Microsoft PowerPoint - 第二章 蛋白质.ppt

Transcription

1 第二章蛋白质 第一节 组成蛋白质的构件单位 20 种常见的蛋白质氨基酸 一 常见的蛋白质氨基酸的特征 1 通式: COOH COO - H 2 N C H + H 3 N C H R 不带电形式 R ( 两性离子形式 ) 与羧基相邻的 α- 碳原子上都有一个氨基, 因而称为 α- 氨基酸 2 构型 除甘氨酸外的氨基酸 分子中的 α- 碳原子都为不对称碳原子 都具有旋光性 氨基酸的构型是以距羧基最近的手性 C 原子为标准 因此氨基酸的通式 天然蛋白质中氨基酸大部分为 L α- 氨基酸. 都具有 D- 型和 L- 型两种立体异构体 目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为 L- 型

2 二 分类 1 按氨基酸侧链的化学结构分 最简单的两个氨基酸 (1) 脂肪族氨基酸 (2) 芳香族氨基酸 (3) 含羟基的氨基酸 (4) 含巯基的氨基酸 (5) 碱性氨基酸 (6) 酸性氨基酸 (7) 酰胺氨基酸 (1) 脂肪族氨基酸 R 为脂肪族烃类的氨基酸 (6 种 ) 有一个环形的饱和烃侧链, 亚氨基酸 亮氨酸和异亮氨酸 都是含有支链的 4 碳侧链 要注意的是, 异亮氨酸分子中的 a- 碳和 β- 碳都是不对称碳 (2) 芳香族氨基酸 (3 种 ) 色氨酸又称之吲哚丙氨酸 Trp

3 (3) 含羟基的氨基酸 (2 种 ) (4)R 为含硫的氨基酸 (2 种 ) 丝氨酸和苏氨酸都含有 β- 羟基 丝氨酸的羟甲基 (-CH 2 OH) 在水溶液中不发生离子化, 但可以参与很多酶的活性部位的反应 苏氨酸也象异亮氨酸一样, 具有两个手性碳原子 半胱氨酸又称为巯基丙氨酸 蛋氨酸又称为 a- 氨基 -γ- 甲硫基丁酸 (5)R 含氨基 赖氨酸 含有 a- 和 ε - 氨基 又称 a,ε- 二氨基己酸是一个双氨基酸 在中性 ph, ε - 氨基以碱性氨离子的形式存在, 在蛋白质中通常带正电荷 组氨酸 侧链有一个咪唑环 又称为咪唑丙氨酸 咪唑基是可以离子化的 咪唑环 胍基 一个 C 与 3 个 N 连接, 其中与一个 N 是以双键相连的, 其余的 2 个 N 是以单键相连的 精氨酸 a- 氨基 -δ- 胍基戊酸 是 20 种氨基酸中碱性最强的氨基酸 (His) δ- 胍基戊酸

4 (7)R 含羧基在 ph7 时, 有 2 种带负电荷 天冬氨酸 a- 氨基丁二酸 或天冬氨酸 谷氨酸 又称 a- 氨基戊二酸 两个氨基酸的侧链在 ph7 时都离子化, 所以在蛋白质中是带负电荷的 这两个氨基酸经常出现在蛋白质分子表面上, 谷氨酸的单钠盐是调味品味精 (8)R 含酰胺基团的氨基酸 2 按中性条件下是否带电荷 带正电荷 碱性氨基酸 Lys,His,Arg 带较多负电荷 酸性氨基酸 Asp,Glu 带有少量负电荷, 微酸性 中性氨基酸 其余 15 种氨基酸 3 按照侧链的极性分类 1) 极性氨基酸 ( 亲水性氨基酸 ) 12 种 侧链含有极性基团, 可以与水形成氢键 N: Lys,Arg,His, Asn,Gln O Asp,Glu,Ser,Thr,Tyr S Cys Gly (2) 非极性氨基酸 ( 疏水性氨基酸 ):8 种 侧链具有比较强疏水性 共有八种 Ala,Val,Leu,Ile,Pro Phe,Trp Met

5 4 按人体是否能自我合成分类 (1) 必需氨基酸包括 : 人体自我不能合成, 必需从外界摄取的 8 种氨基酸, 包括缬氨酸, 亮氨酸 异亮氨酸, 苏氨酸, 蛋氨酸, 色氨酸, 苯丙氨酸 赖氨酸 人体必需氨基酸有八种 : Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr 假设来写一两本书 (2) 半必需氨基酸 : 组氨酸和精氨酸, 虽然人体能自己合成, 但效率较低, 尤其在婴幼儿时期, 需要由外界供给 (3) 非必需氨基酸 人体可以自我合成的氨基酸,10 种 1 氨基酸的光吸收 三 重要的理化性质 光吸收 : 在近紫外区 ( nm) 在中性 ph 条件下, 色氨酸和酪氨酸的紫外吸收峰在 280nm, 而苯丙氨酸的在 260nm 溶液中 280nm 吸收的测量常用来估算蛋白质的浓度 大多数蛋白质中都含有色氨酸和酪氨 2 氨基酸的离解性质 ( 酸碱性质 ) 氨基酸在晶体和水溶液中主要以兼性离子形式存在 ph 对氨基酸带电荷正负和数目有影响 ph 为 1-13 之间, 为兼性离子 ph 为 1 时, 全部为阳离子 ph 为 13 时, 全部为阴离子 (2) 兼性离子定义 : 在中性 ph 的水溶液中, 既有带负电荷基团, 又有带正电荷基团的离子称兼性离子 亦称两性离子或偶极离子 (dipolar ion) 氨基酸 蛋白质等分子既含有酸性基团, 又含有碱性基团, 羧基等酸性基团脱去质子带负电荷, 氨基等碱性基团结合质子带正电荷, 是典型的兼性离子

6 (3) 等电点 (4) 等电点的确定 调节两性离子 ( 氨基酸 蛋白质等 ) 溶液的 ph, 使该两性离子所带的净电荷为零, 此时溶液的 ph 称该两性离子的等电点 (pi) 在等电点时, 氨基酸在电场中既不向正极, 也不向负极移动 氨基酸在等电点时溶解度最小, 易发生沉淀 工业上利用这一性质提取氨基酸 不同结构的两性离子有不同的 pi 值 等电点 (pi) 的高低与氨基酸分子 α- COOH 和 α-nh 3 +, 侧链的解离基团都有关系 用 K1 K2 分别表示 α-cooh 和 α-nh 3 + 解离平衡常数时, 它们的负对数分别用 pk1 pk2 表示 pkr -COO- 代表侧链的羧基解离平衡常数的负对数 pkr -NH2 代表侧链的氨基解离平衡常数的负对数 可以用测定滴定曲线的实验方法求得 K1 K2 a 中性氨基酸的等电点 [Gly + ]k1=[gly 0 ][H + ] K1= [Gly 0 ][H+] [Gly + ] [Gly 0 ]k2=[gly - ][H + ] K2= [Gly - ][H+] [Gly 0 ] 第一拐点 : ph=pk1=2.34 第二拐点 : ph=pk2=9.69 等电点时 :[Ala-]=[Ala+], 等电点时 氢离子浓度用 I 表示 I 2 =K1 K2 PI=1/2(pK1+pK2) 所以中性氨基酸的等电点在数值上等于两个 pk 值之和的二分之一 pi = (pk1 + pk2)/2 丙氨酸 pi b. 酸性氨基酸 : 酸性氨基酸 : pi = (pk1 + pk R-COO- )/2 2 取兼性离子两边的 pk 值的一半, 所以酸性氨基酸的等电点为两个羧基的解离平衡常数负对数的一半 pk R-COO-

7 问题 :Asp 的 pi c 碱性氨基酸 Asp - 碱性氨基酸 : pi = (pk2 + pk R-NH2 )/2 两个氨基的解离平衡常数负对数的一半 pk R-NH2 问题 :Lys 的等电点 中性氨基酸的 pi 在微酸性 ; 碱性氨基酸的 pi 在碱性 ph 范围 ; 酸性氨基酸的 pi 在酸性 ph 范围 (5) 氨基酸的电泳分离 ph=6 ph = pi, 样品带的净电荷为零, 样品点不移动 pi ph > 0, 两性离子带净正电荷, 样品点向阴极移动 若 pi ph < 0, 两性离子带净负电荷, 样品点向阳极移动 差值越大, 所带的净电荷越多

