\376\377\000b\000b\000b\000b\000b\000b\000b
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- 晓 鱼
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1 发 酵 乳 杆 菌 菌 株 的 多 相 分 类 鉴 定 杨 振 宇, 高 学 军, 王 庭 柱 东 北 农 业 大 学 教 育 部 乳 品 科 学 重 点 实 验 室 (150030) 摘 要 : 对 9 株 发 酵 乳 杆 菌 菌 株 (2 株 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 1 株 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种 3 株 嗜 酸 乳 杆 菌 1 株 发 酵 乳 杆 菌 1 株 干 酪 乳 杆 菌 1 株 布 氏 乳 杆 菌 ) 进 行 MRS 固 体 平 板 培 养 基 划 线 分 离 和 形 态 学 比 较 观 察, 并 采 用 生 化 试 验 和 特 异 性 PCR 以 及 RAPD 对 其 进 行 鉴 定 通 过 菌 体 常 规 磷 钨 酸 负 染 色 标 本 的 透 射 电 镜 观 察, 描 述 了 各 菌 体 的 大 小 形 状 以 及 裂 殖 方 式 ; 依 据 各 菌 种 生 化 代 谢 差 异 及 其 代 谢 酶 编 码 基 因 序 列 差 异 分 别 设 计 生 化 试 验 和 菌 种 特 异 性 PCR 引 物, 生 化 试 验 得 到 了 6 个 发 酵 型, 将 其 鉴 定 为 6 个 菌 群, 而 特 异 性 PCR 扩 增 在 菌 株 水 平 上 将 其 鉴 定 为 9 株 菌 (2 株 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 1 株 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种 3 株 嗜 酸 乳 杆 菌 1 株 发 酵 乳 杆 菌 1 株 干 酪 乳 杆 菌 1 株 布 氏 乳 杆 菌 ), 这 得 到 了 RAPD 鉴 定 结 果 (20 个 随 机 引 物 的 RAPD 筛 选 也 得 到 了 9 个 不 同 的 基 因 型 ) 的 验 证 实 验 还 获 得 了 5 个 种 特 异 性 PCR 引 物 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 的 LbdbmanLF-R 干 酪 乳 杆 菌 的 LbcmanNF-R 嗜 酸 乳 杆 菌 的 LbarbsK1F-R 发 酵 乳 杆 菌 的 LbpmelAF-R 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种 的 LbddlacZF-R. 以 及 可 能 是 嗜 酸 乳 杆 菌 菌 株 AS 的 株 特 异 性 的 PCR 引 物 LbamanNF-R 关 键 词 : 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种, 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种, 嗜 酸 乳 杆 菌, 发 酵 乳 杆 菌, 干 酪 乳 杆 菌, 电 镜, 生 化 鉴 定,PCR 1. 引 言 乳 杆 菌 (Lactobacillus), 在 全 世 界 的 工 业 应 用 中 占 有 重 要 的 作 用, 可 作 为 发 酵 乳 的 发 酵 剂 有 一 些 乳 杆 菌 株 是 益 生 菌, 常 用 于 新 鲜 的 发 酵 产 品 或 囊 形 保 健 品 ( 如 冻 干 粉 ) 中, 在 人 和 动 物 胃 肠 道 以 及 许 多 食 品 饲 料 和 饮 料 的 制 作 过 程 中 起 主 要 作 用 [1,2] 德 氏 乳 杆 菌 (Lact. delbrueckii), 依 据 生 态 学 生 境 和 发 酵 性 能 的 差 异, 依 据 生 态 学 生 境 和 发 酵 性 能 的 差 异, 可 将 其 分 为 三 个 亚 种 : 常 用 于 蔬 菜 发 酵 的 德 氏 亚 种 (Lact. d. delbrueckii) 以 及 目 前 用 于 乳 品 的 保 加 利 亚 亚 种 (Lact. d. bulgaricus) 和 乳 酸 亚 种 (Lact. d. lactis), 后 两 者 与 其 它 微 生 物, 如 嗜 热 链 球 菌 (Streptococcus thermophilus) 和 嗜 酸 乳 杆 菌 [3,4] (Lact. acidophilus) 一 起 广 泛 地 应 用 于 Yogurt 发 酵 乳 以 及 乳 酪 的 制 造 工 业 中 干 酪 乳 杆 菌 ('Lactobacillus. casei') 群 含 有 许 多 重 要 的 益 生 菌 株, 如 Lact. casei Shirota 和 Lact. [5,6] rhamnosus GG, 它 们 可 见 于 初 乳 中, 特 别 是 在 成 熟 乳 酪 中 大 量 存 在 布 氏 乳 杆 菌 (Lact. buchneri) 是 在 酒 发 酵 过 程 中 的 害 菌 或 酸 败 菌, 此 外,Lact. buchneri 在 酵 母 发 酵 淀 粉 乳 酪 橄 榄 发 酵 和 青 贮 饲 料 中 也 常 见 近 年 来, 越 来 越 多 的 证 据 表 明, 食 品 工 业 和 胃 肠 微 生 物 学 者 需 要 灵 敏 可 靠 的 方 法, 来 确 定 和 分 析 食 品 中 及 宿 主 胃 肠 道 中 微 生 物 的 含 量, 尤 其 是 对 LAB( 特 别 是 乳 杆 菌 和 双 歧 杆 菌 ) 的 关 注, 这 主 要 是 因 为 :(i) 这 些 微 生 物 有 益 于 健 康 ;
2 (ii) 它 们 可 包 埋 于 许 多 食 品 中 作 为 益 生 菌 ; 以 及 (iii) 满 足 立 法 工 业 体 和 消 费 者 的 关 于 安 全 性 及 完 整 标 示 的 需 要 传 统 的 鉴 定 方 法 主 要 依 赖 于 表 型 分 析, 其 中 有 些 技 术 已 被 证 明 适 用 于 某 些 乳 酸 菌 的 鉴 定, 但 表 型 分 析 存 在 一 些 缺 点, 例 如 重 现 率 低 某 些 技 术 的 不 定 性 ( 主 要 是 由 细 菌 生 长 的 可 塑 性 引 起 的 ) 低 辨 识 能 力 以 及 相 似 的 表 型 特 性 并 不 等 同 于 相 似 的 或 者 关 系 密 切 的 基 因 型 [6] 近 年 来, 为 了 克 服 传 统 表 型 分 类 学 方 法 的 缺 陷, 已 经 建 立 了 一 系 列 的 干 酪 乳 杆 菌 和 发 酵 乳 杆 菌 分 子 鉴 定 方 法, 包 括 遗 传 探 针 技 术 和 遗 传 指 纹 技 术,PCR 技 术 的 创 立 打 开 了 乳 酸 菌 快 速 [7,8] [9] 鉴 定 的 大 门, 干 酪 乳 杆 菌 菌 种 特 异 性 引 物 和 发 酵 乳 杆 菌 菌 种 特 异 性 引 物 已 经 建 立, RAPD 技 术 已 经 广 泛 地 用 于 菌 株 水 平 的 鉴 别 [10~12], 此 外, 还 建 立 了 许 多 PCR 衍 生 的 鉴 定 技 术 ( 如 S-PCR rep-pcr AP-PCR LCR 和 小 卫 星 序 列 多 态 性 ) 以 及 基 于 16S rrna 基 因 和 16S~23S rrna 基 因 间 隔 区 的 PCR 及 其 RFLP, 即 ARDRA 技 术 [1,7,10,13] 本 试 验 即 是 进 行 表 型 特 性 及 其 分 子 水 平 的 研 究, 包 括 形 态 学 观 察 生 化 试 验 RAPD 和 特 异 性 PCR 通 过 透 射 电 镜 观 察 各 菌 体, 依 据 各 菌 种 之 间 生 化 代 谢 的 差 异, 设 计 生 化 试 验, 并 比 对 其 代 谢 酶 编 码 基 因 的 序 列, 尽 可 能 设 计 菌 种 水 平 的 较 短 的 PCR 引 物, 力 求 做 出 这 些 菌 种 不 同 菌 株 的 PCR 鉴 定, 另 外 也 筛 选 了 20 个 随 机 引 物, 进 行 菌 株 RAPD 分 析, 并 同 生 化 鉴 定 及 特 异 性 PCR 结 果 进 行 验 证, 为 乳 酸 菌 相 关 科 学 研 究 和 工 业 化 生 产 提 供 理 论 和 技 术 基 础 2. 材 料 和 方 法 2.1 菌 株 及 其 培 养 条 件 试 验 所 用 株 有 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 株 AS AS , 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种 株 AS (ATCC 9649), 嗜 酸 乳 杆 菌 株 AS AS (ATCC 4395) AS , 发 酵 乳 杆 菌 株 AS (ATCC 14931), 干 酪 乳 杆 菌 株 AS 1.29 以 及 布 氏 乳 杆 菌 AS 1.13 ( 对 照 ) 所 用 菌 株 是 由 东 北 农 业 大 学 食 品 学 院 于 国 萍 和 孟 祥 晨 教 授 惠 赠 菌 株 的 纯 培 养 通 过 在 无 抑 制 作 用 的 MRS 平 板 培 养 基 上 反 复 划 线 获 得 ; 增 殖 培 养 在 液 体 MRS 培 养 基 中 过 夜 生 长 进 行 2.2 菌 株 的 电 镜 观 察 菌 株 增 殖 培 养 后, 进 行 常 规 磷 钨 酸 负 染 色 透 射 电 镜 标 本 的 制 作 [14], 置 JEM-1200EX 型 电 镜 下 观 察 并 照 相 2.3 生 化 实 验 据 文 献 [15~17], 选 取 苦 杏 仁 苷 阿 拉 伯 糖 山 梨 醇 乳 糖 核 糖 蔗 糖 和 甘 露 糖 代 谢 为 切 入 点, 设 计 生 化 试 验 [17], 各 反 应 体 系 均 为 3 ml; 而 苦 杏 仁 苷 和 阿 拉 伯 糖 发 酵 试 验 采 用 细 菌 微 量 生 化 鉴 定 管 ( 购 自 北 京 陆 桥 技 术 有 限 责 任 公 司 ) 各 菌 株 生 化 试 验 均 各 做 10 个 平 行 - 2 -
