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促矿衡水
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1 第 32 卷第 5 期 Vol.32, No 年 5 月 May 2012 生殖与避孕 Reproduction & Contraception reproduction_journal@hotmail.com 精子功能评估 : 未来的选择卢慧李铮 ( 上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿科, 上海市人类精子库, 上海市男科学研究所精子发育与遗传实验室, 上海, ) 摘要辅助生殖技术的发展, 已能帮助那些因严重男性因素导致不育的夫妇获得健康子代然而迄今为止, 对精子功能进行全面有效评估的体系尚未建立生殖生物学和生殖遗传学的发展为评估精子结构和功能提供了许多值得借鉴的评估方法, 如精子膜功能检测顶体功能检测线粒体功能检测中心体功能检测及遗传物质完整性检测, 但这些检测对生育能力预测的准确性非常有限, 难以作为独立的临床指标, 故建立一套综合体系来评价精子整体功能可能更有助于临床实际关键词 : 精子 ; 男性不育 ; 受精中图分类号 : R 文献标识码 : A 文章编号 : X(2012) 年, 英国 Steptoe 等创造性地运用体外受精 (in vitro fertilization, IVF) 和胚胎移植 (embryo transfer, ET) 技术, 诞生了世界上首例试管婴儿 Louis Brown 在之后的几十年里, 辅助生殖技术 (assisted reproductive technology, ART) 的应用在世界范围内取得了极大的成功在某些发达国家里, 约有 1/50 的子代是通过 ART 出生的截至 2006 年, IVF-ET 的临床妊娠率仍约为 20%, 出生率仅有 15% [1] 生殖是一个复杂的生理过程, 但人们对其中的生理病理学机制认识有限, 对男性不育的了解尤其有限目前对于男性不育的疾病大多难以进行病因学分类并进行针对性诊疗临床上开展得最为广泛的检测仅有精液常规分析和精子形态学检测精子功能检测开展得很少且对其临床价值缺乏深入的认识随着在细胞分子水平上对精子功能研究的日渐深入, 近年来涌现出许多精子功能检测的新方法本文将综述本研究为上海市科委重点课题资助项目, 项目号 : 10JC 通讯作者 : 李铮 ; Tel: ; Lizhengboshi@163.com 精子功能检测的最新进展, 为这些新成果应用于临床检测提供切入点 1 精子膜功能的检测 1.1 精子膜完整性的检测实施单精子卵胞质注射 (ICSI) 技术的前提是找到存活的精子, 但在评价严重弱精子症患者与睾丸穿刺取精病例的标本中是否存在存活精子, 有时是非常困难的目前在临床上最常用的精子膜完整性检测方法为低渗肿胀试验 (hypo-osmotic swelling, HOS) 和伊红染色伊红染色应用于精子的主要原理就是利用完整和破损的细胞膜对某些染料有着不同通透性的特点, 使 2 种细胞分别着上不同的颜色根据这个原理也可以选择荧光染料来检测精子膜的完整性可使活精子着色的荧光染料有 6-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) 6-car- boxymethylfluorescein diacetate (CMFDA) SYBR -14 等 ; 可使死精子着色的染料有 propidium iodide(pi) ethidium homodimer

2 1(EthD-1) 和 bizbenzimidazole Hoechst 等这些染料的联用可以使死活精子分别染上不同的颜色, 明显区分开来这些染料与检测精子其它功能的染料联用可以同时研究同一条精子几种功能之间的相互关系当需要进行精子膜完整性评估, 而染色的方法并不适用的时候 ( 如 ICSI), 可 [3] 选用低渗肿胀试验 1.2 精子膜电位的检测在附睾的成熟过程中, 精子膜蛋白被连上 3 种带负电荷的氨基聚糖残基因此, 成熟的精子膜带 -16~-20 mv 的负电荷据此原理 Philip 等发明 [4] 了一种 Zeta 方法, 选出成熟的带负电荷的精子简单来说, 该方法是通过简单的旋转摩擦使离心管壁带上微量正电荷, 使带负电荷的精子吸附在管壁弃去没有被吸附的精子后再用含血清的 Hepes-HTF 培养基中和管壁上的正电荷, 将吸附在 [5] 上面的精子洗脱下来, 并离心收集研究显示, 通过这个方法分选出来的精子核蛋白成熟度 DNA 完整性精子形态及精子活力均优于未经分选的精子采用密度梯度离心 Zeta 电位分离联用 (DGC-Zeta procedure) 分选获得的精子, 其畸形率 DNA 碎片率降低, 核成熟度 annexin V/ 凝集素阳 [6] 性率提高结果提示, DGC-Zeta 可分选到功能良好及获能更充分的精子总的说来, Zeta 方法的优点是操作简单成本低对精子几乎没有什么损伤, 分选出来的精子还可用于人工授精但缺点是回收率低, 因此不适用于严重少精症者精液及穿刺获得的精液处理 2 精子顶体功能的检测 2.1 顶体反应 (AR) 顶体反应 (acrosome reactin, AR) 是精子与卵透明带结合之后, 发生的胞吐过程, 发生在精子穿透卵母细胞膜并使卵母细胞受精之前豌豆凝集素 (pisumativum agglutinin, PSA) 是一种植物凝集素, 它可以特异地与顶体内容物中的 α- 甘露糖和 α- 半乳 [3] 糖残基相结合使用荧光染料 