8 3 氨基酸参与的 N- 末端测序反应 (1)N- 末端测序反应的特征 发生于多肽或蛋白质的氨基端即 N- 末端 通常用于鉴定多肽或蛋白质 N- 末端测序 弱碱性溶液中 α- 氨基的氢都是被取代 (2) 反应类型 烃基化反应 氨基酸的 α- 氨基的氢可被烃基取代 与酰化试剂反应 氨基酸的 α- 氨基的氢被酰基取代 (3) 烃基化反应 1DNFB Sanger 试剂 2,4- 二硝基氟苯 dinitrofluorobenzene 生成 DNP 氨基酸 dinitro phenyl amino acid 多肽或蛋白质的游离末端氨基与 DNFB 反应后生成 DNP- 多肽或 DNP- 蛋白质 再通过酸水解肽键, 多肽或蛋白质分解为游离的氨基酸 由于 DNFB 与氨基形成的键对酸水解比肽键稳定, 因此 DNP- 多肽经酸水解后, 只有 N- 末端的氨基酸为黄色 DNP- 氨基酸, 其余都为游离氨基酸 2PITC 苯异硫氰酸酯 phenylisothiocyanate (PITC) 也称为 Edman 试剂 生成 PTC- 氨基酸和 PTH- 氨基酸 接着使用层析法分离鉴定

9 先在弱碱性溶液中生成 PTC- 氨基酸 即苯氨基硫甲酰衍生物 然后在酸溶液中环化生成 PTH- 氨基酸 苯氨基硫甲酰衍生物 在多肽和蛋白质测序反应中 PTH- 氨基酸会从肽链中掉下来 经层析法分离鉴定 接下来的 N- 端氨基酸再参加下一轮反应 又称为 Edman 降解法 环化 酸性溶液 (4) 与酰化试剂反应 DNS 丹磺酰氯 (dansyl chloride) 生成 DNS- 氨基酸 5- 二甲基氨基萘 -1- 磺酰氯 4 α- 氨基和 α- 羧基共同参与的反应 由于 DNS 具有强烈的荧光, 灵敏度比 DNFB 法高 100 倍 可以用于 N- 末端氨基酸的标记和微量氨基酸的定量测定 也可以用于多肽和蛋白质测序, 且水解后的 DNS- 氨基酸不需要提取, 直接用纸电泳或薄层层析法就可以分离 包括 成肽反应 构成肽和蛋白质 茚三酮反应 常用于氨基酸的定性或定量检测 茚三酮在弱酸性溶液中与氨基酸共热 氨基酸氧化脱氨脱羧反应, 亚氨基酸直接反应

10 (1) 成肽反应 一个氨基酸的 α 氨基和另一个氨基酸 α 羧基脱水缩合, 生成的酰胺叫做肽, 这种酰胺键叫做肽键 H O H H O H 2 N C C OH H N H C COOH H 2 N C C R 1 R 2 H R 1 2 O H HNC COO R 2 peptide bond (2) 茚三酮反应 ( 检测和定量反应 ) 肽键的性质 具有部分双键的性质 比通常的 C-N 单键短 通常有一个反式构型 不能自由旋转 反应特征 加热, 弱酸性溶液茚三酮与氨基酸反应 也可与有游离 α- 氨基的肽反应 采用的是水合茚三酮 游离氨基的 α- 氨基氨基酸脱羧脱氨 产物有两种 具有游离氨基的 α- 氨基酸都生成蓝紫色化合物 (570nm) 而亚氨基酸, 则生成黄色化合物 (440nm) 两个亚氨基酸为脯氨酸, 羟脯氨酸 一定的反应条件下, 产生的颜色的强度 ( 溶液中的光吸收 ) 与氨基酸浓度成比例 根据溶液的吸光度, 可以算出相应的氨基酸和蛋白质的浓度 在法医学上, 使用茚三酮反应可采集嫌疑犯在犯罪现场留下来的指纹 因为手汗中含有多种氨基酸, 遇茚三酮后起显色反应 茚三酮 水合茚三酮

11 (1) 氨基酸脱羧 (2) 脱氨形成醛, 水合茚三酮被还原 (3) 水合茚三酮和还原型缩合 四 氨基酸的层析分离 ( 色谱分离 ) 层析法是近代生化中非常有效的常用分离方法 1 分配层析的一般原理 (1) 层析系统通常由两个相组成 固定相 ( 静相 ) 固定相能对各种溶质的流动产生不同的阻滞作用 可以为固相, 液相, 气相 流动相 能携带溶质沿支持物流动 流动相流过固定相时, 各组分以不同的速度移动, 而达到分离的 可以为液相, 气相 液相层析更多用 (2) 分配定律 1891 年 Nernst 分配系数 = 物质在流动相中的总量 / 物质在固定相中的总量 如需分离氨基酸混合物, 各种氨基酸成分的分配系数要有差异, 差异越大, 越容易分开

12 2 离子交换层析 离子交换柱层析 是用离子交换剂作为水不溶性支持物兼固定相, 装成层析柱 用不同 ph 和不同离子强度的缓冲液作流动相 ( 洗脱液 ) 构成的柱层析技术 (1) 离子交换剂是由带有电荷的树脂或纤维素组成 树脂颗粒是聚苯乙烯 - 苯二乙烯, 带电基团是后来的化学反应加上的 阴离子交换基质结合带有负电荷的氨基酸或蛋白质 所以这类氨基酸被留在柱子上, 然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施, 将吸附在柱子上的氨基酸洗脱下来 结合较弱的氨基酸首先被洗脱下来 (2) 强阳离子交换树脂 阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质或氨基酸 这类氨基酸被留在柱子上留在柱子上 然后通过提高洗脱液中的盐浓度或改变 ph 值等措施 将吸附在柱子上的蛋白质或氨基酸洗脱下来 常用的是带有耐酸性非常强的磺酸根 SO 3 -Na + 在 ph2 3 的条件下, 各种氨基酸都带正电荷, 结果 X+ 与 Na+ 交换 ( 阳离子交换 ), 形成 SO3-X+ 在样品与树脂充分交换后, 可通过提高流动相中的盐浓度, 或改变流动相的 ph, 或是同时采用这两种方法, 就可以将结合于树脂上的 X+ 成分, 按照它们与树脂结合的强弱程度不同逐一地洗脱下来

13 不同氨基酸在 ph2 3 的条件下, 氨基酸与树脂的结合力受两种因素影响 (1) 静电亲和力大小 碱性氨基酸 (A2+)> 中性氨基酸 (A+)> 酸性氨基酸 (A±) 用缓冲液洗脱时, 随 ph 由低到高, 氨基酸洗脱流出的次序大体上是酸性氨基酸先流出, 其次是中性氨基酸, 最后是碱性氨基酸 (2) 氨基酸与树脂的疏水作用 R 基团与树脂间亲和力小者先流出, 大者后流出 (3) 离子交换层析技术的自动化 氨基酸的分离过程 离子交换色谱用氨基酸自动分析仪分析氨基酸混合物的洗脱曲线 ( 阳离子交换剂 ) 每种氨基酸的浓度测定 3 高效液相层析 (HPLC) HPLC 分析氨基酸混合物的洗脱曲线 采用的固定相支持物颗粒很细 采用高压, 洗脱速度快 可以与柱层析结合

14 第二节蛋白质的结构和功能 一 蛋白质的简介 (Protein) 1 蛋白质的研究简史 1838 年 Muller 研究了血清 蛋清 蚕丝等物质的元素组成后, 发现它们均可以用 C 40 H 62 N 10 O 12 来表示, 命名为 Protein 并发展成 基团 学说 19 世纪末从蛋白质水解产物分离得到了 13 种氨基酸 1902 年 H.E. Fischer, Hofmeister 同时提出肽键理论 1953 年 Sanger 确定了牛胰岛素的一级结构 1958 年 Perutz & Kendrew 用 X 光衍射法确定了肌红蛋白的立体结构 1960 年 Anfinsen 证明蛋白质的一级结构决定其立体结构, 获得诺贝尔奖 1997 年提出蛋白组学研究的概念 蛋白质组学 (Proteomics) 一词, 源于蛋白质 (protein) 与基因组学 (genomics) 两个词的组合 意指 一种基因组所表达的全套蛋白质, 即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质 蛋白质组本质上指的是在大规模水平 上研究蛋白质的特征, 包括蛋白质的表达水 平, 翻译后的修饰 2 蛋白质的化学组成 蛋白质是一类含氮有机化合物 除含有碳 氢 氧外, 还有氮和少量的硫 某些蛋白质还含有其他一些元素, 主要是磷 铁 碘 锌和铜等 这些元素在蛋白质中的组成百分比约为 : 碳 50% 氢 7% 氧 23% 氮 16% 硫 0 3% 其他微量 蛋白质含量的测定 : 凯氏定氮法 样品含氮量平均在 16% 取其倒数 100/16=6.25, 即为蛋白质换算系数 其含义是样品中每存在 1g 元素氮, 就说明含有 6.25g 蛋白质 ); 故 : 蛋白质含量 = 氮的量 6.25