![酵 乳 杆 菌 分 子 鉴 定 方 法, 包 括 遗 传 探 针 技 术 和 遗 传 指 纹 技 术,PCR 技 术 的 创 立 打 开 了 乳 酸 菌 快 速 [7,8] [9] 鉴 定 的 大 门, 干 酪 乳 杆 菌 菌 种 特 异 性 引 物 和 发 酵 乳 杆 菌 菌 种 特 异 性 引 物 已 经 建 立, RAPD 技 术 已 经 广 泛 地 用 于 菌 株 水 平 的 鉴 别](/docs-images/42/22857174/images/page_2.jpg "[10~12], 此 外, 还 建 立 了 许 多 PCR 衍 生 的 鉴 定 技 术 ( 如 S-PCR rep-pcr AP-PCR LCR 和 小 卫 星 序 列 多 态 性 ) 以 及 基 于 16S rrna 基 因 和 16S~23S rrna 基 因 间 隔 区 的 PCR 及 其 RFLP, 即 ARDRA 技 术 [1,7,10,13] 本 试 验 即 是 进 行 表 型 特")
3 2.4 模 板 DNA 的 制 备 采 用 CTAB 法 制 备 菌 株 DNA 样 品 [18], 紫 外 (DU640 型 分 光 光 度 计,BECKMAN) 测 定 OD 260 和 OD 280 选 取 纯 度 介 于 1.8 和 2.0 之 间 的 样 品, 稀 释 至 浓 度 48 ng/µl 作 为 模 板 备 用 2.5 RAPD 随 机 引 物 : 选 取 20 种 RAPD 随 机 引 物 [18], 引 物 合 成 于 上 海 英 骏 生 物 技 术 有 限 公 司 随 机 引 物 的 PCR 筛 选 : 扩 增 反 应 的 体 积 为 25µl, 其 中 含 Taq DNA 聚 合 酶 1.25 U,10 PCR reaction buffer 2.5µl, 模 板 DNA 1µl,dNTP 浓 度 为 200 µmol/l,mgcl 2 浓 度 为 1.5 mmol/l, 随 机 引 物 浓 度 为 800 µmol/l, 补 充 去 离 子 水 至 25 µl 扩 增 反 应 执 行 于 96 孔 梯 度 PCR 仪 (Biometra) 中, 程 序 为 [20] 改 进 靳 淼 等 的 方 法, 即 复 性 温 度 为 34 取 10 µl 扩 增 产 物 进 行 电 泳, 电 压 为 100V, 琼 脂 糖 凝 胶 为 1%( 含 EB 0.5µg/l), 用 GDS-8000 凝 胶 成 像 系 统 (UVP) 观 察 电 泳 结 果, 筛 选 出 合 适 的 引 物 后, 以 提 取 的 各 菌 株 DNA 为 模 板, 分 别 进 行 PCR 扩 增 和 凝 胶 电 泳, 并 拍 照 PCR 相 关 试 剂 均 购 自 天 根 生 化 科 技 ( 北 京 ) 有 限 公 司 2.6 特 异 性 PCR 引 物 设 计 : 选 取 甘 露 糖 乳 糖 核 糖 代 谢 为 切 入 点, 查 找 其 代 谢 关 键 酶 ( 编 码 基 因 ) [20], 分 别 为 甘 露 糖 磷 酸 转 移 酶 IIAB(manL) 甘 露 糖 磷 酸 转 移 酶 IID (mann) β- 半 乳 糖 苷 酶 (lacz) α- 半 乳 糖 苷 酶 (mela) 核 糖 激 酶 (rbsk), 应 用 DNAman 软 件 比 对 相 应 核 苷 酸 序 列,Oligo6.0 设 计 菌 种 特 异 性 PCR 引 物, 详 见 表 1, 合 成 于 上 海 英 骏 生 物 技 术 有 限 公 司 表 1 所 设 计 引 物 的 信 息 引 物 名 称 序 列 (5 ~3 ) 靶 基 因 扩 增 子 大 小 退 火 温 度 LbdbmanLF TGGGCGACGGTCACATTAAGAT manl 263(bp) 57.1 LbdbmanLR AAACAACAAGAAGGCGTGCGTAG LbcmanNF GCTGGGAGCAAGATTACCGAAGA mann 417(bp) 56.9 LbcmanNR CATCAAGCCGACAACGTGGAAGACA LbamanNF ATGGCGTTGA mann 685(bp) 41.6 LbamanNR ACGGGTAACCT LbarbsK1F AGTGAAGGCGGCTATATTACTC rbsk 685(bp) 51.1 LbarbsK1R ATGGTTGGGCACCTAAAC LbbdrbsK2F AGGCGGCTATA rbsk 287(bp) 44.7 LbdbrbsK2R TGGGCACCTAA LbpmelAF ACCAACTCTACGAACGCCTAA mela 416(bp) 58.1 LbpmelAR CGGTGTCTGGACTGTCAATC LbddlacZF CAATGAATACTACCCGAACCA lacz 480(bp) 54.2 LbddlacZR TTAGCGGAAGCAACGAAT 特 异 性 PCR 扩 增 :PCR 反 应 体 系 为 25 µl, 其 中 含 TaqDNA 聚 合 酶 2.5 U,10 PCR reaction buffer 2.5 µl, 模 板 DNA 1 µl,dntp 浓 度 为 200 µmol/l,mgcl 2 浓 度 为 1.5 mmol/l, 每 对 引 物 浓 度 为 400 µmol/l, 补 充 去 离 子 水 至 25 µl 扩 增 程 序 如 下 :94 预 变 性 3 min,94 变 性 30 s, 退 火 温 度 复 性 30 min,72 延 伸 30 min, 进 行 30 个 循 环 后 72 延 伸 7 min 取 9 µl - 3 -
4 扩增产物进行电泳 电压为 100 Ｖ 琼脂糖凝胶为 1% 含 EB 0.5 µg/l 用凝胶成像系统 观察电泳结果并拍照 3. 结果 3.1 菌株的分离纯化 菌株经过反复平板划线基本得到纯化 无论是从菌落形态还是镜检观察均为均一的形 态 共得到 9 株乳酸菌 即 AS AS AS AS AS AS AS AS 1.29 AS 菌株的菌落特征描述 菌株的菌落特征描述 9 株菌菌落均粗糙 无色素 其中 AS AS AS AS AS AS AS 1.29 菌落为白色到浅灰色 直径 1-3mm AS 1.29 倾倒平板培养 基的深层菌落光滑 透镜成菱形 AS AS AS 菌落在显微镜下 一 般显示缠绕或微毛状物 从似暗影的菌堆中心放射伸出 深层菌落呈放射或分枝形的不规则 AS AS 1.13 菌落为近乎透明 菌落通常扁平 圆形或不规则 菌株的光镜观察 菌株的光镜观察 9 株菌均为 G 性菌 菌体细胞为杆状 大多数单个或成对或者短链 但 AS 1.29 大多数 成链 少见成对 大多两端呈圆形 而 AS 1.29 菌体细胞两端呈方形 菌株的电镜观察 菌株的电镜观察 11 株菌中 在裂殖方式上均为二等分裂殖 其中 AS AS 为长杆状 其 它菌体细胞呈短杆状 AS 1.29 两端呈方形 电镜照片 40K 见图 1 AS AS AS AS 1.13 AS AS AS AS AS 1.29 图 1 菌株的电镜照片 40K 3.2 生化实验 9 株菌的生化鉴定 苦杏仁苷的发酵实验 AS AS AS AS 1.29 为阳性 甘露醇 AS 1.29 为阳性 阿拉伯糖 AS AS 1.13 为阳性 半乳糖 AS
5 AS AS AS AS AS 为 阳 性 ; 核 糖 AS 1.29 AS 1.13 AS 为 阳 性 ; 甘 露 糖 AS AS AS AS AS AS 1.29 为 阳 性 判 定 的 结 果 是, 尽 管 AS 在 阿 拉 伯 糖 发 酵 结 果 不 符 外, 其 余 都 与 各 自 菌 种 在 文 献 中 所 描 述 的 相 对 应 3.3 菌 株 的 RAPD 分 型 筛 选 20 个 随 机 引 物, 发 现 引 物 BA63(GGGGGTCTTT) 可 得 到 最 好 的 多 态 性, 并 可 对 各 菌 株 做 出 最 大 限 度 的 鉴 别, 见 图 2, 所 以 引 物 BA63 的 RAPD 将 这 些 菌 株 鉴 别 为 9 株 图 2 随 机 引 物 BA63 的 RAPD 图 谱 泳 道 M 为 DNA MarkerⅤ, 泳 道 1~9 分 别 为 AS AS AS AS AS AS AS 1.29 AS AS 特 异 性 PCR 鉴 定 基 于 rbsk 的 特 异 性 PCR 鉴 定 : 基 于 rbsk 设 计 了 2 个 引 物, 分 别 是 LbarbsK1F-R 和 LbbdrbsK2F-R, 前 者 是 嗜 酸 乳 杆 菌 种 特 异 性 的, PCR 扩 增 只 有 菌 株 AS AS AS 获 得 了 685bp 的 特 异 性 的 唯 一 条 带, 其 余 菌 株 均 无 带, 见 图 3; 后 者 是 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 菌 株 特 异 性 的, 只 有 AS AS 有 287bp 的 特 异 性 条 带, 且 AS AS 均 有 一 条 >100bp 的 非 特 异 性 条 带,AS 有 三 条 带, 多 出 的 一 条 是 >300bp 大 小 的 片 段, 见 图 4 图 3 引 物 对 LbarbsK1F-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 泳 道 M( 左 ) 为 DNA Marker II,M( 右 ) 为 DNA MarkerⅠ, 泳 道 1~9 同 图 2, 泳 道 10 为 空 白 对 照 图 4 引 物 对 LclrbsKF-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 泳 道 M 为 100 bp DNA Ladder, 泳 道 1~10 同 图 基 于 lacz 的 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种 特 异 性 PCR 鉴 定 : 基 于 lacz 设 计 了 的 引 物 LbddlacZF-R, 只 有 AS 获 得 了 480bp 的 特 异 性 的 唯 一 条 带, 其 余 菌 株 均 无 带, 见 图 5-5 -
