生物化学

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1 酶化学 ( 一 ) Enzyme Chemistry

2 酶的发现历史 1857 年, 巴斯德 (Pasteur) 就酒的发酵提出存在 ferments ( 酵素 ) 1878 年, 库恩 (Kuhne) 提出 Enzyme

3 酶的发现历史 1926 年美国 Sumner 得到脲酶的结晶, 并指出酶是蛋白质 1930 年 Northrop 等得到了胃蛋白酶 胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的结晶, 并进一步证明了酶是蛋白质 J.B.Sumner J.H.Northrop

4 酶的发现历史 1982 年, Cech 证实 rrna 有催化功能 1983 年, Altman 提出 RNaseP 有催化功能 Thomas Cech University of Colorado at Boulder, USA Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA

5

6 第六章酶化学 第一节 第二节 第三节 酶学概述 酶促反应动力学 酶的制备及应用

7 第一节酶学概述 酶的概念 酶的催化特点 酶的组成与分类 酶的结构与功能的关系 酶的多样性

8 What is Enzyme? 化学本质 酶 : 是具有生物催化功能的蛋白质或核酸

9 生物催化剂 所有酶均由生物体产生 酶和生命活动密切相关 参与生命过程 生物进化和组织功能分化的基础 酶的活性调节机制

10 酶的缺陷症

11 白化症鲟鱼酶的缺陷症 苯丙酮尿症

12 乳酸脱氢酶同工酶在不同组织中的分布

13 二 酶作为生物催化剂的特点 具有很高的催化效率 酶的催化效率比化学催化剂高 10 7 ~10 13 倍, 比非催化反应高 10 8 ~10 20 倍 具有高度的专一性 酶易失活 催化反应条件温和

14 三 酶的组成及分类 ( 一 ) 酶的化学组成 ( 二 ) 酶的分类

15 ( 一 ) 酶的化学组成 1. 单纯蛋白质酶类 2. 结合蛋白质酶类 全酶 = 酶蛋白 + 辅助因子 ( 辅酶 辅基或金属离子 ) 辅酶 (coenzyme): 与酶蛋白结合得比较松 辅基 (prosthetic group): 与酶蛋白结合得比较紧 P102 表 6-2 一些酶的辅助因子

16 根据酶蛋白分子的特点 1. 单体酶 (monomeric enzyme) 2. 寡聚酶 (oligomeric enzyme) 3. 多酶复合体 (multienzyme complex)

17 ( 二 ) 酶的命名与分类 1. 习惯命名法 : 2. 国际系统命名法系统名应包括 : 底物 ( 构型 ) 酶作用的基团 催化反应的类型 习惯名称 谷丙转氨酶 乙醇脱氢酶 系统名称 丙氨酸 :α- 酮戊二酸氨基转移酶 乙醇 :NAD + 氧化还原酶

18 国际系统分类法及酶的编号 1 氧化还原酶 AH 2 +B=A+BH 2 2 转移酶 AB+C=A+BC 3 水解酶 AB+H 2 O=AOH+BH 4 裂合酶 AB=A+B 5 异构酶 A=B 6 连接酶 A+B+ATP=AB+ADP+Pi ( 合成酶 ) 或 A+B+ATP=AB+AMP+PPi 六大类编号依次为 亚类编号依次为 亚 - 亚类编号依次为

19 (Enzyme Commision) [ EC ] 酶表中酶的编号的举例说明 表示第一大类, 即氧化还原酶表示第一亚类, 被氧化基团为 CHOH 基表示第一亚亚类, 受体为 NAD 表示醇脱氢酶在此亚亚类中的顺序号

20 四 酶的结构与功能的关系 ( 一 ) 一级结构与功能的关系 必需基团 酶原激活 共价修饰 ( 二 ) 高级结构与功能的关系 活性中心 牛胰核糖核酸酶拆合实验 聚合与解聚蛋白质的变性与复性 同工酶