15 3 什么是蛋白质? 蛋白质是一切生物体中普遍存在的, 由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子 ; 其种类繁多, 各具有 定的相对分子质量 分子量从 6000 到 蛋白质分子量 = 氨基酸的数目 *110 其单位为道尔顿 Dalton,D 蛋白质分子量较大, 经常用 KD 复杂的分子结构和特定的生物功能 是表达生物遗传性状的一类主要物质 4 蛋白质的功能 催化 : 酶 调节 : 激素, 参与基因表达的调控因子 转运 : 血红蛋白, 血清蛋白, 膜转运蛋白 运动 : 肌动蛋白 结构 : 胶原蛋白 防御和进攻 : 抗体, 抗冻蛋白 受体蛋白 : 识别, 结合 异常蛋白 : 贝壳分泌的胶质蛋白 5 蛋白质的分类 (1) 按蛋白质的形状和溶解度分类 膜蛋白 与细胞各种膜系统结合 不溶于水 疏水性氨基酸多 球状蛋白 分子近似球形或卵圆形 水溶性好, 亲水性氨基酸侧链暴露在外表面 能结晶 纤维状蛋白 分子纤维状, 不对称 大多数不溶于水 少数溶于水 如肌球蛋白, 血纤维蛋白原 (2) 按是否有生理活性分类 A 非活性蛋白质 : 对生物体起保护和支持作用的蛋白质 大部分为纤维蛋白 ( 结构蛋白, 静态蛋白 ) 主要功能是维持和支撑单个的细胞和整个的有机体 ( 动物多 ), 比较伸展的结构 a- 角蛋白和胶原蛋白是最常见的纤维蛋白 具有重复的二级结构 B 活性蛋白质 : 为球蛋白 多肽链紧密折叠 轮廓上象一个球型的大分子 至少具备三级结构 例如 : 酶类 ( 占细胞内蛋白质种类的绝大部分 ); 运输蛋白 ; 收缩运动蛋白 ; 激素蛋白 ; 毒素蛋白 ;

16 (3) 按照分子组成分类 单纯蛋白质 水解产物只有氨基酸 根据溶解性的不同, 可将简单蛋白分为 7 类 : 清蛋白 ( 溶于水 ), 球蛋白 ( 溶于稀盐溶液 ) 谷蛋白 ( 溶于稀酸或稀碱 ), 谷醇溶蛋白 ( 溶于 70%-80% 的乙醇 ) 组蛋白 ( 溶于水或稀酸, 可用稀氨水沉淀 ) 精蛋白( 溶于水或稀酸, 不溶于 氨水 ) 和硬蛋白 ( 只能溶于强酸 ) 缀合蛋白质 水解产物中除了氨基酸外, 还有金属离子和其它物质 ( 辅基 ) 结合蛋白根据其辅基的不同有好多种 核蛋白 脂蛋白 糖蛋白 磷蛋白 血红素蛋白 黄素蛋白和金属蛋白 6 蛋白质的结构层次 其中包括蛋白质的一级结构 二级结构 三级结构和四级结构 空间结构的层次 二级结构是指主链的氨基酸残基空间排布关系 具有二级结构的典型代表的是纤维蛋白质 三级结构是指主链和侧链所有原子的空间排布 一条多肽链形成紧密的一个或多个球状单位或结构域 如球蛋白 7 稳定蛋白质分子构象的作用力 四级结构并不是每个蛋白质都具有的 指寡聚蛋白质分子中各个亚基的空间排布关系, 亚基的数目和类型. 只有那些由两条或两条以上多肽链组成的蛋白质才可能具有四级结构 每一条肽链具有独立的三级结构也称为亚基 肽链可以是相同的, 也可以是不同的

17 (1) 非共价键 ( 次级键 ) A 氢键 13-30KJ/mol 协同蛋白质的折叠, 帮助稳定蛋白的天然构象 大多数氢键都是 N-H O 类型的 尤其是多肽链骨架的羰基和酰胺基之间 此外在多肽链骨架和水之间, 极性侧链和水之间也可以形成氢键 多肽链骨架和极性侧链之间, 两个极性侧 B 疏水相互作用是构象形成的驱动力 12-20KJ/mol 不是彼此间有吸引力, 而是为了避开水 蛋白质中的疏水基团彼此靠近 聚集以避开水的现象称之疏水相互作用或疏水效应 非极性侧链避开水聚集被压迫到蛋白质分子内部 而大多数极性侧链在蛋白质表面维持着与水的接触 C 盐键 D 范德华力 盐键 12-30KJ/mol 离子化的侧链一般都出现在球蛋白的表面 在酸性氨基酸和碱性氨基酸侧链之间 带有相反电荷的侧链之间的离子相互作用也能帮助稳定球蛋白 非极性分子或基团之间的范德华力 4-8KJ/mol 属于狭义的范德华力, 也是色散力 只有当两个非极性残基之间处于一定距离时吸引力才能达到最大 虽然范德华力相对来说比较弱, 但由于范德华力相互作用数量大, 并且具有加和性, 因此范德华力对蛋白的稳定性也有贡献 (2) 共价键 二硫键 210KJ/mol 多在多肽链 β- 转角处形成 并不规定多肽链的折叠, 但可以稳定构象 多存在于由细胞分泌的蛋白质中 当这样的蛋白质离开细胞内环境时, 由于有二硫键的存在, 可使得蛋白质对去折叠以及降解不那么敏感, 而维持蛋白质的稳 定

18 二 蛋白质的一级结构 1 什么是一级结构 即肽链中的氨基酸组成和排列顺序 结构单位是 氨基酸 维持力 肽键 一级结构从 N 端向 C 端 胰岛素的三级结构 2 蛋白质的变性 (1) 定义 : 物理因素或是化学处理引起蛋白质天然构象的破坏, 并伴随着生物活性的丧失, 这一过程称为蛋白质变性 (denaturation) 变性后一级结构没有发生变化 空间构象发生变化 分子的紧密构象变成了松散的无序状态 天然构象破坏, 从而引起理化性质改变, 生物活性丧失 (2) 蛋白质变性的因素 : 物理因素 破坏氢键 加热 紫外线 剧烈振荡, 加压, 超声波 化学因素 尿素, 乙醇, 丙酮 通过提供自己的 N,O 代替肽链中的 N,O, 破坏氢键 重金属盐 提供阳离子与蛋白质中游离的羧基生成盐键 强酸 强碱

19 (3) 分类 可逆性变性 : 尿素 不可逆性变性 : 强酸或强碱, 重金属 (4) 变性后的一些重要的性质 生物学活性丧失 这是蛋白质变性的最重要的明显标志之一 变性蛋白质比天然蛋白质易被蛋白酶水解 原来有秩序卷曲的紧密结构变为无秩序的松散伸展状结构, 一些化学键的外露, 使蛋白质的分解更加容易 变性蛋白质比天然蛋白质易被蛋白酶水解 溶解度降低 容易发生凝集 沉淀 是由于高级结构受到破坏, 使分子表面结构发生变化, 亲水基团相对减少, 容易引起分子间相互碰撞发生聚集沉淀 旋光性改变, 粘度增加, 光吸收性质增强, 失去了结晶能力 由于侧链基团外露, 颜色反应增强 3 蛋白质变性实验 -Christian B. Anfinsen (1) 实验对象 : 核糖核酸酶 A Rnase A 一条多肽链,4 个二硫键 其活性表现为分解 RNA 失活时不分解 RNA (2) 实验试剂 打开氢键 8M 尿素 尿素 打开二硫键 还原剂 2- 巯基乙醇又称为 β- 巯基乙醇 其化学式为 HOCH 2 CH 2 SH (3) 实验步骤 1 蛋白质空间构象改变 (2- 巯基乙醇 +8M 尿素 ) 使 Rnase A 失去有序规则的空间构象 结果 Rnase A 失去分解 RNA 的活性 结论 : 蛋白质天然构象破坏, 生物活性丧失 加入 2- 巯基乙醇 +8M 脲