6 图 5 引 物 对 LbddlacZF-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 泳 道 M 为 为 DNA Marker II, 泳 道 1~10 同 图 基 于 manl 的 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 特 异 性 PCR 鉴 定 : 基 于 manl 设 计 的 引 物 LbdbmanLF-R, 只 有 菌 株 AS AS 获 得 了 263bp 的 特 异 性 的 唯 一 条 带, 其 余 菌 株 均 无 带, 见 图 6 图 6 引 物 对 LbdbmanLF-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 泳 道 M 为 为 DNA Marker II, 泳 道 1~10 同 图 基 于 mann 的 特 异 性 PCR 鉴 定 : 基 于 mann 设 计 了 2 个 引 物 对, 分 别 是 LbcmanNF-R 和 LbamanNF-R, 前 者 是 干 酪 乳 杆 菌 种 特 异 性 的,PCR 扩 增 仅 有 AS 1.29 得 到 了 417bp 的 特 异 性 唯 一 条 带, 其 余 均 无 带, 见 图 7; 后 者 是 嗜 酸 乳 杆 菌 菌 株 特 异 性 的, 扩 增 后 有 的 菌 株 呈 现 一 定 的 多 态 性, 共 鉴 定 出 了 3 个 基 因 型, 只 有 AS AS AS 有 675bp 的 特 异 性 条 带, 且 只 有 AS 是 唯 一 条 带, 另 外 2 株 还 有 与 形 成 唯 一 条 带 的 AS 一 样 大 小 的 扩 增 子 (>600bp),AS 和 AS 比 AS 多 一 条 带 (<500bp), 而 AS 有 三 条 带, 多 出 的 一 条 是 >900bp 大 小 的 片 段, 见 图 8 图 7 引 物 对 LbcmanNF-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 泳 道 M 为 DNA MarkerⅠ, 泳 道 1~10 同 图 3 图 8 引 物 对 LbamaNF-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 泳 道 M( 左 ) 为 DNA MarkerⅠ, 泳 道 M( 右 ) 为 DNA Marker II, 泳 道 1~10 同 图 基 于 mela 的 发 酵 乳 杆 菌 特 异 性 PCR 鉴 定 : 依 据 mela 基 因 设 计 的 引 物 LbpmelAF-R, 只 有 菌 株 AS 获 得 了 416bp 的 特 异 性 的 唯 一 条 带, 其 余 菌 株 均 无 带, 见 图 9 图 9 引 物 对 LbpmelAF-R 的 特 异 性 PCR 图 谱 - 6 -
7 4. 讨 论 泳 道 M 为 DNA MarkerⅠ, 泳 道 1~10 同 图 9 生 化 试 验 将 这 9 株 菌 鉴 定 为 6 个 发 酵 型, 即 6 个 菌 群, 每 一 群 与 其 在 文 献 中 描 述 的 发 酵 型 一 致, 可 以 做 出 亚 种 水 平 的 鉴 定, 但 是 AS 除 外, 虽 然 在 阿 拉 伯 糖 的 发 酵 上 与 文 献 描 述 (90% 以 上 的 菌 株 阴 性 ) 的 不 相 一 致, 但 是 进 一 步 的 特 异 性 PCR 和 RAPD 还 是 将 其 鉴 定 为 嗜 酸 乳 杆 菌 本 研 究 也 说 明 生 化 试 验 在 种 水 平 的 鉴 定 上 尚 有 一 定 的 指 导 意 义 在 RAPD 检 测 中, 随 机 引 物 BA63 得 到 了 最 好 的 多 态 性, 最 大 限 度 的 将 9 个 菌 株 鉴 别 为 9 株 菌, 可 见 RAPD 作 为 一 项 简 单 快 速 的 指 纹 技 术, 对 菌 株 水 平 的 鉴 别 与 鉴 定 依 然 有 很 大 的 优 势 在 特 异 性 PCR 鉴 定 中, 综 合 这 7 个 图 谱 的 结 果, 可 以 得 出 结 论, 即 可 对 9 个 菌 株 进 行 菌 株 水 平 的 鉴 定, 此 外, 本 试 验 还 发 现 了 5 个 菌 种 特 异 性 PCR 引 物, 即 嗜 酸 乳 杆 菌 的 LbarbsK1F-R, 德 氏 乳 杆 菌 德 氏 亚 种 的 LbddlacZF-R, 德 氏 乳 杆 菌 保 加 利 亚 亚 种 的 LbdbmanLF-R, 干 酪 乳 杆 菌 的 LbcmanNF-R, 以 及 发 酵 乳 杆 菌 的 LbpmelAF-R; 另 外, 引 物 LbamanNF-R 可 能 是 菌 株 AS 的 株 特 异 性 PCR 引 物, 其 变 异 后 mann 可 能 有 核 苷 酸 的 丢 失 并 以 1 株 布 氏 乳 杆 菌 (Lactobacillus buchneri) 作 为 对 照, 以 达 到 更 加 可 靠 的 分 类 和 鉴 别 综 上 所 述, 本 试 验 中 对 菌 株 进 行 表 型 特 性 及 其 分 子 水 平 的 鉴 定 研 究, 得 到 了 菌 株 水 平 的 鉴 定 结 果, 表 明 只 有 多 相 鉴 定 才 能 够 做 出 乳 杆 菌 菌 株 水 平 上 的 准 确 分 类 经 证 实, 所 设 计 的 特 异 性 PCR 引 物 是 有 效 的, 这 种 基 于 表 型 特 性 差 异 的 分 子 水 平 鉴 定 方 法 是 可 靠 的 本 试 验 选 取 了 5 个 代 谢 酶 基 因 为 靶 标, 而 且 有 的 引 物 也 很 长 ( 远 大 于 10-mer), 没 有 得 到 较 大 的 多 态 性, 已 将 9 株 菌 鉴 定 到 了 菌 株 的 水 平 如 果 选 择 足 够 多 的 代 谢 酶 为 靶 标, 据 此 设 计 足 够 多 的 PCR 引 物, 并 尽 可 能 降 低 引 物 的 长 度, 更 可 能 将 更 多 的 细 菌 鉴 定 到 菌 株 的 水 平, 这 对 其 他 乳 酸 菌 乃 至 其 他 微 生 物 的 分 类 鉴 定 也 有 一 定 的 借 鉴 意 义 5. 结 论 本 实 验 通 过 对 9 株 发 酵 乳 杆 菌 菌 株 进 行 多 相 分 类 鉴 定 得 出 如 下 结 论 : 证 实 了 形 态 学 观 察 在 细 菌 鉴 定 中 的 指 示 价 值 ; 证 实 了 生 化 试 验 在 种 水 平 鉴 定 上 的 指 导 意 义 验 证 了 RAPD 对 菌 株 水 平 的 鉴 别 与 鉴 定 的 巨 大 优 势 ; 在 特 异 性 PCR 鉴 定 中, 验 证 了 对 菌 株 进 行 表 型 特 性 的 分 子 水 平 的 研 究, 得 到 了 菌 株 水 平 的 鉴 定 结 果, 表 明 只 有 多 相 鉴 定 才 能 够 做 出 乳 杆 菌 菌 种 在 菌 株 水 平 上 的 准 确 分 类 此 外, 获 得 了 5 个 种 特 异 性 PCR 引 物 LbdbmanLF-R LbcmanNF-R LbarbsK1F-R LbpmelAF-R LbddlacZF-R, 以 及 可 能 是 嗜 酸 乳 杆 菌 菌 株 AS 的 株 特 异 性 的 PCR 引 物 LbamanNF-R 参 考 文 献 [1] G. Giraffa, P. De Vecchi and L. Rossetti. Note: Identification of Lactobacillus delbrueckii subspecies bulgaricus and subspecies lactis dairy isolates by amplified rdna restriction analysis[j]journal Appl Microbiol Nov;85 [2] SOILE TYNKKYNEN, REETTA SATOKARI, MARIA SAARELA. et al. Comparison of Ribotyping, - 7 -