FITC 标记的 PSA 对精子进行染色, 可见具完整顶体的精子头部一半以上发出明亮均匀的荧光 ; 而发生过顶体反应的精子在赤道板仅有一个荧光带, 或者在顶体区无荧光染色可以用一些诱导剂体外诱导精子发生顶体反应, 结合荧光染色技术可检测精子发生顶体反应的能力 Ca 2+ 载体 A23187 孕酮和透明带蛋白 -3 (zona pellucida glycoprotein-3, ZP3) 均可诱发顶体反应刘德一等认为, 孕酮诱发精子顶体反应的能力很低 ; 而 A23187 诱发顶体反应的百分率很高, 同时还能使大量精子迅速致死亡因此, 这 2 种方法是否能应用于临床检测还有待进一步研究 2.2 精子穿透试验 (SPA) 精子穿透试验 (sperm penetration assay, SPA) 是一种评估精子受精能力的试验, 主要是使用脱颗粒细胞的卵母细胞与处理后的精子共培养, 计算平均每个卵子中穿透的精子数 (sperm capacitation index, SCI) 如需使用异种卵母细胞检测精子功能, 则需事先除去 [8,9] 透明带, 此方法的优点是准确率高研究显示, SPA 甚至可用于预测母牛母猪每窝的产崽量但缺点是此方法耗时长成本高, 不适宜作为常规检测, 而常常被用于验证新的检测方法在评价受精功能时的有效性 2.3 透明质酸结合试验 (HBA) 精子与透明质酸结合试验 (hyaluronan binding assay, HBA) 是将精液加到透明质酸包被的载玻片上, 在显微镜下计数被黏附于载玻片上的活动精子占总活动精子数的百分比 HBA 检测结果与形态学检测结果有很好的一致性 2.4 ZP3 结合试验透明带在受精过程中扮演了重要的角色 : 它参与选择最终入卵的精子, 并诱发精子发生顶体反应, 最 [10] 终进入卵子, 完成受精 Pankaj 等报道, 使用重组 ZP3 包被的小珠与精子共孵育, 可以检测获能精子与透明带结合的能力这是一种更为简单快速的检测方法但由于其报道时间不长, 如何将这种检测结果应用于临床还需要进一步的研究 3 精子细胞质功能的检测 3.1 精子线粒体功能的检测 Rhodamine 123 (R123) 是一种黄绿色荧光染料, 可以在完整的线粒体膜内累积它使膜完整的线粒体呈现黄绿色荧光, 而膜破损的线粒体无荧光 ; 可以利用这一点对精子线粒体膜完整性进行定量检测线粒体最主要的功能就是通过呼吸作用产生能 -341-

3 量, 这对于需要经过长途跋涉才能完成受精使命的精子来说是至关重要的 JC-1(5,50,6,60-tetrachloro-1, 10,3,30-tetraethylbenzimidazolyl- carbocyanine iodide) 是一种可以通过显示线粒体膜电位的变化来检测线粒体产能状态的荧光染料 JC-1 单体发绿色荧光, 而多聚体发红色荧光随着线粒体膜电位极化程度不断升高, 越来越多的 JC-1 多聚体累积在线粒体中计算红 / 绿荧光的比值就可以知道线粒体的膜电位 JC-1 染料对线粒体的特异性高, 且能实时显 [11] 示线粒体膜能量状态的持续变化 3.2 精子中心体功能的检测卵子在形成过程中失去中心体, 因此合子的中心体来自于精子当 ICSI 将精子注射入卵子后, 仍有一部分患者的卵子无法受精这可能与卵子激活和中心体形成的障碍有关系异种 ICSI 技术被用于检测精子中心体的功能 : 将人精子注入牛或兔的成 [12,13] 熟卵子中, 观测星体形成率研究表明, 经异种 ICSI 检测星体形成率异常的精子在其临床 ICSI 的卵裂率和妊娠率都比较低 4 精子遗传物质完整性的检测 4.1 精子核成熟度检测精子核含有高度折叠的染色质核成熟度检测反映了成熟精子染色质包装过程中核蛋白的完整性主要检测方法有苯胺蓝染色 (aniline blue, AB) 与色霉素 A3(chromomycin A3, CMA3) 荧光染色睾丸精子发生过程中, 精原细胞和精母细胞内的核蛋白主要为体细胞的组蛋白, 富含赖氨酸但到精子细胞阶段, 则组蛋白将逐渐被富含精氨酸和半胱氨酸的鱼精蛋白所取代苯胺蓝与富含组氨酸的区域结合, 使精子着色苯胺蓝深染提示核成熟度低该检测方法成本低, 仅需要普通光学显微镜即可色霉素 A3 可与核蛋白竞争结合于 DNA 链上的富含 GC 区 CMA3 荧光强度高的区域提示核蛋白的成熟度低有研究 [14] 显示, 自发性习惯流产夫妇丈夫的精子 AB CMA3 染色阳性率都显著高于生育力正常者 4.2 精子 DNA 碎片率检测精子在发生成熟储存运输等各阶段均可能受到各种因素影响, 发生 DNA 断裂而精子 DNA 碎片率 (sperm DNA fragmentation, SDF) 可能影响受精率胚胎发育潜能自发流产率种植率及子代安全目前临床上主要采用染色体结构分析 (sperm chromatin structure assay, SCSA) 与精子染色质扩散试验 (sperm chromatin dispersion test, SCD) 进行 SDF 检测, 结果用精子 DNA 碎片指数 (DNA fragmentation index, DFI) 表示 [15,16] 随着 SDF 相关的临床研究与诊疗实践逐步开展, 人们越来越重视其在不育症诊疗中的意义, 并尝试对高 DFI 患者进行药物及手术治疗在药物治疗方面, 目前主要是以各类抗氧化药物为主某些针对性的手术治疗也能改善部分高 DFI 患者的精液质量, 或提高 ART 助孕技术的成功率如精索静脉结扎术可以有效地降低患者精液的 DFI; 使用囊胚培 [17] 养 - 移植技术可提高 ART 的成功率 4.3 精子染色体非整倍体筛查 (aneuploidy