20 2 只是去除 2- 巯基乙醇, 暴露在空气中 形成的蛋白质中有 99% 都含有不正确的二硫键 而且活性大约是原来酶活性的 1 % 保留 8M 尿素作用, 去除巯基乙醇, 此时有 105 种的二硫键可能性 3 将 2- 巯基乙醇和脲同时都除去 将它于生理 ph 条件下暴露在空气中, Rnase A 会自发地获得它的天然构象 由 2 和 3 得出的结论是 : 蛋白质的空间结构是由一级结构确定的 除去 2- 巯基乙醇 +8M 脲 4 一级结构与功能的关系 (4) 结论 Christian B. Anfinsen 的蛋白质变性实验充分证明了一级结构, 构象, 活性三者间的关系 蛋白质的一级结构决定其构象 规定其构象所需要的信息包含在它的氨基酸序列之中 (1) 有的部位则可以改变, 切除或更换别的残基都不影响生物活性, 有的部位保守性很强, 出现更换或缺失会造成活性改变 血红蛋白 β 亚基 6 位 Glu 被 Val 代替 ( 基因突变 ), 即表现为镰刀状贫血, 为世上最常见的血红蛋白病 蛋白质的构象决定其蛋白质的活性 蛋白质功能取决于其特定的天然构象 (2) 有的部位必须切除之后, 蛋白质分子才显活性

21 (3) 比较不同生物细胞色素 C 的一级结构可以帮助了解物种间的进化关系, 物种间越接近, 则细胞色素 C 的一级结构越相似 蛋白质一级结构序列数据库 1. 欧洲生物信息中心研究所和瑞士生物信息研究所共同管理的 SWISS-PROT 有 10 多万条肽链的信息 ; 2. 美国国家生物医学基金会主持的 PIR 有近 30 万条肽链的信息, 但多数由核酸信息翻译而来, 有些未经严格检验 3. 美国政府支持的 Gen Bank 和欧洲的 EMBL 有大量的基因序列信息, 从其阅读框可以得到蛋白质序列的不少信息 三 蛋白质的二级结构和功能 二级结构是靠氢键维持稳定 1 什么是蛋白质的二级结构 二级结构 : 一段多肽链主链的氨基酸残基的空间排布方式 为主链构象, 不涉及侧链构象 维持力 : 以肽链内部或肽链间的氢键维持 结构单位 : 这些主链基本构象都是以酰胺平面 ( 或称肽键平面 肽单元 ) 为基本结构单位, 有规则的盘曲而成 类型 : 包括 α- 螺旋 β- 折叠以及 β- 转角, 无规则卷曲 2 肽平面 肽平面 肽键的 C 和 N 均为 sp2 杂化, 有部分双键的性质, 相关的 6 个原子处于的共平面 肽平面内两个 Cα 多处于反式构型 羰基的氧与 N 上的氢也是反式构型

22 二级结构以肽平面为结构单位 两个肽平面以一个 C α 为中心发生旋转 3 二级结构类型 (1)α - 螺旋结构 各个肽平面围绕同一轴旋转形成螺旋 右手螺旋多见 每一圈包含 3.6 个氨基酸残基 螺距为 0.54nm, 每个残基跨距为 0.15nm 螺旋通过主链内部氢键维持稳定 每个肽键的 CO 和其后方第 5 个 (n+4) 肽键的 NH 形成氢键 几乎平行于螺旋的长轴 α 螺旋的手性 α- 螺旋结构形成的限制因素 凡是有 Pro 存在的地方, 不能形成 因 Pro 形成的肽键 N 原子上没有 H, 不能形成氢键 若一段肽链有多个酸性或碱性氨基酸相邻, 也防碍 α 螺旋的形成 如 Glu 因 ph=7.0 时都带负电荷, 防碍 α 螺旋的形成 如 Asn Leu 侧链很大, 防碍 α 螺旋的形成

23 (2)β- 折叠或 β- 片层结构 肽平面充分伸展折扇状构象的肽链 两条或两条以上按肽链的长轴方向平行排列形成折扇状或锯齿状 链间的氢键联结维系 主链亚氨基 (NH) 和羰基氧原子之间形成有规律的氢键 β- 折叠 b- 折叠有两种类型 一种为平行式, 即所有肽链的 N- 端都在同一边 另一种为反平行式, 即相邻两条肽链的方向相反 平行式和反平行式 纤维状蛋白质主要是反平行式 球状蛋白质两种方式几乎同样广泛存在 重复周期 肽链同侧两个相邻的同一基团之间的距离在平行式的是 0.65nm, 反向平行是 0.7nm (3)β- 转角 β- 转角是由 4 个连续的残基组成的 主链在盘曲折迭运行中往往发生 180 的急转弯, 这种回折部位的构象即所谓 β- 转角 第一个残基的羰基与第四个残基的氨基间形成氢键联结 这类结构主要存在于球状蛋白分子的表面 (4) 无规则卷曲 randon coil 不能被列入明确的二级结构的区段 除了明确的二级结构以外, 主链骨架的其他部分就被称为无规则卷曲 实际上这些区段大多数既不是卷曲, 也不是完全无规

24 3 α- 角蛋白 (1) 由 α- 角蛋白组成动物的毛发, 甲, 蹄, 角, 爪 (2) 基本结构单位 初原纤维 (protofibril) 原纤维是 3 条右手 α- 螺旋形成的一个左手超螺旋 直径 2nm 微原纤维 11 条初原纤维组成 直径 8nm 大纤维 成百根微原纤维组成的 直径是 200nm纤丝 一根头发 初原纤维 2nm 三个 α 螺旋形成左手螺旋 大纤维 200nm 微原纤维 8nm 9+2 电缆式 (3) 维持 α- 角蛋白结构稳定的力 螺旋内部的氢键 螺旋和超螺旋的反向盘绕 分子间二硫键 增加了整体的稳定性和拉伸性 二硫键的数目越多, 刚性越强 蹄, 角, 爪都是含硫量高, 称为硬硫蛋白 毛发是软硫蛋白 (3) 生化烫发的原理是什么? α- 螺旋 还原剂

25 (4) 砷可以与头发中硫结合 光绪皇帝猝死之谜 1908 年 11 月 14 日,38 岁的光绪皇帝死在作为囚禁地的中南海瀛台 中国原子能科学家对光绪死因的研究始于 2003 年 7 月 清西陵陵墓管理处库房保存有光绪的头发 通过中子活化分析头发 中子活化分型是一种 光绪死于急性砒霜中毒 光绪头发中砷含量最高达到 2404 微克 / 克 正常人头发的含砷量在 微克 / 克 砷在自然界分布很广, 多以硫化物和氧化物形式存在, 主要有雄黄 ( 二硫化二砷 ) 雌黄( 三硫化二砷 ) 砒霜( 三氧化二砷 ) 排除了服用药物慢性中毒的可能性 慢性砷中毒患者的头发, 研究发现其砷分布曲线与光绪头发的完全不同 光绪头发中砷含量的高峰既不在发根 处 也不在发梢处 光绪每件衣服的胃区部位 系带和领肩部 4 β- 角蛋白 (1) 由 α- 角蛋白形成 在湿热中 α- 角蛋白伸展后形成称为其 β 构象 重复周期是 0.65nm (2) 天然的 β 蛋白构成蚕丝和蜘蛛丝 蚕丝和蜘蛛丝的蛋白也称为是丝心蛋白 反平行式的 β 折叠堆积成多层结构 重复周期是 0.7nm 链间以氢键维持, 层间以范德华力维系 拉伸度稍差 β 折叠本身就是很伸展的结构 质地柔软 因为堆积的折叠片层之间的作用力只是侧链之间的范德华力 抗张强度高 交替层通过 Gly,Ala,Ser 残基侧链 连锁起来 这种结构方式使得丝心蛋白所承担的张力并不直接放在多肽链的共价键上, 使得丝纤维有很高的抗张强度

26 (2) 丝心蛋白是反平行式的 β 折叠堆积起来的 β- 角蛋白 蚕丝柔软, 抗张力强度高, 很柔软, 但不能拉伸 5 胶原蛋白 (1) 分布 : 脊椎动物和无脊椎动物中含量最丰富的结构蛋白 使皮肤, 骨 软骨, 血管和具有机械强度 占哺乳动物内总蛋白的 25% 至 35% 如每百克猪皮中含蛋白质 26.4 克, 主要成分是胶原蛋白 如皮肤的胶原蛋白 脊椎动物的皮肤含有编织比较疏松, 向各个方向伸展的胶原纤有一定支持作用 增加皮肤贮水的功能 皮肤的结构 骨骼中的胶原纤维周围排列着羟基磷灰石结晶 胶原纤维 胶原蛋白