8 Randomly Amplified Polymorphic DNA Analysis, and Pulsed-Field Gel Electrophoresis in Typing of Lactobacillus rhamnosus and L. casei Strains[J]APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 1999, Sept, 65(9), [3] T. Guarneri, L. Rossetti and G. Giraffa. Rapid identification of Lactobacillus brevis using the polymerase chain reaction[j]letters in Applied Microbiology 2001, 33: [4] SANDRA TORRIANI, GIACOMO ZAPPAROLI, AND FRANCO DELLAGLIO1. Use of PCR-Based Methods for Rapid Differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. Lactis[J] APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 1999, 65 (10): [5] L.J.H. Ward and M.J. Timmins. Giraffa. Differentiation of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei and Lactobacillus rhamnosus by polymerase chain reaction[j]letters in Applied Microbiology. 1999, 29: [6] Collins, M.D., Phillips, B.A., and Zanoni, P. Deoxyribonucleic acid homology studies of Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei sp. nov., subsp. paracasei and subsp. tolerans, and Lactobacillus rhamnosus sp. nov., comb. nov[j]int. J. Syst. Bacteriol. 1989, 39: [7] Ulrich RL, Hughes TA. A rapid procedure for isolating chromosomal DNA from Lactobacillus species and other Gram-positive bacteria[j]lett Appl Microbiol, 2001, 32(1): [8] L.Cocolin, M. Manzano, C. Cantoni. et al. Development of a rapid method for the identification of Lactobacillus spp. isolated from naturally fermented Italian sausages using a polymerase chain reaction temperature gradient gel electrophoresis[j]letters in Applied Microbiology. 2000, 30: [9] Muller MR, Ehrmann MA, Vogel RF. Multiplex PCR for the Detection of Lactobacillus pontis and Two Related Species in a Sourdough Fermentation[J] Appl Environ Microbiol May;66(5): [10] Prodelalova J, Spanova A, Rittich B. Application of PCR, rep-pcr and RAPD techniques for typing of Lactococcus lactis strains. Folia Microbiol (Praha), 50: 150-4, Feb, [11] Rossetti L, Giraffa G. Rapid identification of dairy lactic acid bacteria by M13-generated, RAPD-PCR fingerprint databases. J Microbiol Methods, 63: , Feb, [12] Samarzija D, Sikora S, Redzepovic S. Application of RAPD analysis for identification of Lactococcus lactis subsp. cremoris strains isolated from artisanal cultures. Microbiol Res, 157: 13-7, Jan, [13] Quenee P, Lepage E, Kim WS. Minisatellite polymorphism as a tool to distinguish closely related Lactococcus lactis strains. FEMS Microbiol Lett, 248: 101-9, Jan, [14] 袁 肖 寒, 高 学 军, 李 霞. 浓 缩 嗜 热 链 球 菌 的 超 微 结 构 研 究. 乳 业 科 学 与 技 术,110:16-18, [15] Holt J, Krieg N, Sneath P. Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Ninth Edition [16] 东 秀 珠, 蔡 妙 英. 常 见 细 菌 系 统 鉴 定 手 册, 北 京 : 科 学 出 版 社,2001. [17] 凌 代 文, 东 秀 珠. 乳 酸 细 菌 分 类 鉴 定 及 实 验 方 法, 北 京 : 中 国 轻 工 业 出 版 社,1999. [18] 丛 玉 婷, 高 学 军, 刘 衍 芬 等. EZAL-MY96 乳 酸 菌 种 菌 株 分 离 鉴 定. 生 物 技 术,14:38-40, [19] 靳 淼, 高 学 军, 雷 蕾. 引 进 直 投 型 酸 奶 发 酵 剂 乳 杆 菌 的 分 离 鉴 定. 中 国 乳 品 工 业,31:14-6, [20] 和 Polyphasic taxonomy methods for identification of bacillus strains from fermented milk YANG Zhen-yu, GAO Xue-jun, WANG Ting-zhu (The Key Laboratory of Dairy Science of Ministry of Education, Northeast Agricultural U niversity, Harbin , China) Abstract In this paper, the isolation and identification of 9 bacillus strains(2 Lb. delbrueckii subsp. Bulgaricu strains, 1 Lb. delbrueckii subsp. Delbrueckii strain, 3 Lb. acidophilus strains, 1 Lb. fermentum strain, 1 Lb. casei strain, 1 Lb. buchneri strains) were studied. The lactic acid bacteria were isolated by MRS plate streaking cultivation and morphological observation (light and electron microscope examination), and were identified by biochemical essay, specific PCR and RAPD technique. The result of plate streaking cultivation was 9 strains; The size, shape and schizogenesis styles of every strain which was negatively stained by PTA were obtained by TEM observation; The biochemical essay and the specific PCR primers were designed based on the differences of each strains at the level of species and between their genes coding these biochemistry metabolic enzymes respectively, and the result of biochemical identification had 6 distinct fermentation types which classified these strains as 6 microbial population. the PCR amplifications classified these strains as 9-8 -
![Rapid identification of Lactobacillus brevis using the polymerase chain reaction[j]letters in Applied Microbiology 2001, 33: 377-381. [4] SANDRA TORRIANI, GIACOMO ZAPPAROLI, AND FRANCO DELLAGLIO1.](/docs-images/42/22857174/images/page_8.jpg "Use of PCR-Based Methods for Rapid Differentiation of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus and L. delbrueckii subsp. Lactis[J] APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, 1999, 65 (10): 4351 4356.")