screening) 精子生成过程中, 减数分裂时染色体重组异常可能产生非整倍体的精子许多临床症状可能是由精子染色体非整倍体率过高引起的 : Klinefelter 综合征罗氏易位交互易位严重形态畸形多尾大头尾部发育不全圆头精子非梗阻性无精子症不明原因的习惯性流产不明原因的反复 IVF 失败因此, 针对上述病例选择相应的探针进行精子染色体非整倍体筛查十分有意义目前荧光原位杂交技术 (fluorescent in situ hybridization, FISH) 是临床进行精子染色体非整倍体筛查最常用的方法, 但因其比较昂贵, 且一次仅能同时检测最多 9 条染色体, 因而在临床推广上具有一定的困难但随着技术的发展, 此项技术成本必将逐步下降基因组杂交 (comparative genome hybridization, CGH) 与 FISH 相比, 一次能检测更多的染色 [18] 体, 是这项技术的发展方向随着男性不育的分子细胞水平研究工作的逐步开展, 人们已慢慢揭开生殖这一复杂生理过程的神秘面纱越来越多的信号通路分子在生殖领域中的重要作用也逐渐被阐明, 如 : T- 型 /L- 型电压门控 Ca 2+ [19] 通道 PLC-zeta [20] 等如何根据这些研究选择出适合临床检测使用的标志物, 建立一些临床应用价值大的精子功能检测方法, 则还需要很多努力一个优秀的临床检测项目除了具有明确的生理意义外, 还应具有操作简便重复性好检测价格低廉的特点此外, 在设计一个新的检测项目时还应考虑到其目的性 : 这一检测如何能帮助临床诊断治疗? 如果其目的是帮助一般的男性不育症的药物

4 治疗, 则该项目如果查出异常, 是否明确提示病患的病因, 或是为找出病因提供有价值的线索如果是为了给 ART 提供帮助, 则异常的结果是否能作为选择手术方案的指征 : 是选择 IVF 还是 ICSI? 是进行卵裂期的胚胎移植还是囊胚移植? IVF ICSI 技术已日臻成熟, 如何为体外受精选择无遗传缺陷的正常精子已成为一个倍受关注的问题令人遗憾的是, 现有大部分的精子功能检测方法都对精子造成严重损伤, 只能用作体外检测而临床经验告诉我们, 对于绝大多数病例来说, 即便是那些被诊断为精子功能异常的患者其精液中也仍然有一部分正常的精子存在如何能无损伤地选择出正常精子? 相信这项技术的成功能带给试管婴儿技术飞跃性的发展近年有专家提出, 精子检测对男性不育症的临床诊断是否有意义? 这是因为人们开始觉察到, 大部分精子功能检测项目对生育能力预测的准确性非常有限, 难以作为独立的临床指标但不可否认的是, 这些检测都具有生理意义, 从某个角度反映了精子质量也许我们不能从单一角度, 用简单的正常参考值来评价精子的整体功能尝试从循证医学角度出发, 建立一套综合体系来评价精子整体功能可能更能有助于临床实际参考文献 : [1] Clarke GN. ART and history, Hum Reprod, 2006, 21(7): Gillan L, Evans G, Maxwell WMC. Flow cytometric evaluation of sperm parameters in relation to fertility potential. Theriogenology, 2005, 63(2): [3] World Health Organization. WHO laboratory manual for the Examination and processing of human semen (5th ed). Geneva: WHO, 2010: [4] Chan PJ, Jacobson JD, Corselli JU, et al. A simple zeta method for sperm selection based on membrane charge. Fertil Steril, 2006, 85(2): [5] Razavi SH, Nasr-Esfahani MH, Deemeh MR, et al. Evaluation of zeta and HA-binding methods for selection of spermatozoa with normal morphology, protamine content and DNA integrity. Andrologia, 2010, 42(1):13-9. [6] Zarei-Kheirabadi M, Shayegan Nia E, Tavalaee M, et al. Evaluation of ubiquitin and annexin V in sperm population selected based on density gradient centrifugation and zeta potential (DGC-Zeta). J Assist Reprod Genet, 2012, 29(4): 刘德一, Gordon Baker HW. 精子功能检测与男性不育诊治的新进展. 