21 酶的活性中心 酶分子上特异的氨基酸残基比较集中的区域, 即与酶活力直接相关的区域, 称为酶的活性部位 (active site) 或活性中心 (active center)

22 决定酶对底物的专一性 决定酶促反应的类型

23 必需基团 一般将与酶活性有关的基团称为酶的必需基团 构成酶的活性中心常见氨基酸有丝氨酸 (Ser) 的羟基 组氨酸 (His) 的咪唑基 半胱氨酸 (Cys) 的巯基等

24 例 胰凝乳蛋白酶的肽链折叠 示活性中心 His Ser Asp Ser195 丝氨酸 His57 组氨酸 及Asp102 精氨酸 生物化学 绪论

25 酶原激活 胰蛋白酶原 胰凝乳蛋白酶原 胰凝乳蛋白酶 肠激酶 六肽 + 胰蛋白酶 弹性蛋白酶原 弹性蛋白酶 羧肽酶原 羧肽酶

26 胰蛋白酶原的激活 肠激酶 胰蛋白酶原 酶活性中心 胰蛋白酶

27 胰凝乳蛋白酶原的激活 胰蛋白酶 胰凝乳蛋白酶

28 可逆共价修饰 共价调节酶 P104 其它酶 有活性无活性 类型 : 磷酸化腺苷酰化尿苷酰化等 最常见的共价修饰是酶的一个特定的丝氨酸残基的磷酸化 蛋白磷酸化酶 蛋白激酶

29 同工酶 (isoenzyme) 概念 : 在同一种属中, 催化活性相同而酶蛋白的分子结构, 理化性质及免疫学性质不同的一组酶 结构与功能 : 同工酶在体内的生理意义主要在于适应不同组织或不同细胞器在代谢上的不同需要 研究意义 : 细胞分化 遗传等的分子基础 ; 临床诊断

30 乳酸脱氢酶同工酶在不同组织中的分布

31 P126 酶的多样性 核酶 : 调节酶 : 人工酶 : 抗体酶 : 别构酶 : 多功能酶 : 模拟酶 : 自学

32 第二节酶促反应动力学 酶催化反应的机制 酶促反应基本动力学 影响酶促反应速率的因素

33 一 酶催化反应的机制 酶促反应的本质 酶反应机制

34 酶促反应的本质 1. 酶与一般催化剂的共同点 (1) 用量少而催化效率高 (2) 能加快化学反应的速度, 但不改变平衡点, 反应前后本身不发生变化 (3) 降低反应所需的活化能 加速反应的本质 (4) 可逆反应双向催化

35

36 中间产物 假说 酶与底物先络合成一个中间产物, 然后中间产物进一步分解成产物和游离的酶 E + S K 1 K 2 ES K 3 P + E 过渡态物质

37 中间产物假说证据 结晶 ES 复合物的获得 速度 [S] [P] [ES] [E] 时间

38 酶反应机制 酶作用专一性的机制 酶作用高效性的机制

39 酶的专一性及作用机制 酶的专一性, 即酶对底物的高度选择性, 酶一般只能催化一种或一类反应, 作用于一种或一类底物

40 酶作用专一性假说 锁匙学说 1894 年 Fisher 提出

41 诱导锲合学说 1958 年 Koshland 提出, 此学说已被广泛接受

42 酶作用高效性的机制 共价催化 酸碱催化 邻近效应与定向效应 底物形变和诱导契合 金属离子催化

43 共价催化 酶中参与共价催化的基团主要包括 His 的咪唑基,Cys 的硫基,Asp 的羧基,Ser 的羟基

44 酸碱催化 狭义的酸碱催化 : 广义的酸碱催化 : 较为重要, 可提高反应速率 10 2 ~10 5 酶的活性部位中可做为广义酸碱的功能基主要有氨基 羧基 硫氢基 酚羟基及咪唑基 影响酸碱催化反应速度的因素 (P111): 酸碱的强度以及供出和接受质子的速度 组氨酸的咪唑基 : 占很重要的地位