9 strains, which was consistent with the RAPD result, one of which 20 random primers obtained 9 distinct genotypes too, the 9 stains were 2 Lb. delbrueckii subsp. Bulgaricu strains, 1 Lb. delbrueckii subsp. Delbrueckii strain, 3 Lb. acidophilus strains, 1 Lb. fermentum strain, 1 Lb. casei strain, 1 Lb. buchneri strains. 5 species-specific PCR primers were acquired, They were LbdbmanLF-R of Lb.delbrueckii subsp. Bulgaricu strains LbcmanNF-R of Lb. casei strain LbarbsK1F-R of Lb. acidophilus strains LbpmelAF-R of Lb. fermentum strain LbddlacZF-R of Lb.delbrueckii subsp.delbrueckii strain.and even one strain-specific primers of Lb. acidophilus AS which was LbamanNF-R was gained. Key words: Lb. delbrueckii subsp, Lb. acidophilus, Lb. fermentum, Lb. casei,electron microscope, Biochemical identification, PCR 作 者 简 介 : 杨 振 宇 (1982-), 男 ( 汉 族 ), 山 东 招 远 人, 硕 士, 主 要 从 事 乳 酸 菌 的 生 化 与 分 子 生 物 学 研 究 - 9 -
研 發 與 創 新 驗 顯 示, 停 止 攝 食 乳 酸 菌 後, 在 幾 週 內 乳 酸 菌 便 會 消 失, 並 不 會 持 續 存 在 於 腸 道 內, 但 是 短 暫 的 定 殖, 還 是 有 刺 激 腸 道 免 疫 系 統 的 效 果, 尤 其 是 對 服 用 抗 生 素 或 腹 瀉 感
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Probiotics Prebiotics prebiotics synbiotics B.. () ()ph (). K 4. Obradovic 996 7 005 9 00 ml.5 mmol/l 0 L. para. subsp. paracasei NTU 0 6.4. 4. A - 88 8 7 4 7 4 68 4 4 9 7 0 4 9 synbiotic (prebiotic) (
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理 類 CN9626 行 96 年 1 1 96 年 12 31 參 行 97 年 2 28 1 行 離 Lactic acid bacteria 金 Staphylococcus aureus 行 離 159 API 50 CHL 行 離 159 不 度 了 行 H 2 O 2 1 Lactobacillus plantarum 了 識 益 益 來 不 利 來 益 切 了 流 Joerger 2003
268 植 物 來 源 乳 酸 菌 移 除 膽 固 醇 能 力 之 探 討 ( 一 ) 醇 濃 度 之 能 力,Lee et al. (2005) 之 研 究 也 指 出, 從 乳 製 品 分 離 出 Lactococcus 屬 乳 酸 菌 (LACC-N7 及 LACC-527) 在 防 止 高
畜 產 研 究 41(4):267~274, 2008 黃 建 榕 王 妙 鈴 郭 卿 雲 267 植 物 來 源 乳 酸 菌 移 除 膽 固 醇 能 力 之 探 討 ( 一 ) (1) (2) 黃 建 榕 (2) 王 妙 鈴 (2)(3) 郭 卿 雲 收 件 日 期 :96 年 12 月 3 日 ; 接 受 日 期 :97 年 4 月 18 日 摘 要 從 植 物 性 發 酵 產 品 如 發 酵
AFLP % 1. 1 DNA 5 RAPD DNA 0. 1g % ~ ph 6 10 DNA 9 40μl TE SSR STS 20ng /L
2012 13 2 201-206 Journal of Plant Genetic Resources / 071001 41 SSR 21 SSR 41 52 2 ~ 4 2. 5 Shannon 0. 21 ~ 1. 40 0. 73 5. 54 3 7 9 13. 16% ~ 186. 49% 5. 48 6 11 SSR Genetic Diversity of Peanut Arachis
9期
中 国 农 学 通 报 04,0(9):0-4 Chinese Agricultural Science Bulletin 柚 子 红 枣 酸 奶 的 发 酵 工 艺 研 究 邵 金 华, 余 响 华, 晏 资 忠, 朱 智 勇 ( 湖 南 科 技 学 院, 湖 南 永 州 499) 摘 要 : 以 柚 子 汁 红 枣 汁 和 脱 脂 奶 粉 为 主 要 原 料, 以 保 加 利 亚 乳 杆 菌 和
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食 品 標 識 (Food Labeling) 的 價 值 從 消 費 者 願 付 價 格 與 行 為 調 查 剖 析 孫 智 麗 從 一 連 串 的 黑 心 食 品 新 聞, 到 市 面 上 宣 稱 神 奇 療 效 另 人 目 不 暇 給 的 各 種 保 健 食 品, 台 灣 的 消 費 者 是 如 何 選 購 食 品? 而 政 府 為 維 護 消 費 者 食 品 安 全 的 權 益, 包 括 建
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PCR 龙平, 崔占虎, 李虔全, 徐建平, 张春红, 周立社 * *, 李旻辉 ( 包头医学院, 内蒙古包头 014060) DNA 30 28 DNA trnl-trnf PCR PCR 136 bp 323 bp 10% PCR PCR Astragalus membranaceus Fisch. Bge. var. mongho- licus Bge. Hsiao A. membranaceus
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美 食 預 購 誌 ( 水 果 節 ) 商 品 名 稱 食 品 業 者 登 錄 字 號 供 應 商 名 稱 國 內 製 造 商 國 內 製 造 商 電 話 國 內 製 造 商 地 址 原 產 地 ( 國 ) 成 份 產 品 責 任 險 ( 宅 ) 吉 利 市 光 波 水 梨 ( 免 稅 ) A-189627033-00000-6 二 十 一 世 紀 生 活 事 業 股 份 有 限 公 司 台 中 市
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16 3 2011 6 Vol 16 No 3 JOURNAL OF HARBIN UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Jun 2011 1 2 3 1 150040 2 150040 3 450052 1 3 4 > 1 ~ 3 > > U414 A 1007-2683 2011 03-0121- 06 Shrinkage Characteristics of
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21 11 2011 11 COMPUTER TECHNOLOGY AND DEVELOPMENT Vol. 21 No. 11 Nov. 2011 510006 PEN3 5 PCA + PCA+LDA 5 5 100% TP301 A 1673-629X 2011 11-0177-05 Application of Electronic Nose in Discrimination of Different
可 用 于 保 健 食 品 的 物 品 名 单 人 参 人 参 叶 人 参 果 三 七 土 茯 苓 大 蓟 女 贞 子 山 茱 萸 川 牛 膝 川 贝 母 川 芎 马 鹿 胎 马 鹿 茸 马 鹿 骨 丹 参 五 加 皮 五 味 子 升 麻 天 门 冬 天 麻 太 子 参 巴 戟 天 木 香 木 贼
药 食 同 源 食 品 和 新 食 品 原 料 名 单 汇 总 表 公 告 明 确 为 普 通 食 品 凉 茶 原 料 公 告 明 确 不 是 普 通 食 品 可 用 于 食 品 的 菌 种 名 单 新 食 品 原 料 名 单 既 是 食 品 又 是 药 品 的 物 品 名 单 整 理 :ALBERT 更 新 日 期 :2014.09.13 黄 明 胶 海 藻 糖 五 指 毛 桃 中 链 甘 油 三
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5 4 Vol. 5 No. 4 2014 4 Journal of Food Safety and Quality Apr., 2014 1, 李梓铭 2 1,, 谢靓 2 2,, 蒋立文 3*, 李云倩 (1., 410128; 2., 410128; 3., 410128) 1 摘要 : 目的 MRS, 方法 18% NaCl, PCR 16S rdna, 结果,, 结论 16S rdna 关键词
許可證字號：衛署健食字第A00030號
北 路 樓 料 蘿 糖 卵 酪 蘭 兩 狀 兩 狀 葉 利 利 蘭 不 狀 不 狀 不 利 糖 量 例 利 利 蘭 狀 酪 異 類 若 六 行 行 異 利 利 參 狀 量 量 28 26 量 100 44 96 4.5 9.8 0 0.2 0 3.8 0 0.2 6.2 14 A D 3 E B 1 B 2 B 6 葉 B 12 54 119 255 560 188 414 13 28 216 476
