广东省医学科学技术研究基金项目 (No. B ) 作者简介 : 陈荣忠, 男, 生于 1989 年, 初级检验技师, 主要从事临床微生物相关研究, @qq.com * 通讯作者, crzgavin@163.com

2 社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 RAPD 基因分型及药敏分析陈荣忠等 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin-resistant Staphylococcus aureus, MRSA) 因其传播速度快 耐药谱广以及耐药机制复杂多变成为医院感染的重要致病菌之一 自 20 世纪 80 年代, 在加拿大首次报道社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (community-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus, CA-MRSA) [1] 以来,MRSA 的感染趋势呈现向社区扩散, 且易感 [2] 人群多为没有医院经历和医院感染史的健康人群 CA-MRSA 多见于皮肤和软组织感染, 甚至可继发败血症和坏死性肺炎 目前, 采用传统的细菌鉴定及分型方法不能快速进行基因分型, 不利于病原菌的溯源分析 为探讨本地区 CA-MRSA 的流行情况和临床常用抗菌药物的耐药性, 本文对脓液标本分离的 CA-MRSA 进行耐药性分析及随机扩增多态性 DNA 分型 (random amplified polymorphic DNA, RAPD) 研究 1 资料与方法 1.1 一般资料收集 2015 年 10 月 2016 年 10 月来我院就诊的 CA- MRSA 感染患者的伤口脓液标本, 剔除同一患者相同部位的重复菌株, 共分离 CA-MRSA 菌株 51 株 CA-MRSA 诊断标准参照卫生部发布的 医院感染诊断标准 :(1) 患者在门诊或者入院 48h 内分离的 MRSA;(2)1 年内无住院或与医疗机构接触史 ;(3) 无留置各种导管及其他穿透皮肤的医用装置 ;(4) 无手术透析史 1.2 仪器和试剂 VITEK-2 全自动微生物分析仪及其配套 GP 鉴定卡 AST-GP67 药敏卡 ( 法国 Bio Mérieux 公司 ), 凝胶成像仪系统 ( 美国 Bio-rad 公司 ),2720Thermal Cycler PCR 扩增仪,WD-9403C 紫外仪,DYY-2C 型电泳仪, 细菌基因组 DNA 提取试剂盒 琼脂糖 RAPD 引物 DNA Mark Premix 溶液 ( 包含 Mg 2+ Taq 酶 dntps) 等 PCR 相关试剂均购自达安基因股份有限公司,mecA 基因检测试剂盒 ( 上海生物有限公司 ), 质控菌株为金黄色葡萄球菌 (ATCC43300), 购自卫生部临检中心 1.3 方法 药物敏感实验标本的采集 运送及分离培养均严格按照 全国临床检验操作规程 进行 采用 VITEK2 全自动微生物分析仪对分纯后的菌株进行菌株鉴定及药敏试验, 按照 2017 年美国临床和实验室标准协会 (CLSI)-M100 公布的药物敏感试验方案对结果进行判断 meca 基因检测 严格按照 meca 基因检测试剂盒说明书操作, 提取金黄色葡萄球菌的 DNA,4 以下保存备用, 使用特异性引物扩增 meca 基因 引物序列 : 上 游 5'AAAATCGATGGTAAAGGTTGGC-3', 下游 5'-AGTTCTGCAGTACCGGATTTGC-3' PCR 扩增 参数 :94 预变性 2min,94 变性 1min,42 退火 1min,72 延伸 1min,35 个循环, 最后 72 延伸 5min 随机扩增多态性 DNA 分型 根据研究报道 [3-5] 设计 R A P D 分型引物, 建立 R A P D 反应体系 : 总反应体系为 2 0 μ L, 10xBuffer 5μL,25mmol/L MgCl 2 3.5μL,Taq 酶 0.5μL,10mmol/L dntp 1μL,50pmol/μL 引物 (5'-AAGTAAGTGACTGAGCG-3')1.5μL, 模板 DNA 2μL, 灭菌双蒸水补足 20μL PCR 扩增参数 :94 预 变性 5min,94 变性 1min,25 退火 1min,72 延 伸 2min,40 个循环, 最后 72 延伸 5min 采用 2% 琼 脂糖凝胶 ( 含溴化乙锭 ) 对扩增产物进行电泳, 在凝胶 成像仪下观察扩增条带并拍照保存 1.4 统计学处理 采用 SPSS 20.0 统计学软件进行数据分析, 计数 资料以率表示, 组间比较使用 χ 2 检验,P<0.05 为存在 统计学差异 ; 应用 WHONET 5.6 软件分析 CA-MRSA 菌株的药敏结果 2 结果 2.1 临床资料 2015 年 10 月 2016 年 10 月共收集 CA-MRSA 感 染患者 51 例, 其中男性 31 例, 女性 20 例 ( 表 1); 年龄 0~83 岁 [ 平均值 (36±22) 岁 ],20~40 岁组人数最多, 占 47.05%(χ 2 =13.39, P<0.05) 51 株 CA-MRSA 菌株均分 离自患者的伤口脓液分泌物 表 1 51 例 CA-MRSA 患者各年龄段分布 ( 例数 ) Tab cases of CA-MRSA patients in all age distribution 性别 年龄 / 岁 <20 20~40 41~60 >60 合计 / 岁 男 女 合计