45 二 酶促反应基本动力学

46 米氏方程 定量表达底物浓度与酶反应速率的关系 1913 年 Michaelis 和 Menten 推导了米氏方程 v = V K max m [S] + [S]

47 动力学基本参数 (1)V max 的意义 在一定的酶浓度下,V max 是一个常数, 它只与底物的种类及反应条件有关 (2)K m 值的物理意义及应用 (3)K m 和 V max 的测定

48 K m 值的含义 : K m 值是当酶反应速率达到最大反应速率一半时的底物浓度

49 P115 K m 值的物理意义 K m 是酶的一个特性常数 K m 的应用是有条件的 K m 可以反映酶同底物的亲和力

50 K m 值的实际用途 鉴定酶 判断酶的天然底物 计算一定速率下的底物浓度 推断某一代谢反应的方向和途径 判断抑制类型

51 K m 值与米氏方程的实际用途举例 例 : 当 [S]=3K m 时, 反应速率相当于 V max 的百分 数? Vmax [S] V= Km + [S] V/Vmax = 75%

52 可帮助推断某一代谢反应的方向和途径和限速步骤 例 : 酶 1,2,3 分别催化 A B C D K m 分别为 10-2, 10-3, 10-4,A,B,C 浓度均为 10-4 限速步骤? 例 : 丙酮酸可被乳酸脱氢酶 丙酮酸脱氢酶和丙酮酸脱羧酶催化, 当丙酮酸浓度较低时, 走哪条途径? K m 分别为 和 mol/l

53 利用作图法测定 k m 和 V max 双倒数作图法 (Lineweaver-Burk plot) v = V K max m [S] + [S] y = kx+b 其它作图法略

54 三 影响酶促反应速率的因素 酶浓度 温度 ph 值 激活剂 抑制剂

55 酶浓度对酶催化反应的影响 在一定温度和 ph 下, 酶促反应在底物浓度大大超过酶浓度时, 速度与酶的浓度呈正比 此性质是酶活力测定的基础之一

56 温度对酶反应速度的影响 温度对酶促反应速度的影响有两个方面 : 1. 提高温度, 加快反应速度 2. 提高温度, 酶变性失活 温度系数 Q 10 : 温度升高 10, 反应速度与原来的反应速度之比, 大多数酶的 Q 10 一般为 1~2

57 温度对酶反应速度的影响 V 最适温度 T( ) 最适温度 : 温血动物一般在 ; 植物酶稍高在 酶的保藏 : 低温下, 以固体保存为好

58 ph 对酶促反应速度的影响 ph 影响酶活力的原因 过酸 过碱都会使酶蛋白的构象发生改变 ph 的改变能影响酶分子活性部位上有关基团的解离 注意 : 酶的提纯及测活时要选择酶的稳定 ph, 通常在某一缓冲液中进行

59 ph 对酶促反应速度的影响 动物酶多在 ph6.5~8.0 植物及微生物酶 ph4.5~6.5 最适 ph: 使酶促反应速度达到最大时的介质 ph 最适 ph 与底物种类 浓度及缓冲液成分有关

60 激活剂对酶反应速度的影响 激活剂 : 凡能提高酶活性的物质 激活剂的类型 : 无机离子 : Cl - Br - PO 4 3- 等 金属离子 : K + Na + Mg 2+ Zn 2+ Fe 2+ 等 中等大小的有机分子, 如 : 一些还原剂 ( 半胱氨酸 谷胱甘肽 );EDTA( 乙二胺四乙酸 ) 具有蛋白质性质的大分子物质 ( 蛋白酶 )