Microsoft Word _排版 二校 出4581
7 11 Vol. 7 No. 11 2016 11 Journal of Food Safety and Quality Nov., 2016 张蕴哲, 张先舟, 李英军, 马晓燕 *, 张伟 (, 071001) 摘要 : 目的 (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) 方法 16S rrna, LAMP,, 结果, 5.5 h, 62 CFU/mL,
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% 8. 48% 3 80 Alcalase Novozymes Alcalase 2. 4 L Bacillus licheniformis 2. 4 AU /g 1. 2 Hitachi S-4700 JEOL JEM-1200EX Olympus Bu
2011 33 6 1117-1121 http / /xuebao. jxau. edu. cn Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis E - mail ndxb7775@ sina. com * 311400 Alcalase 2. 4 L TS225. 1 + 6 A 1000-2286 2011 06-1117 - 05 A Study on
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(Trichophyton rubrum) 90% rdna 18S ITS ATCC-28188 1 (BMU00294) 5 (BMU02464 02465 01672 01643 01645) BMU00294 02464 02465 BMU00294 01672 01643 01645 1. SDA PDA 27 35 4 2. SDA PDA BCP MSG M B VitB 27 30
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2013 35 2 307-312 http / /xuebao. jxau. edu. cn Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis E - mail ndxb7775@ sina. com SSR SCAR 310024 RAPD EST - SSR SCAR 26 24 22 18 81. 8% 7 23 S668. 4 Q943. 2 A 1000-2286
2
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中 国 农 学 通 报 2014,30(5):23-27 Chinese Agricultural Science Bulletin 大 肠 杆 菌 生 物 膜 的 筛 选 及 生 长 曲 线 测 定 喻 华 英, 李 启 峰 ( 塔 里 木 大 学 动 物 科 学 学 院, 新 疆 阿 拉 尔 843300) 摘 要 : 为 探 究 犊 牛 腹 泻 病 中 大 肠 杆 菌 生 物 膜 的 形 成
380 研 究 论 文 发 酵 天 数 双 乙 酰 测 定 : 参 照 GB4927-4928-2001 标 准 发 酵 液 中 的 化 学 成 分 的 测 定 : 采 用 GC-8A 型 气 相 色 谱 测 定 1.5 离 子 注 入 方 法 [6] 把 待 处 理 的 菌 株 细 胞 均 匀 涂
![380 研 究 论 文 发 酵 天 数 双 乙 酰 测 定 : 参 照 GB4927-4928-2001 标 准 发 酵 液 中 的 化 学 成 分 的 测 定 : 采 用 GC-8A 型 气 相 色 谱 测 定 1.5 离 子 注 入 方 法 [6] 把 待 处 理 的 菌 株 细 胞 均 匀 涂](/thumbs/43/23114460.jpg "380 研 究 论 文 发 酵 天 数 双 乙 酰 测 定 : 参 照 GB4927-4928-2001 标 准 发 酵 液 中 的 化 学 成 分 的 测 定 : 采 用 GC-8A 型 气 相 色 谱 测 定 1.5 离 子 注 入 方 法 [6] 把 待 处 理 的 菌 株 细 胞 均 匀 涂")
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48 5 ( Pinctada) ( P. fucata ), 3 [ 7 ] ( P. maxima ) ( P. albina), ( P. margaritifera) ( P. nigra) RAPD, ( P. chemnitzi), ( Pteria penguin) [ 1-2 ] [
![48 5 ( Pinctada) ( P. fucata ), 3 [ 7 ] ( P. maxima ) ( P. albina), ( P. margaritifera) ( P. nigra) RAPD, ( P. chemnitzi), ( Pteria penguin) [ 1-2 ] [](/thumbs/74/71407889.jpg "48 5 ( Pinctada) ( P. fucata ), 3 [ 7 ] ( P. maxima ) ( P. albina), ( P. margaritifera) ( P. nigra) RAPD, ( P. chemnitzi), ( Pteria penguin) [ 1-2 ] [")
5 6 2 00 9 1 2 South China Fisheries Science Vol. 5, No. 6 Dec., 2009 doi: 10. 3969/ j. issn. 1673-2227. 2009. 06. 009 16S rrna,,, (, 510300) : PCR ( Pinctada fucata) ( P. chemnitzi) ( Pteria penguin)
中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 5 卷 第 1 期 201 年 1 月 51 其 他 试 剂 均 为 分 析 纯 对 照 品 栀 子 苷 ( 批 号 1109-201115) 甘 草 苷 ( 批 号 1110-201106) 连 翘 酯 苷
50 中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 5 卷 第 1 期 201 年 1 月 凉 膈 散 汤 剂 HPLC-DAD 指 纹 图 谱 研 究 * 胡 建 兰, 邵 萌, 余 林 中 南 方 医 科 大 学 中 医 药 学 院, 广 东 广 州 510515 摘 要 : 目 的 研 究 凉 膈 散 汤 剂 HPLC-DAD 指 纹 图 谱, 建
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Primer3 http://frodowimitedu/cgi-bin/primer3/primer3_wwwcgi Primer5 Oligo665 Primer5 http://wwwbioonnet/dispbbsasp?boardid=25&id=38536 Oligo667 http://wwwbioonnet/dispbbsasp?boardid=25&id=40898 1 PCR 1
Microsoft Word _编辑 二校出3126
7 8 Vol. 7 No. 8 2016 8 Journal of Food Safety and Quality Aug., 2016 邢良英, 陈 * 琳, 侯保朝, 李言郡 (,, 310018) 摘要 : 目的 方法 45, 104, 16S rdna 结果 8, 4 Lactobacillus plantarum(whh727 WHH730 WHH777 WHH1118) 3 Lactobacillum
211 better than those in the control group, with significant difference between two groups (P < 0.05). The ocular hypertension of patients in the cont
210 毛 果 芸 香 碱 联 合 拉 坦 前 列 素 治 疗 原 发 性 急 性 闭 角 型 青 光 眼 的 疗 效 观 察 符 元 党 1, 郑 振 优 2, 林 再 雄 2, 周 吉 良 1. 昌 江 黎 族 自 治 县 中 西 医 结 合 医 院, 海 南 昌 江 572700 2. 海 南 医 学 院 附 属 医 院 眼 科, 海 南 海 口 570100 1 摘 要 : 目 的 探 讨
: 307, [], [2],,,, [3] (Response Surface Methodology, RSA),,, [4,5] Design-Expert 6.0,,,, [6] VPJ33 ph 3,, ph, OD, Design-Expert 6.0 Box-Behnken, VPJ3
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微 生 物 学 通 报 FEB 20, 2008, 35(2) 306~30 Microbiology 2008 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@im.ac.cn 生 物 实 验 室 响 应 面 分 析 法 优 化 副 溶 血 性 弧 菌 生 长 条 件 刘 代 新 宁 喜 斌 * 张 继 伦 2 (. 200090) (2. 20202) 摘 要
1 引言
P P 第 40 卷 Vol.40 第 7 期 No.7 计 算 机 工 程 Computer Engineering 014 年 7 月 July 014 开 发 研 究 与 工 程 应 用 文 章 编 号 :1000-348(014)07-081-05 文 献 标 识 码 :A 中 图 分 类 号 :TP391.41 摘 基 于 图 像 识 别 的 震 象 云 地 震 预 测 方 法 谢 庭,