27 动脉由内膜, 中膜和外膜组成 外膜由结缔组织组成 中膜由平滑肌, 弹性纤维和胶原纤维组成 血管中的胶原纤维排列成弹性的网状 (2) 结构单位 原胶原蛋白分子 一个由 3 条具有左手螺旋的链相互缠绕形成右手超螺旋的分子 每一螺圈含 3 个残基 任一圈的第三个都是 Gly, Gly 数目占残基总数的三分之一 Gly-X-Y- 常出现在胶原分子中 X 常为 Pro,Y 为 Lys 常为 Hpro( 羟脯氨酸 ) 6 为什么人类缺乏维生素 C 会导致坏血病? (1) 胶原蛋白参与血管管壁的支撑结构组成 胶原蛋白中羟脯氨酸和羟赖氨酸较多, 它们可以增强多肽链间的氢键, 稳定胶原蛋白结构 动脉血管壁结构 其中弹性膜由胶原纤维和弹性纤维组成 (2) 羟化酶参与胶原蛋白的形成 脯氨酸和赖氨酸经脯氨酸羟化酶, 赖氨酸羟化酶作用生成羟脯氨酸, 羟赖氨酸, 装配成胶原蛋白脯氨酸羟化酶 羟脯氨酸 脯氨酸 羟脯氨酸 (3) 维生素 C 作为辅助因子, 利用其还原性保持脯氨酸和赖氨酸羟化酶的活性 即维生素 C 的作为还原剂维持脯氨酸羟化酶和赖氨酸羟化酶的空间结 脯氨酸羟化酶的空间结构 人类缺乏 L- 古洛糖酸内酯氧化酶 人体患有坏血病 血管管壁变脆 容易出血 人体维生素 c 缺乏引起坏血病的机制 人体自身不能合成 L- 维生素 C 如果从外界摄取不到足够的 L- 维生素 C 人体 L- 维生素 C 减少 脯氨酸, 赖氨酸羟化酶的活性降低, 羟化氨基酸减少 胶原蛋白结构缺陷

28 四 蛋白质的三级结构和球状蛋白质 1 什么是三级结构 三级结构 蛋白质分子主链和侧链所有原子或原子团的空间排布关系 结构单位 结构域 维持力 次级键 : 其中疏水作用力最重要 共价键 : 二硫键 2 三级结构特征 是紧密近似球状的实体 含多种二级结构元件 形成亲水表面, 疏水核 亲水表面能吸附形成厚厚的水化膜和双电层 对蛋白质分子构象起很好的保护作用 分子表面有空穴 是结合底物, 效应物等配体, 行使生物学功能的活性部位 通常是一个疏水的区 3 三级结构的结构单位 结构域 (1) 超二级结构 几个二级结构单元组合在一起形成超二级结构 作为大的功能单位结构域的一部分 αα,βαβ, ββ, ββββ 有两个结构域 (2) 结构域 在三级结构内分立的 独立折叠的单位称之结构域 (domain), 通常由几个超二级结构单位组成的

29 只有一个结构域 4 三级结构实例 - 肌红蛋白 (1) 主要生物学功能 位于脊椎动物肌肉中, 结合氧从而贮存氧, 并且容易在肌肉内部扩散 海洋哺乳动物的肌肉中肌红蛋白占总蛋白的 8% (2) 肌红蛋白的一级结构 由 153 个氨基酸残基组成的一条多肽链组成的 含有一个血红素辅基 (3) 肌红蛋白的三级结构 A 八个 a- 螺旋组成的一个结构域 肌红蛋白中的四分之三氨基酸残基都处于 a- 螺旋中 B 内部几乎都是由疏水氨基酸残基组成的 血红素辅基处于一个疏水的 象个笼子似的裂隙内 如缬氨酸 亮氨酸 异亮氨酸 苯丙氨酸和蛋氨酸 血红素中的铁原子是氧结合部位 C 大多数可离子化的残基都位于表面 表面既含有亲水的氨基酸残基, 也含有疏水 的氨基酸残基 (4) 辅基血红素和 Fe 血红素辅基包括两个部分 卟啉 四吡咯系统 彼此间通过亚甲基桥形成卟啉结构 有很强的着色能力 亚铁 有六个配位键 其中垂直于平面的键, 一个与第 F 段的 His 结合, 一个是开放的, 随时可逆地结合氧 亚铁状态维持不变 (4) 肌红蛋白的氧合曲线 无氧的肌红蛋白称之脱氧肌红蛋白, 而载氧的分子称之氧合肌红蛋白 可逆结合氧的过程称之氧合作用 结合氧的情况可以通过氧合曲线看出 po2 为氧分压 Y 为氧饱和度, 氧饱和度是指氧合 Hb 或氧合 Mb 占总量的百分比

30 O 2 的结合改变肌红蛋白的构象 O 2 与 Fe 开放的配位键结合 3 O 2 与 Fe 开放配 位键结合 Mb 的氧合曲线是双曲线形在很低的氧分压时 ( 静脉血中 ) 也很容易饱和 P 50 五 蛋白质的四级结构和功能 1 亚基 亚基 四级结构蛋白质中每一条具有独立三级结构的多肽链称为亚基, 单独存在时没有生物学活性 什么是寡聚蛋白质? 由两条或两条以上多肽链通过非共价键组成的蛋白质称为寡聚蛋白质, 其中每条多肽链都具有独立的三级结构 就是指具有四级结构的蛋白质 寡聚蛋白质一般具有多个配体结合部位 配体可以是底物或调节物 在寡聚蛋白的多个亚基上可以有同一种配体的多个结合部位 配体可以是多种小分子 底物 : 如氧气 结合部位称为底物结合部位 调节物 : 非底物分子如 2,3- BPG 调节物结合部位

31 2 四级结构 什么是四级结构? 指寡聚蛋白质分子中亚基的数目和类型, 各个亚基的空间排布关系, 但不涉及亚基本身的构象 结构单位 亚基 : 具有三级结构的多肽链 单独的亚基一般没有生物学功能 维持力 非共价键 为各亚基之间的作用力如氢键 离子键 疏水键, 范德华力 两个亚基的结构 3 寡聚蛋白质分子的亚基组成 亚基类别组成有两种类型 均一寡聚蛋白 是由相同亚基组成的均一寡聚蛋白 如过氧化氢酶, 是由四个相同亚其组成的四聚体, 每个亚基的一 二 三级结构都相同, 功能也相同 非均 寡聚蛋白 是由结构不同的亚基组成的, 如血红蛋白 4 四级结构实例 - 血红蛋白 过氧化氢酶的结构 由四个完全相同的亚基组成 铁离子在图中用绿色标记, 它被紧紧地束缚在圆形的血红素中心 (1) 功能 结合氧并运输氧, 运输 H + 和 CO 2 从肺中结合氧, 转运到身体的各个部分释放利用 人类每个红细胞中充填了大约 个血红蛋白分子

32 (2) 四级结构 ( a 2 β 2 ) 成年人的血红蛋白 四个亚基 两种类型 : 是一个由两个 a 亚基和两个 β 亚基组成的四聚体 亚基空间排布 a 和 β 位于四面体的四个角 隔着一个空腔彼此相向 a 和 β 的三级结构都很类似于肌红蛋白 a 和 β 链为 141,146 氨基酸残基 5 肌红蛋白 (Mb) 和血红蛋白 (Hb) 的氧合性差异 (1) 氧合曲线不同 肌红蛋白和血红蛋白的生理功能依赖于血红素辅基可逆地结合氧 Hb 氧合曲线是 S 形 Mb 氧合曲线是双曲线 在高 po2 情况下 如在肺部 ( 大约 100 torr) 时, 血红蛋白氧的亲和性都很高 低于大约 50 torr 以下的 po2 时 肌红蛋白对氧的亲和性明显要比血红蛋白对氧的亲和性高得多 在肌肉等组织的毛细管内 由于 po2 低 (20-40 torr), 血红蛋白对氧的亲和性低, 所以红细胞中血红蛋白载有的很多氧被释放出来, 释放出来的氧都可被肌肉中的肌红蛋白结合 肌红蛋白和血红蛋白对氧亲和性的差异形成了一个有效的将氧从肺转运到肌肉的氧