3 meca 基因检测结果 采用 PCR 扩增法对 51 株初步鉴定为 MRSA 的菌株 进行 meca 基因检测 51 株均具有 meca 特异性电泳条 带 (533bp), 确定为 MRSA( 图 1) 2.3 药物敏感实验结果 对 51 株 CA-MRSA 菌株进行 17 种抗菌药物体外敏 感试验 ( 表 2), 耐药率前 5 位分别是青霉素 (100%) 苯 唑西林 (100%) 红霉素 (90.2%) 克林霉素 (90.2%) 以 及四环素 (35.29%) 此次实验未发现对莫西沙星 利 福平 利奈唑胺 替考拉宁 万古霉素 奎奴普丁 / 达托霉素以及呋喃妥因的耐药菌株 2.4 CA-MRSA 菌株 RAPD 基因分型结果 对 51 株 CA-MRSA 菌株进行 RAPD 分析, 每株菌 株均能扩增出 1~4 条不等的有效电泳条带 根据电泳 条带数目的差异,51 株 MRSA 可分为 I~V 个亚型 ( 图 2), 其中 I 型 29 株,II 型 6 株,III 型 11 株,IV 型与 V 型 bp 1, M 注 :M:Marker;1~8: 菌株编号图 1 meca 基因 PCR 电泳图谱 Fig. 1 PCR results for meca gene 表 2 51 株 CA-MRSA 菌株对 17 种抗菌药物的药敏实验结果 Tab. 2 Antibiotic susceptibility of 51 strains of CA-MRSA to 17 antimicrobial agents 抗菌药物敏感 / 株中介 / 株耐药 / 株耐药率 /% 青霉素 苯唑西林 左氧氟沙星 莫西沙星 红霉素 四环素 利福平 庆大霉素 复方磺胺甲噁唑 克林霉素 利奈唑胺 替考拉宁 万古霉素 环丙沙星 奎奴普丁 / 达托霉素 呋喃妥因 阿米卡星 bp bp 2,000 1, M Ⅰ 型 Ⅱ 型 Ⅲ 型 Ⅳ 型 Ⅴ 型 注 :M:Marker 图 2 CA-MRSA 菌株的 RAPD 分型电泳图谱 Fig. 2 Result of RAPD typing of CA-MRSA strains 分别为 3 株和 2 株 不同科室分离的 CA-MRSA 菌株 分型情况见表 3 结果显示本医院 CA-MRSA 菌株以 I 型为主 (χ 2 =60.147,P<0.05), 各菌株主要分布于普 外科, 占 39.22%; 皮肤门诊占 27.45%; 呼吸内科占 9.8%; 儿科 五官科 骨科 妇产科和手外科的检 出率分别在 3.92%~5.88% 之间 3 讨论 近年来,CA-MRSA 的感染趋势呈现逐年升高, 这是由于 CA-MRSA 的易感因素 发病特征及耐药 特性均与医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (hospital-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus, HA-MRSA) 感染存在差异, 在一定程度上增 加了 CA-MRSA 的防控难度 目前关于 CA-MRSA 的 国内专题研究较少, 缺乏多中心 大样本的详细流 行病学资料报道, 不利于院内感染的监控, 甚至可 表 3 不同科室的 CA-MRSA 菌株分布情况 Tab. 3 Distribution of CA-MRSA strains in different departments 科室 Ⅰ 型 / 株 Ⅱ 型 / 株 Ⅲ 型 / 株 Ⅳ 型 / 株 Ⅴ 型 / 株合计 / 株 儿科 普外科 皮肤门诊 五官科 骨科 妇产科 呼吸内科 手外科 合计

4 社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 RAPD 基因分型及药敏分析陈荣忠等 造成区域性的暴发流行 本研究对 CA-MRSA 进行 RAPD 基因分型及体外药敏试验, 探讨本地区 CA- MRSA 的流行病学情况, 旨在从病原菌的溯源分析角度为 CA-MRSA 的防控提供理论依据 CA-MRSA 的感染主要累及皮肤和软组织, 常引起疖 痈 蜂窝织炎等临床症状 从 CA-MRSA 在各科室的分布情况可知,51 株菌株均来自伤口分泌物, 患者年龄主要集中在 20~40 岁之间, 科室以普外科和皮肤门诊为主, 占 66.67%, 提示 CA-MRSA 主要定植和感染部位以受损皮肤 外科伤口及软组织多 [6] 见, 与相关报道相一致 在药物敏感试验中, 初筛为 MRSA 的菌株均通过分子生物学方法检测 meca 基因, 从而避免由于 [7-8] MRSA 异质性耐药而导致的假阳性和假阴性 51 株 CA-MRSA 对青霉素 苯唑西林 红霉素 克林霉素 四环素的耐药率均在 30% 以上, 提示在临床首次经验治疗 CA-MRSA 感染时, 应避免使用青霉素类 大环内酯类 克林霉素和四环素类抗菌药物 本实验中 CA-MRSA 对莫西沙星 利福平 利奈唑胺 替考拉宁 万古霉素 奎奴普丁 / 达托霉素以及呋喃妥因的耐药率均为 0, 提示本地区在治疗 CA-MRSA 感染患者时可首选此类药物 根据 2015 [9] 年 CHINET 细菌耐药性监测网数据可知,MRSA 对利福平 喹诺酮类及氨基糖苷类药物的耐药率均超过 30%, 而本地区 CA-MRSA 对左氧氟沙星 环丙沙星 庆大霉素 利福平和复方磺胺甲噁唑的耐药率远远低于 10%, 两者数据存在一定差异, 这可能由于 HA-MRSA 与 CA-MRSA 所携带的 PVL 基因与 [10] SCCmec 类型不同所导致 研究表明 CA-MRSA 与 [11-12] MRSA 的遗传背景及耐药特点并不一致, 在临床治疗 CA-MRSA 感染时, 应根据本地区 CA-MRSA 的耐药特点进行个性化用药治疗, 选取合适的抗菌药物 目前, 糖肽类与噁唑烷酮类药物的出现虽然暂时缓解了 MRSA 的感染治疗压力, 但是寻找一种适合基层医院开展 快速便捷 可行性强 重复性好的基因分型技术仍然尤为重要 脉冲场凝胶电泳分型 (PFGE) 及多位点序列分型 (MLST) 技术由于其分辨 [13] 力与重复性高, 适用于 MRSA 基因序列研究, 但实验条件要求高 操作复杂 费用昂贵, 难以在基层医院有效开展 与前两者相比, 随机扩增多态性 DNA 分型 (RAPD) 技术采用一条通用引物对 MRSA 基 因组 DNA 进行 PCR 扩增, 通过分析扩增产物 DNA 片 段的多态性, 从而反映该 MRSA 基因组 DNA 的多态 性 由于 RAPD 分型技术实验操作简单 成本低廉 灵敏度高 实验周期短, 因此可用于区域性流行菌 株的溯源分析 [14-16] 本研究结果显示 51 株 CA-MRSA 菌株经过 RAPD 分型, 均能获得 1~4 条不等的有效电 泳条带, 可分为 5 个基因亚型, 分型率达 100% I 型 CA-MRSA 菌株检出 29 株, 比例高达 56.86%, 为本 院的主要流行菌株 ; 其次 Ⅲ 型 CA-MRSA 菌株共检出 11 株, 两者均主要分布于普外科和皮肤科门诊, 说 明本院的普外科和皮肤科门诊存在 I 型和 Ⅲ 型菌株的 流行趋势, 这主要原因是 CA-MRSA 感染多以皮肤 损伤 外科伤口为主, 侵袭性操作频繁 易合并感 染 患者流动性强等原因导致 通过本研究发现, RAPD 分型技术可用于伤口分泌物中 CA-MRSA 的 基因溯源分析, 从而发现可疑的 MRSA 感染暴发流 行, 为制定防控措施争取宝贵时间 综上所述, 本研究通过分析 CA-MRSA 的临床常 用抗菌药物的药敏结果, 并且采用 RAPD 技术对其 进行基因分型, 为评估 MRSA 的分子流行病学趋势 提供了一种快速便捷 经济实用 灵敏度高 适合 基层医院推广的研究方法 与此同时, 全面健全门 诊及病房的管理制度, 严格执行无菌操作 消毒隔 离, 加强临床合理用药宣传, 有助于控制 CA-MRSA 的院内感染及耐药性的蔓延 参考文献 [1] Lee B Y, Singh A, David M Z, et al. The economic burden of community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus (CA-MRSA)[J]. Clin Microbiol Infect, 2013, 19(6): [2] Xie X, Bao Y, Ouyang N, et al. Molecular epidemiology and characteristic of virulence gene of community-acquired and hospital-acquired methicillin-resistant Staphylococcus aureus isolates in Sun Yat-sen Memorial hospital, Guangzhou, Southern China[J]. BMC Infect Dis, 2016, 16(1): 339. [3] 王震, 施瑜, 曹珍娣, 等 年院内感染金黄色葡萄球菌耐药性监测及同源性分析 [J]. 检验医学与临床. 2014, 11(7): [4] 徐荣, 张敏. MRSA 医院感染危险因素及分子流行病学调查 [J]. 上海医药, 2015, 36(15): 33-35, 39. [5] 魏智艺, 程君涛, 李小毅, 等. 福建东南沿海某战区医院 MRSA 感染特点及基因多态性分型研究 [J]. 解放军医药 杂志, 2015, 27(3):

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