~ 10 2 P Y i t = my i t W Y i t 1000 PY i t Y t i W Y i t t i m Y i t t i 15 ~ 49 1 Y Y Y 15 ~ j j t j t = j P i t i = 15 P n i t n Y
* 35 4 2011 7 Vol. 35 No. 4 July 2011 3 Population Research 1950 ~ 1981 The Estimation Method and Its Application of Cohort Age - specific Fertility Rates Wang Gongzhou Hu Yaoling Abstract Based on the
主 编 余 倩 许 欣 编 委 ( 以 章 节 先 后 为 序 ) 张 朝 武 余 倩 许 欣 刘 衡 川 裴 晓 方 汪 川 王 国 庆 林 怡 伶 主 审 殷 强 仲 张 朝 武
高 等 医 药 院 校 教 材 供 卫 生 检 验 专 业 用 卫 生 微 生 物 检 验 且 ( 细 菌 学 分 册 ) 主 编 : 余 倩 许 欣 四 川 科 学 技 术 出 版 社 主 编 余 倩 许 欣 编 委 ( 以 章 节 先 后 为 序 ) 张 朝 武 余 倩 许 欣 刘 衡 川 裴 晓 方 汪 川 王 国 庆 林 怡 伶 主 审 殷 强 仲 张 朝 武 目 IJ I=l 卫 生 微
2011第1期第二部分
中 国 农 学 通 报 2011,27(01):466-470 Chinese Agricultural Science Bulletin 关 于 农 业 信 息 化 与 农 村 信 息 化 关 系 的 探 讨 高 万 林, 张 港 红, 李 桢, 赵 佳 宁 ( 中 国 农 业 大 学 信 息 与 电 气 工 程 学 院, 北 京 100083) 摘 要 : 文 章 通 过 分 析 农 业 农 村
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中 草 药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 8 期 2013 年 4 月 989 养 阴 清 肺 糖 浆 指 纹 图 谱 研 究 1, 姜 姗 2, 冯 丽 君 2, 孔 慧 2, 曲 昌 海 2, 尹 兴 斌 2, 倪 健 1. 北 京 中 医 药 大 学 教 务 处, 北 京 100029 2. 北 京 中 医 药 大 学 中 药 学
,,,, 1980,,,,, 1980, (, J,1980) (,,1980) (,,1982) (,1980) (,1982) (, 1983) (,1983) (, 1983) (,1983) (,1985) (, C,1985), 1981 1982,,, : (1980 ),,,,,, (
2006 2 No. 2,2006 122 JOURNAL OF HISTORIOGRAPHY Serial No. 122 (, 100875 ;, 100006) [ ],, [ ] [ ] K092 [ ]A []100225332 (2006) 0220001211, :,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,, [] 2005212220 1924 ;,, ( :,,1924 ),,,,,,,,,
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2
(food chain) 1 2 3 4 5 α - 2,4-1,4- β- 1,2- α- (w- ) ( ) (2,2'- -3,3', 5,5',6,6'- ) ( ) N- - - N- ( ) N- ( ) (2,3- )- 4,6- - - (2- -1- ) - - - 1,3-4,4-1,3- (2- ) 2,4- ( ) 1,1- 6 7 8 9 10 11 310 195-10
文章
农 学 学 报 2014,4(11):80-84 Journal of Agriculture www.caaj.org 海 带 属 配 子 体 DNA 提 取 及 ISSR-PCR 体 系 优 化 李 言, 崔 翠 菊, 罗 世 菊, 李 晓 捷, 赵 聚 萍, 赛 珊, 钱 瑞, 武 瑞 娜 ( 山 东 东 方 海 洋 科 技 股 份 有 限 公 司 / 国 家 海 藻 工 程 技 术 研 究
1 GIS 95 Y = F y + (1 F) (1) 0 0 Y0 kg/hm 2 /day F y 0 y c kg/hm 2 /day [12] y m 20 kg/hm 2 /hour Y = cl cn ch G [ F( y ) T m yo + (2) (1 F)(
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24 1 Vol.24 No.1 94 2008 1 Transactions of the CSAE Jan. 2008 2008 1 100094 2 100035 3 100081 4 100081 5 100101 GIS ( ) 65.12 16.82 13.74 15.27 11.07 t/(hm 2 a) 10.93% 41.43% 46.93% 65.4%. Bi Jiye, Zhu
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微 生 物 学 通 报 Microbiology China tongbao@im.ac.cn Apr. 20, 2016, 43(4): 793 797 http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn DOI: 10.13344/j.microbiol.china.150504 高 校 教 改 纵 横 生 物 工 程 专 业 发 酵 课 程 群 建 设 探 索 * 赵 宏 宇
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第 30 卷 第 3 期 2015 年 6 月 天 津 科 技 大 学 学 报 Journal of Tianjin University of Science & Technology Vol. 30 No. 3 Jun. 2015 DOI:10.13364/j.issn.1672-6510.20140066 过 表 达 PNP 对 肌 苷 生 产 菌 合 成 利 巴 韦 林 的 影 响 杨 书
2
ISSN 0255-6162 GPN 2006900031 287 93 11 20 161-2 02 26531318 http://www.nlfd.gov.tw 1 2 3 287 4 287 5 44 93 13 1 monocrotophos 0.40 ppm 105 1300 99% 6 3 44 106 93 13 1 0.40 ppm 403 40 7 DNA (HPLC) DNA
: PCR-SSCP 919 ; [5], PCR-SSCP ; rdna, ITS (ITS1-5.8S rdna-its2) 26S rdna D1/D2 [6], [3,7], 100 bp~300 bp SSCP 150 bp~300 bp ITS1 ITS PCR-SSCP,
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微生物学通报 JUN 20, 2009, 36(6): 918~922 Microbiology tongbao@im.ac.cn 生物实验室 2009 by Institute of Microbiology, CAS PCR-SSCP 技术在假丝酵母属菌种鉴别中的应用 * 宋维娟程池 ( 100027) 摘要 : 选取中国工业微生物菌种保藏管理中心 (CICC) 保藏的假丝酵母属的 7 个种 30
200 31 5 SWAN 0. 01 0. 01 6 min TITAN Thunder Identification Tracking Analysis SWAN TITAN and Nowcasting 19 TREC Tracking Radar Echo by Correlaction T
31 1 2013 3 Journal of Arid Meteorology Vol. 31 No. 1 March 2013. SWAN J. 2013 31 1 199-205. doi 10. 11755 /j. issn. 1006-7639 2013-01 - 0199 SWAN 730020 2011 7 7 SWAN SWAN 2012 2 SWAN 1006-7639 2013-01
, GC/MS ph GC/MS I
S00017052 O O , GC/MS ph GC/MS I Abstract Drug abuse is a serious issue throughout the world. Amphetamine-type stimulants (ATS) are substances frequently used by drug abusers. There are significant needs
标题
吉林农业大学学报 ２０１６ ３８ １ ８７ ９１ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｈｔｔｐ ｘｕｅｂａｏ ｊｌａｕ ｅｄｕ ｃｎ Ｅ ｍａｉｌ ｊｌｎｄｘｂ ｖｉｐ ｓｉｎａ ｃｏｍ 神 经 生 长 因 子 ｍｒｎａ 在 鹅 等 级 前 卵 泡 中 的 表达 刘璐璐 隋玉健 朱海洋 武惠岩 杨 辉 孙永峰 吉林农业大学动物科学技术学院 长春 １３０１１８
θ 1 = φ n -n 2 2 n AR n φ i = 0 1 = a t - θ θ m a t-m 3 3 m MA m 1. 2 ρ k = R k /R 0 5 Akaike ρ k 1 AIC = n ln δ 2