33 (2) 组织中 Mb 与氧亲和力大于 Hb 其原因是脱氧的 Hb 较为稳定 Hb 分子内形成八对盐桥, 分子构象受到约束, 较为稳定, 因而与氧的结合能力弱 虽然血红蛋白是多亚基, 但亲和力小于肌红蛋白 在组织中, 低氧分压时将氧气释放给肌红蛋白 Hb 分子内形成八对盐桥, 分子构象稳定 (3)Hb 结合氧和释放氧的速度比 Mb 快 当氧分压变化相同时, 血红蛋白的 ΔY 变化比较大 当一个 α 亚基和氧结合后部分盐桥被破坏, 某些氨基酸发生移位, 与氧结合点随即暴露出来, 使得一个 β- 亚基构象改变, 它对 O 2 的亲和力增加 当这一对 αβ 亚基与 O 2 结合后, 就增加了另一对 αβ 亚基对氧的亲和力, 与氧结合反应的平衡常数增加了 5 倍 第一个分子氧结合血红蛋白时并不有利, 可是一旦发生结合, 就使得其它的氧分子 Y1 Y1 Y2 Y 肌红蛋白和血红蛋白对氧亲和性的差异 使得血红蛋白承担着将氧由肺运输到外周组织的任务 而肌红蛋白主要是接收血红蛋白释放的氧 形成了一个有效的将氧从肺转运到肌肉, 组织的氧转运系统

34 6 别构效应 (2) 别构效应分类 (1) 别构效应 配体与寡聚蛋白的一个亚基的结合不仅改变了该亚基的构象, 还通过亚基的相互作用改变其他亚基的构象, 从而改变了整个蛋白质生物活性, 这种现象称为别构效应 具有别构效应的蛋白质称为别构蛋白 别构效应只会发生在四级结构 是多亚基蛋白质调节活性的重要方式之一 1 同促效应 同一种配体作用于不同亚基的相同部位而发生影响称为同促效应 或者说别构物为底物时的别构效应 同促效应大部分表现为正协同效应 如一个底物分子的结合别构蛋白的某个部位, 改变了整个蛋白质构象, 促进后续底物分子的结合 正协同效应曲线是 S 形 如血红蛋白中一个氧分子的结合促进后续氧的 结合, 结合氧和释放氧的速度都比较快, 表现 了氧分子的正协同效应 负协同效应 3- 磷酸甘油醛脱氢酶是负协同效应酶的典型代表 底物是 3- 磷酸甘油醛和 NAD + 一个亚基与 NAD + 结合后发生构像变化, 其它亚基与 NAD + 结合的能力下降, 表现为负协同效应 酶的反应曲线为平坦双曲线 2 异促效应 不同配体结合不同的部位对别构蛋白整个构象的影响称为异促效应 或者说别构物不为底物时的别构效应 有时就称为是别构效应, 是狭义的别构效应 这种非底物的别构物结合的部位称为别构部位 2,3BPG 结合血红蛋白产生一种异促效应 2,3BPG,2,3- 二磷酸 -D- 甘油酸 在红细胞中, 与血红蛋白的浓度几乎是等摩尔的物质, 可以调节血红蛋白结合氧的能力 其结合部位位于两个 β 亚基之间的空隙中 2,3BPG 结合脱氧血红蛋白后使其结构更稳定, 对氧亲和力更低

35 7 Hb 的氧合曲线 S 形与别构效应 血红蛋白的氧合曲线呈 S 形 血红蛋白是一个别构蛋白, 有多个配体结合位点, 通过三种别构效应实现对氧结合的调节 配体包括 氧, 于血红素结合 CO 2 和质子 2,3BPG,2,3- 二磷酸 -D- 甘油酸 (1) 氧分子的正协同别构效应 氧分子结合血红蛋白表现为一种正协同效应 脱氧的血红蛋白的比较稳定 分子内形成八对盐桥, 而与氧的结合能力弱 一个 α 亚基的血红素与 O 2 结合会促进其它亚基与 O 2 结合 立即引起该 α 亚基的构象发生改变 部分盐桥被破坏, 某些氨基酸发生移位, β- 亚基与氧结合点随即暴露出来, 对 O 2 的亲和力增加 这一对 αβ 亚基与 O 2 结合后, 就增加了另 (3) 2,3BPG 对血红蛋白的异促效应 2,3BPG 非底物分子, 降低 Hb 的氧亲和力, 别构部位 结合部位在 Hb 中位于两个 β 亚基之间的空隙中 2,3BPG 带有负电荷可与 2 个 β 亚基结合形成 6 个盐键, 稳定脱氧状态的 Hb 的构象 由 β- 亚基提供 8 个正电荷 (1)N1(2)His2(3)Lys82(4)His143 2,3- 二磷酸 -D- 甘油酸 带有 5 个负电荷可与 2 个 β 亚基结合形成 6 个盐键, 稳定脱氧状态的 Hb 的构象 β 亚基提供 8 个正电荷 (1)N1(2)His2(3)Lys82(4)His143

36 别构部位 : 2,3BPG 与血红蛋白结合部位, 位于两个 β- 亚基之间的空隙中 与 2 个 β 亚基结合, 稳定了脱氧血红蛋白的构像 氧合之后, 两个 β- 亚基距离减少, 而将 BPG 排挤出去 铁原子距离由 39.9 埃减到 33.4 埃 1 torr=1mmhg 1 假设没有 2,3BPG 时 在氧分压大约为 20mmHg 时, 血红蛋白几乎氧饱和了 如氧分压大于 20mmHg, 血红蛋白就不能将它结合的氧卸载给肌红蛋白 24.5mmol/L 的 2,3BPG 存在下 30mmHg 时只有部分的血红蛋白结合氧 组织中氧分压只有 20-40mmHg 3 高原地区, 2,3BPG 增加 只要待上一天就会适应 是因为血红蛋白中 BPG 的浓度增加 氧合曲线向右移动 相同的氧分压下, 具有 2,3BPG 的红细胞中的血红蛋白对氧的亲和性要比没有 2,3BPG 的要低, 称为是 2,3BPG 的别构效应 别构效应的实质是降低了血红蛋白对氧的亲和性 使得血红蛋白在组织中氧分压低的情况下可以更有效的将氧转给组织细胞 2,3- 二磷酸 -D- 甘油酸 (2,3BPG) 也称为是红细胞内血红蛋白的别构效应剂 使血红蛋白的氧合曲线右移 (3) 玻尔 (Bohr) 效应 是指 CO 2 和质子降低了血红蛋白对氧的亲和力 组织中 CO 2 进入红细胞内部, 产生一个质子和碳酸氢根离子, 细胞内部 ph 降低 导致血红蛋白内部几个基团质子化 质子化的基团有助于稳定脱氧血红蛋白的构象 玻尔效应定义 : CO 2 浓度的增加以及相应的 H+ 浓度升高,pH 降低使得血红蛋白的对氧亲和力下 降, 称为玻尔效应, 也是一种别构效应 在代谢的组织中,CO 2 水平相对来说比较高,pH 较低,O 2 容易从氧合血红蛋白卸载 在肺部,CO 2 水平低, 氧很容易被血红蛋白占有, 同时释放出质子

37 蛋白质的一 二 三 四级结构 三种别构效应的综合作用使血红蛋白的氧合曲线呈 S 形, 结合释放氧的速度很快 高氧分压时易于结合氧, 低氧分压时易于释放氧, 输氧效率达到最高 一级结构分析的步骤 六 一级结构的分析 一 拆分出单个多肽链 二 多肽链的氨基酸组成分析 N 末端和 C 末端氨基酸确定 整条多肽链氨基酸组成分析 三 多肽链的氨基酸序列分析 切割成小肽段, 测序, 拼接 一 拆分出单个多肽链 1 确定蛋白质的纯度在 97% 以上, 知道其相对分子量 2 测定蛋白质中多肽链的数目 比较蛋白质的摩尔数和 N- 末端或 C- 末端残基的摩尔数 3 拆分蛋白质分子并将多肽链分离纯化 次级键 8M 尿素,6M 盐酸胍 二硫键 过甲酸氧化法 巯基化合物法 : 先用尿素, 盐酸胍处理使蛋白质变为松散的构象 再用过量的巯基乙醇还原二硫键 再用碘乙酸保护剂保护二硫键不被重新氧化