中华男科杂志, 2007, 13(2): [8] Oh SA, Park YJ, You YA, et al. Capacitation status of stored boar spermatozoa is related to litter size of sows. Anim Reprod Sci, 2010, 121(1-2): [9] Oh SA, You YA, Park YJ, et al. The sperm penetration assay predicts the litter size in pigs. Int J Androl, 2010, 33(4): [10] Bansal P, Gupta SK. Binding characteristics of sperm with recombinant human zona pellucida glycoprotein-3 coated beads. Indian J Med Res, 2009, 130(1): [11] Celeghini EC, de Arruda RP, de Andrade AF, et al. Practical techniques for bovine sperm simultaneous fluorimetric assessment of plasma, acrosomal and mitochondrial membranes. Reprod Domest Anim, 2007, 42(5): [12] Yoshimoto-Kakoi T, Terada Y, Tachibana M, et al. Assessing centrosomal function of infertile males using heterologous ICSI. Syst Biol Reprod Med, 2008, 54(3): [13] Terada Y, Schatten G, Hasegawa H, et al. Essential roles of the sperm centrosome in human fertilization: developing the therapy for fertilization failure due to sperm centrosomal dysfunction. Tohoku J Exp Med, 2010, 220(4): [14] Talebi AR, Vahidi S, Aflatoonian A, et al. Cytochemical evaluation of sperm chromatin and DNA integrity in couples with unexplained recurrent spontaneous abortions. Andrologia Aug 2. doi: /j x. [Epub ahead of print] [15] 卢慧, 刘玉林, 李铮. 男性不育临床检测新选择 : 精子 DNA 完整性试验. 中国男科学杂志, 2009, 23(1):70-2. [16] 陈泯燕, 黄国宁, 王亚平, 等. 精子 DNA 碎片与体外受精结局的关系. 生殖与避孕, 2010, 30(11): [17] Tamburrino L, Marchiani S, Montoya M, et al. Mechanisms and clinical correlates of sperm DNA damage. Asian J Androl, 2012, 14(1): [18] Carrell DT. The clinical implementation of sperm chromosome aneuploidy testing: pitfalls and promises. J Androl, 2008, 29(2): [19] José O, Hernández-Hernández O, Chirinos M, et al. Recombinant human ZP3-induced sperm acrosome reaction: evidence for the involvement of T- and L-type voltage-gated calcium channels. Biochem Biophys Res Commun, 2010, 395(4): [20] Yoon SY, Jellerette T, Salicioni AM, et al. Human sperm devoid of PLC, zeta 1 fail to induce Ca 2+ release and are unable to initiate the first step of embryo development. J Clin Invest, 2008,118(11): (2011 年 7 月 12 日收稿 ) -343-

5 Sperm Function Assessment: Options for the Future Hui LU, Zheng LI (Shanghai Jiaotong University of Medicine Department of Urology, Renji Hospital, Shanghai Sperm Bank, Shanghai Institute of Andrology and Genetic Laboratory of Sperm Development, Shanghai, ) ABSTRACT The development of assisted reproductive technology helps the couples with serious fertility problems to have a healthy baby. But so far, the systems haven t set up, which can evaluate sperm function exhaustively and effectively. The development of reproductive