61 酶的抑制作用 酶的抑制 : 若由于酶的必需基团化学性质的改变, 但酶并未变性, 而引起酶活力的降低或丧失称为抑制作用 引起抑制作用的物质称为抑制剂

62 相关概念 失活作用 : 酶主要是蛋白质, 使酶蛋白变性而导致酶活力丧失的作用称为失活作用 去激活作用 : 某些酶只有在金属离子存在下才能很好的表现活性, 如果用金属螯合剂去除金属离子, 会引起这些酶活性的降低或丧失

63 ( 二 ) 抑制作用的类型 1 不可逆的抑制作用 抑制剂与酶活性中心 ( 外 ) 的必需基团共价结合, 使酶的活性下降, 无法用透析 超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活 2 可逆的抑制作用 抑制剂与酶蛋白非共价键结合, 可以用透折 超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活

64 可逆的抑制作用 竞争性抑制 : 抑制剂具有与底物类似的结构, 竞争酶的活性中心, 并与酶形成可逆的 EI 复合物, 阻止底物与酶结合 可以通过增加底物浓度而解除此种抑制 非竞争性抑制 : 反竞争性抑制 : 底物和抑制剂可以同时与酶结合, 但是, 中间的三元复合物 ESI 不能进一步分解为产物, 因此, 酶的活性降低 不能通过增加底物的浓度的办法来消除非竞争性抑制作用 某些重金属离子对酶的抑制属于非竞争性抑制 : Cu2+ Hg2+ Pb2+ 略

65

66 Noncompetitive inhibition

67 可逆抑制作用的动力学 P121 表 6-6 小结 : 三种可逆抑制作用的酶促反应速度 V 与 Km 值

68 第三节酶的制备及应用 一 酶的制备与纯化 二 酶在工业上的应用

69 一 酶的制备与纯化 (P121) 酶溶液的制备包括 : 材料预处理及细胞破碎 抽提 浓缩 纯化 酶制剂

70 酶分离纯化过程的注意事项 首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面的了解 以酶活力和比活力为标准, 判断所选择的方法是否得当 严格控制操作条件, 防止酶的变性失活

71 酶的活力测定及其表示方法 1. 酶活力 (Enzyme activity) 指酶催化化学反应的能力, 一般用一定条件下酶催化某一化学反应的反应速度来表示 酶促反应速度 : 单位时间 单位体积中底物的减少量或产物的增加量 酶活高低是以酶的活力单位数来表示

72 2. 酶活力单位 酶单位 (U): 在一定条件下, 一定时间内将一定量的底物转化为产物所需的酶量 酶的含量用每克酶制剂或每毫升酶制剂含有多少酶单位表示 (U/g 或 U/ml) 酶活力国际单位 : IU(1961): Kat(1972):

73 3. 酶的比活力 酶的比活力是分析酶的含量与纯度的重要指标 酶的比活力 (Specific activity): 每毫克酶蛋白所具有的酶活力 单位 : U/mg 蛋白质

74 4. 酶活力的测定方法 (P126) 分光光度法 荧光法 同位素法 电化学法

75 酶在纺织工业中的应用及其进展 淀粉酶和退浆 脂肪酶和助理退浆 果胶酶和棉煮练 纤维素酶及其表面处理 蛋白酶与羊毛 真丝的加工 氧化还原酶与牛仔布清洗中除去靛

76 退浆原理

77 退浆车间

78 果胶酶和棉煮练 煮炼车间

79 纤维素酶及表面处理

80 蛋白酶与羊毛 真丝的加工

81 蛋白酶与羊毛 真丝的加工

82 防缩车间 定型车间

83 高温染色与 牛仔除靛

84 未来可能的应用 棉布漂白 交联催化剂 废水杂色去除 合成纤维的降解

85 总结 除了将淀粉酶应用于退浆很普遍外, 其余种类的酶在纺织工业中的应用并不普遍, 有一部分酶正在实验研究 小规模生产应用之中 酶在纺织品湿加工中的应用, 不但能减少对环境的污染, 而且能改善纺织品的服用和外观性能, 是一种潜在的纺织品湿加工的生态技术

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