38 蛋白质测序举例 ( 胰岛素的 B 链序列测定 ) 二 每个多肽链氨基酸的组成分析 (1)N- 末端氨基酸测定 ( 游离的 ) DNFB N 末端的氨基酸生成 α-dnp 氨基酸, 其余肽链里的氨基酸变成游离的氨基酸 α-dnp 氨基酸可以抽提出来, 用 HPLC 分析 O 2 N 二硝基氟苯 (DNFB ) 法 (Sanger 法 ):2,4- 二硝基氟苯在碱性条件下, 能够与肽链 N- 端的游离氨基作用, 生成二硝基苯衍生物 (DNP) 在酸性条件下水解, 得到黄色 DNP- 氨基酸 该产物能够用乙醚抽提分离 不同的 DNP- 氨基酸可以用色谱法进行鉴定 R O F + H 2N CH C O 2 N R O HN CH C DNS-CI N 末端的氨基酸生成 DNS- 氨基酸, 灵敏度高, 无需提取 NO 2 NO 2 DNFB N- 端氨基酸 DNP 衍生物 H + R O O 2N HN CH C OH + 氨基酸 H 2O NO 2 DNP- 氨基酸 PITC N 末端的氨基酸生成 PTH- 氨基酸, 剩下完整的肽链 以上方法测得胰岛素 B 链中 N- 末端氨基酸为 Phe 先在弱碱性溶液中生成 PTC- 氨基酸 即苯氨基硫甲酰衍生物 然后在酸溶液中环化生成 PTH- 氨基酸 苯氨基硫甲酰衍生物 在多肽和蛋白质测序反应中 PTH- 氨基酸会从肽链中掉下来 经层析法分离鉴定 接下来的 N- 端氨基酸再参加下一轮反应 又称为 Edman 降解法 环化 酸性溶液

39 (2)C- 末端残基测定 还原法 C 末端的氨基酸可以 LiBH4( 硼氢化锂 ) 还原生成相应的氨基醇 Sanger 就是用这种方法确定胰岛素 C 末端氨基酸 羧肽酶法, 从羧基端逐个依次降解, 释放氨基酸 根据氨基酸释放量和反应时间的关系确定 C- 末端氨基酸序列 以上方法测定胰岛素 B 链中 c- 末端氨基酸为 Ala (3) 测定整个多肽链的氨基酸组成 首先要通过酸或碱水解破坏蛋白质的肽键 典型酸水解的条件是 : 真空条件下,110, 用 6M 盐酸水解 16 至 72 小时 然后水解的混合物 ( 水解液 ) 进行柱层析, 通过柱层析可以将水解液中的每一种氨基酸分离出来并进行定量, 这一过程称为氨基酸分析 其中 Trp 完全被破坏,Gln 水解成 Glu,Asn 水解为 Asp HPLC 分析氨基酸混合物的洗脱曲线 三 每个多肽链序列测定 1 多肽链的部分裂解 为什么要裂解? 降解法测序每次只能测定几十个氨基酸残基, 所以要测定较大蛋白质的氨基酸序列, 需要将其降解为一些肽段, 经 HPLC 分离出各个肽段, 然后再进行 Edman 降解测序 蛋白质降解常用的是一些水解酶 ( 如胰蛋白酶 ) 和化学试剂 ( 如溴化氰 ) 溴化氰 (BrCN) 可以特异与蛋白质中的蛋氨酸残基羧基侧裂解肽键 反应生成一个 C 末端为高丝氨酸内酯的肽和一个带有新的 N 末端残基的肽 胰蛋白酶 水解 Lys,Arg 后面的肽键 糜蛋白酶 又称胰凝乳蛋白酶 水解芳香族氨基酸后面的肽键

40 2 测定各小肽段的氨基酸序列 连续的 N- 末端氨基酸的测定 Edman 试剂 PITC 最常采用的方法 用此原理已制成蛋白质序列分析仪 : Sanger 试剂 DNFB DNS 3 片段肽段的拼接

41 4 二硫桥位置的确定 完成多肽链测序后, 确定二硫键位置 胃蛋白酶水解蛋白质分子成许多小肽 将这些小肽对角线电泳 a. 第一向电泳小肽点在滤纸中央, 在 ph=6.5 时电泳, 分离电荷和大小不同的肽段 b. 滤纸暴露在过甲酸的蒸汽中, 使二硫键断裂, 含二硫键的小肽氧化成一对磺基丙氨酸的肽 c. 滤纸旋转 90 度进行第二向电泳含磺基丙氨酸的肽段会偏离对角线, 用茚三酮确定 一级结构测定练习 d 取下含磺基丙氨酸的肽段, 进行氨基酸序列分析, 与多肽链的氨基酸序列比较, 推断出二硫键的位置 1 某个四肽测序得到以下结果, 求其一级结构可能的顺序 (1) 与 FDNB 反应后, 用 6mol/L 的 HCL 水解得到 DNP-Val 及其他氨基酸 (2) 用胰蛋白酶水解时形成 2 个肽段, 其中一个肽段用 LiBH4 还原后, 再进行水解, 水解液中发现有甘氨酸的氨基醇, 还有一种与茚三酮反应生成黄色产物的氨基酸

42 (2) 一个七肽经如下处理, 求其一级结构 (1) 经糜蛋白酶处理后断裂为两个肽段, 分别含有 Ala,Tyr,Ser 和 Pro,Phe, Lys,Arg, 这两个肽段分别与 DNFB 反应生成 DNP-Ser, DNP-Lys (2 此肽与胰蛋白酶反应, 也生成两个肽段, 分别为 Arg,Pro 和 Phe,Tyr, Ser, Ala (3) 此肽未经糜蛋白酶处理时与 FDNB 不生成 DNP 氨基酸 第三节蛋白质的理化性质和纯化分离 一 蛋白质颜色反应和紫外吸收 1 蛋白质的紫外吸收 一般蛋白质在 280nm 波长处都有最大的吸收率 这是由于蛋白质中有酪氨酸 色氨酸存在的缘故 通常利用这些特异性的吸收, 可以测定蛋白质的浓度 如果没有干扰物质存在的话, 可用来测定浓度为 0.1 一 0.5mg/ml 的蛋白质溶液 2 茚三酮反应 蓝紫色 蛋白质和氨基酸一样, 也能与水合茚三酮反应, 生成蓝紫色化合物 实践中常利用这一反应来检测蛋白质的存在 但不能区别蛋白质与氨基酸 也不能定性 3 双缩脲反应 : 红紫色 在碱性溶液中蛋白质能与硫酸铜反应产生红紫色络合物 在 540nm 处有最大吸收波长 蛋白质分子中含有许多和双缩脲结构相似的肽键 必须是两个或两个以上肽键 2

43 二 蛋白质的两性解离和电泳分离 1 蛋白质的两性和等电点 蛋白质分子既有带负电荷基团, 又有带正电荷基团的离子, 也是两性离子 如果在某一 ph 值下, 蛋白质所带正电荷的数目与负电荷的数目正好相等, 即净电荷为零, 则称该 ph 值为该蛋白质的等电点 (pi) 在等电点时, 蛋白质溶解度最低 在生理条件下 多数蛋白质为酸性蛋白质 pi 在 5 左右或以下 如胃蛋白酶 pi=1 少数为碱性 : 如鱼精蛋白 2 不同 ph 值下蛋白质带的电荷 3 蛋白质 SDS PAGE 电泳 pi-ph < 0 蛋白质带负电荷 在电场向正极移动 pi-ph > 0 蛋白质带正电荷 在电场向负极移动 (1) 电泳原理 : 利用带电粒子在电场中移动速度不同而达到分离的技术称为电泳技术 A 利用介质的分子筛效应 通常点样在各种凝胶上, 如琼脂糖, 聚丙烯酰胺 凝胶分子内部形成网状结构, 对不同大小的分子进行筛选 通常情况下, 大于网孔直径的分子泳动速度要慢于小分子