biology and reproductive genetics raise some new methods for evaluating sperm structure and function, such as the function detection of sperm membrane, acrosome, mitochondria, centrosome and genetic material. However, the veracity of these detections for predicting fertility is limited, so they could not act as unaided clinical indicators. Establishing a synthetical system for evaluating sperm function may be more helpful for clinical practice. Key words: sperm; male infertility; fertilization ************************************************************************************************************ ( 正文见第 328 页 refer to p328) Research Progress on Mutations and Single Nucleotide Polymorphisms of Follicle Stimulating Hormone Receptor Gene Ling-yuan FU 1,2, San-jiao ZHANG 3, Zhao-feng ZHANG 2, Jing DU 2 (1. Fudan University, Shanghai, ) (2. Shanghai Institute of Planned Parenthood Research, NPFPC Laboratory of Contraception and Devices, Shanghai, ) (3. Nanchang Hospital of traditional Chinese and Western Medicine, Nanchang, ) ABSTRACT Follicle stimulating hormone receptor (FSHR) is a G-protein coupled receptor protein encoded by the FSHR gene, which is constituted by 3 parts: extracellular region, transmembrane region and intracellular region. FSH / FSHR system which consists of FSH and the extracellular domain of FSHR plays an important role in the human reproductive process. The FSHR gene mutations are divided into active and inactive mutations. Inactive mutations may lead to reproductive diseases such as primary or secondary amenorrhea, the gonadotropin sexual dysfunction, premature ovarian failure and spermatogenesis impairment and active mutations are related to ovarian hyperstimulation syndrome (OHSS). The FSHR gene point mutations are rare, which have been reported only once and most of them exist as single nucleotide polymorphisms (SNP). The normal development and function of the ovaries and testes are dependent on the FSHR, and FSHR gene mutations have different effects on reproductive phenotype of male and female. Key words: follicle stimulating hormone receptor (FSHR); FSHR gene; point mutation; single nucleotide polymorphisms (SNP) -344-

2 3 4 5 22 22 23 25 35 38 39 45 46 1

97017626 O O 2 3 4 5 22 22 23 25 35 38 39 45 46 1 intrauterine insemination IUI 202 IUI a 24 IUI b 24 IUI c hcg 36 IUI d hcg 24 48 IUI 202 262 30 2 1 27 1 14.9% 11.5% a 122 151 13.9%, 11.3% b 42 46 2.38%,