44 B 需要分离分子的电荷效应 在凝胶的两端加上电场, 调节电泳环境, 使需要分离的分子带有电荷 调节蛋白质电泳时的 ph 为碱性, 大多数蛋白质都带有负电荷, 这样它们可以向阳极迁移 (2) 影响分子电泳速度 ( 迁移速率 ) 的因素 分子量大小 分子荷质比 分子所带电荷与分子量大小的比值 分子的构象 电源电压 凝胶的浓度 (3) 对蛋白质样品的预处理 1 目的 : 使得 SDS-PAGE 电泳分离只是根据分子的相对分子质量大小不同 蛋白质分子的电荷多少的因素 不同的蛋白质所带有的电荷数目不同 因此要消除带有电荷数目不同 分子形状因素 蛋白质分子具有不同的空间构象 具有四级结构的蛋白质有多个亚基, 需要 将亚基分开变成多条多肽链 多肽链变成线状结构 2 预处理的步骤及目的 使蛋白质变性 巯基乙醇 : 还原剂打开二硫键 加热 : 一般煮沸 3~5 分钟 SDS 的作用 十二烷基硫酸钠 有一个疏水尾巴 A 使蛋白质变性并维持蛋白质的变性状态 经过加热和打开二硫键的蛋白质伸展为棒状 SDS 通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合, 使蛋白质变性并维持蛋白质的变性状态 B 使蛋白质的荷质比相同 结合 SDS 的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的 SDS, 大的蛋白质按比率可以结合更多的 SDS SDS 带有大量的负电荷, 好比蛋白质穿上带负电的 外衣, 蛋白质本身带有的电荷则被掩盖了 因此不同蛋白质结合 SDS 后荷质比相同 C 使蛋白质的形状相似 蛋白质 -SDS 复合物的形状近似于长的椭圆棒, 它们的短轴是恒定的, 而长轴与蛋 白质分子量的大小成比例

45 (4) 聚丙烯酰胺凝胶 三维空间的高聚物 A 丙烯酰胺 Acr 主要的交联单体 B 交联剂 甲叉双丙烯酰胺 Bis C 催化剂 过硫酸铵, 四甲基乙二胺 (TEMED) 作为加速剂或光催化聚合作用 (5) 电泳步骤 作胶 预处理样品 点样 电泳 它们通过凝胶的速率与它们分子量的对数成反比 染色 考马斯亮蓝染料出现不同的蛋白带 观测电泳结果 一定的凝胶浓度下, 蛋白质 ( 实际上是多肽 链 ) 的分子质量的对数与多肽链的迁移率成 线性关系 n 电泳相对迁移率等于蛋白质泳动的距离和原点到前沿距离的比值 = SDS- 蛋白质分子移动的距离 m R 原点到前沿的距离 三 利用蛋白质的胶体性质进行纯化分离 蛋白质是一种比较稳定的亲水胶体 蛋白质是生物大分子, 相对分子质量一般都在 万之间, 其颗粒大小属于胶体粒子的范围 水化层 : 颗粒外面形成一层水膜 蛋白质颗粒表面带有很多极性基团 使蛋白质溶于水, 又可以隔离蛋白 电荷层 : 在非等电点状态时带的相同电荷 使蛋白质颗粒间相互排斥, 不致相互凝聚

46 1 盐析分离蛋白质 是一种蛋白的可逆性沉淀, 不会使蛋白质变性 蛋白质胶体溶液的稳定性是有条件的 相对的 改变环境条件, 破坏其水化膜和表面电荷, 蛋白质亲水胶体失去稳定性, 发生絮结沉淀现象 在等电点作用下, 沉淀现象更明显 A 什么是盐析 加盐使蛋白质沉淀的方法叫做盐析沉淀 中性盐如 NaCl,(NH4) 2 SO4, 最常用的是 (NH4) 2 SO4 利用盐析的方法初步分离不同大小的蛋白质 B 原理 : 夺取蛋白质表面的水化膜, 增强蛋白质分子之间互相作用的机会, 促其聚集絮结成沉淀析出 亲 C 盐的选择 : 蛋白质的盐析通常采用中性盐 如硫酸铵 硫酸钠 硫酸镁 氯化钠 磷酸钠等 其中应用最广的是硫酸铵 硫酸铵在水中的溶解度大而受温度的影响小 25 时溶解度为 4.1mo l/l, 即 767g/L;0 时溶解度为 3.7mol/L, 即 697g/L 价廉易得 不易引起蛋白质变性 D 分级盐析 相对分子质量大的容易盐析, 相对分子质量越小, 所需盐浓度越高 不同蛋白质表面电荷量不同, 水化膜的厚度不一样, 盐析所需要的中性盐浓度也不一样 根据这种性质, 同一溶液中不同相对分子质量的蛋白质, 可通过逐步提高盐浓度的方法逐一沉淀分离出来, 这种方法称为分级盐析 E 与等电点结合 盐析与等电点结合沉淀效果更好 调节溶液 ph 值至等电点, 蛋白质带净电荷为零, 没有同种电荷的排斥 然后再加固体 (NH 4 ) 2 SO4 或其饱和溶液, 使达到一定浓度后, 蛋白质即可沉淀析出

47 2 有机溶剂沉淀 3 透析和超滤 : 水溶性有机溶剂如丙酮 乙醇 与水的亲和力大, 能以任何比例与水相溶 当向蛋白质水溶液中加入适量这类溶剂时, 它能夺取蛋白质颗粒表面的水化膜 注意 : 有机溶剂长时间作用于蛋白质会引起变性 (1) 低温操作 (2) 有机溶剂与蛋日质接触时间不能过长, 在沉淀完全的前提下, 时间越短越好 利用蛋白质相对分子量比较大, 去除小分子物质 (1) 透析法 : 利用蛋白质相对分子量比较大, 不宜透过半透膜 含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中 透析袋是是半通透的膜制成的, 蛋白质等大分子不能透过膜, 仍然留在袋内 小分子杂质被透析出, 大分子蛋白质留在 袋中, 以达到纯化蛋白质的目的 (2) 超滤技术 赛咯吩制造的透析袋 通过多次更换透析液, 就可除去小分子 ( 如硫酸铵 ) 超滤是一种加压膜过滤技术 利用具有选择透过性的微孔滤膜 在液压作用下迫使小分子水和无机盐等透过膜 大分子则被阻留在膜的内侧, 从而达到分离纯化的目的 4 葡聚糖凝胶过滤法 又称为凝胶层析, 凝胶过滤, 分子筛层析或排阻层析 单个凝胶珠本身象个筛子, 有三维网状结构, 只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部 大的蛋白质直接通过凝胶珠之间的缝隙首先被洗脱下来, 所需洗脱液体积小 小分子, 洗脱体积大, 花费的时间越长 在一定的条件下, 被分离的蛋白质的分子量的对数与其洗脱体积成比例, 所以常利用这一原理进行天然蛋白质分子量的测定

48 5 蛋白质不可逆沉淀的应用 (2) 生物碱试剂沉淀 ph <pi (1) 重金属盐沉淀 ( ph > pi ) 当溶液 ph 大于等电点时, 蛋白质颗粒带负电荷, 易与重金属离子 (Hg2+ Pb2+ Cu2+ Ag+ 等 ) 结合, 使蛋白质变性, 生成不溶性盐类, 沉淀析出 误服重金属盐的病人, 大量口服牛奶 豆浆或蛋清能够解毒 因为这些食物中的蛋白质与重金属离子形成不溶性盐, 经催吐剂呕吐排出体外 替代体内的活性蛋白与重金属离子结合 生物碱试剂是指苦味酸 鞣酸 磷钨酸 磷钼酸及三氯醋酸等 当溶液的 ph 低于等电点时, 蛋白质分子是阳离子形式存在 易与生物碱试剂作用, 生成不溶性盐沉淀, 并伴随发生蛋白质分子变性 在啤酒生产工艺中借酒花中的单宁类物质与蛋白质成盐沉淀, 使麦汁得以澄清, 防止成品啤酒混浊 (3) 热凝固沉淀 蛋白质受热变性 +ph 调至等电点 ( 或盐析 ) 其原因是 : 由于加热, 变性蛋白质的空间结构解体, 疏水基团外露 同时使用盐析影响蛋白质的水化层或由于等电点破坏了带电状态等 进而凝聚成凝胶状絮结沉淀 我国传统的做豆腐工艺 : 热凝固 先将豆浆煮沸 而后点入少量盐卤 ( 含 MgCl2) 或石膏 ( 含 CaSO4) 或者点入酸浆或葡萄糖酸内酯将 ph 调至等电点 热变性的大豆蛋白使很快絮结凝固, 经过滤成型则成豆腐 蛋白质的变性, 沉淀和凝固 彼此间有密切关系 蛋白质变性后不一定沉淀 沉淀的变性蛋白质也不一定凝固 如强酸强碱变性后蛋白质带有大量电荷, 故仍溶于强酸强碱中 但是如果调节到等电点附近, 则变性蛋白质凝集成絮状沉淀物 如果再加热, 则分子间相互盘绕而变成较为坚固的凝块