35 2 2012 2 GEOMATICS & SPATIAL INFORMATION TECHNOLOGY Vol. 35 No. 2 Feb. 2012 1 2 3 4 1. 450008 2. 450005 3. 450008 4. 572000 20 J 101 20 ARMA TU196 B 1672-5867 2012 02-0213 - 04 Application of Time Series
材 料 与 方 法 仪 器 ACQUITY UPLC Xevo TQ-S 三 重 四 级 杆 液 质 联 用 仪 ( 美 国 Waters 公 司 ); 电 喷 雾 离 子 源 (ESI), Masslynx 4.1 数 据 处 理 系 统 (Waters);Thermo 低 温 离 心 机 ;KQ
[ 应 用 纪 要 ] Rapid identification of 5 illegal additives in slimming health food by Xevo TQ-S 郝 刚 苏 州 市 食 品 药 品 检 验 所, 苏 州 15104 关 键 词 超 高 效 液 相 色 谱 - 质 谱, 多 反 应 监 测, 减 肥 类 保 健 食 品 非 法 添 加, 快 速 定 性 定 量
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41 1 Vol.41, No.1 2010 1 OCEANOLOGIA ET LIMNOLOGIA SINICA Jan., 2010 (Sarotherodon melanotheron) 5 * 1, 2 1 2 2 (1. 453007; 2. 201306) 5, 6, : (1) 6 5 22 49, 190 204, 190/190 204/204 270/223 270/243; (2)
ZHONG Chong A Study on the Map of Provincial Capital of Zhejiang Past and Present 1914 1914 1922 9 45. 5 67. 2 1 1929 3 1912 1929 1907 1909 1909 1912
200234 K921 /927 A 1674-2338 2014 01-0058 - 09 19 20 1 2 2013-08 - 04 41271154 1870-1919 2011BCK001 1971-58 ZHONG Chong A Study on the Map of Provincial Capital of Zhejiang Past and Present 1914 1914 1922
240 生 异 性 相 吸 的 异 性 效 应 [6] 虽 然, 心 理 学 基 础 研 [7-8] 究 已 经 证 实 存 在 异 性 相 吸 异 性 相 吸 是 否 存 在 于 名 字 认 知 识 别 尚 无 报 道 本 实 验 选 取 不 同 性 别 的 名 字 作 为 刺 激 材 料, 通
![240 生 异 性 相 吸 的 异 性 效 应 [6] 虽 然, 心 理 学 基 础 研 [7-8] 究 已 经 证 实 存 在 异 性 相 吸 异 性 相 吸 是 否 存 在 于 名 字 认 知 识 别 尚 无 报 道 本 实 验 选 取 不 同 性 别 的 名 字 作 为 刺 激 材 料, 通](/thumbs/42/22943812.jpg "240 生 异 性 相 吸 的 异 性 效 应 [6] 虽 然, 心 理 学 基 础 研 [7-8] 究 已 经 证 实 存 在 异 性 相 吸 异 性 相 吸 是 否 存 在 于 名 字 认 知 识 别 尚 无 报 道 本 实 验 选 取 不 同 性 别 的 名 字 作 为 刺 激 材 料, 通")
2011 年 Journal of Capital Medical University 4月 第2 期 Apr 2011 Vol 32 No 2 基础研究 doi: 10 3969 / j issn 1006-7795 2011 02 015 人脑识别不同性别名字反应时的差异研究 高迎霄 陈昭燃 * 张明霞 ( 首都医科大学神经生物系高级脑功能中心) 摘要 目的 探讨男女对不同性别名字认知加工速度是否存在差异
Vol. 15 No. 1 JOURNAL OF HARBIN UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Feb O21 A
5 200 2 Vol 5 No JOURNAL OF HARBIN UNIVERSITY OF SCIENCE AND TECHNOLOGY Feb 200 2 2 50080 2 30024 O2 A 007-2683 200 0-0087- 05 A Goodness-of-fit Test Based on Empirical Likelihood and Application ZHOU
76 34 2. 1. 1 Fig. 1 1 a-a b-b a-a σ ma = 74. 4 MPa σ a = 15. 74 MPa σ 0a =90. 15 MPa 0. 9 σ t =135 MPa b-b σ mb = 21. 77 MPa τ b = 13. 789 MPa σ 0b =
34 11 2012 11 SHIP SCIENCE AND TECHNOLOGY Vol. 34 No. 11 Nov. 2012 0 430064 GB150-98 ASME THR3 +. 4 A 1672-7649 2012 11-0075 - 07 doi 10. 3404 /j. issn. 1672-7649. 2012. 11. 017 Stress and fatigue analysis
30期
中 国 农 学 通 报 2014,30(30):285-289 Chinese Agricultural Science Bulletin 傅 里 叶 变 换 红 外 光 谱 法 在 橄 榄 油 掺 假 鉴 别 中 的 应 用 黄 秀 丽, 黄 飞, 曾 宪 远, 宁 焕 焱, 唐 丽 娜, 奉 夏 平 ( 广 东 省 惠 州 市 质 量 计 量 监 督 检 测 所, 广 东 惠 州 516003)
菌 量 ( 表 三 ) 如 果 欲 分 離 N. gonorrhoeae B. pertussis 或 C. diphtheriae 及 少 數 病 毒 時, 應 先 告 知 檢 驗 室 以 便 準 備 特 殊 的 分 離 培 養 基 鏈 球 菌 性 咽 喉 炎 診 斷 鏈 球 菌 性 咽 喉 炎,
上 呼 吸 道 的 感 染 及 檢 體 的 培 養 1,2 賴 美 珠 2 林 金 絲 2 許 國 忠 1 陳 芳 紅 嘉 義 基 督 教 醫 院 1 實 驗 診 斷 科 2 院 內 感 染 管 制 委 員 會 前 言 人 類 呼 吸 道 感 染 是 較 常 見 的 臨 床 感 染, 其 中 由 病 毒 所 引 起 的 佔 絕 大 部 分 ; 若 由 病 毒 引 起 的 案 例, 並 不 需 要 使
小议攀缘植物的分类及应用
双 歧 杆 菌 的 益 生 性 能 及 其 研 究 进 展 作 者 : 家 环 宇 上 海 交 通 大 学 生 命 学 院 研 究 生 学 号 :5050809039 摘 要 : 双 歧 杆 菌 是 人 和 动 物 肠 道 内 最 主 要 的 生 理 性 细 菌 之 一, 与 其 它 生 理 性 细 菌 成 员 构 成 了 微 生 物 群 落, 并 与 宿 主 构 成 一 个 微 生 态 系 统 因
学校代号 10199 学 号20092209134
学 校 代 号 10199 学 号 20092209134 硕 士 学 位 论 文 中 药 塌 渍 护 理 干 预 联 合 超 声 雾 化 对 小 儿 肺 炎 喘 嗽 的 临 床 观 察 研 究 Traditional Chinese medicine collapse stains nursing intervention to joint of ultrasonic atomizer infantile
Shanghai International Studies University THE STUDY AND PRACTICE OF SITUATIONAL LANGUAGE TEACHING OF ADVERB AT BEGINNING AND INTERMEDIATE LEVEL A Thes
上 海 外 国 语 大 学 硕 士 学 位 论 文 对 外 汉 语 初 中 级 副 词 情 境 教 学 研 究 与 实 践 院 系 : 国 际 文 化 交 流 学 院 学 科 专 业 : 汉 语 国 际 教 育 姓 名 : 顾 妍 指 导 教 师 : 缪 俊 2016 年 5 月 Shanghai International Studies University THE STUDY AND PRACTICE
医学科研方法
医 学 科 研 方 法 主 讲 苏 秀 兰 细 胞 生 物 学 教 授 第 一 讲 绪 论 一 概 念 : 在 医 学 科 学 研 究 活 动 中, 运 用 科 学 的 实 践 和 理 论 思 维 的 技 巧, 充 分 发 挥 自 己 的 智 慧, 去 寻 找 观 念 世 界 与 现 实 世 界 之 间 的 联 系 或 规 律, 从 而 发 现 新 现 象, 提 出 新 理 论 的 手 段 二 医
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凿 燥 蚤 院 员 园 援 猿 怨 远 怨 辕 躁 援 蚤 泽 泽 灶 援 2095 原 4301 援 圆 园 员 4 援 园 3 援 006 窑 论 著 Article 窑 益 生 菌 对 儿 童 与 青 少 年 功 能 性 便 秘 治 疗 效 果 的 分 析 王 俊 丽 袁 陈 涛 袁 李 锋 袁 盛 晓 阳 袁 薛 敏 波 * 上 海 交 通 大 学 医 学 院 附 属 新 华 医 院 儿 童
[ 2 ] ; ( Lactobacillus plantarum) ( Leuconostoc mesentcroides) ( L. pentosus) ( Pp) [ 3 ] ; [ ( Pseudosciaena crocea) ( Pediococcus ( Lactobac
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11 4 2 0 1 5 8 South China Fisheries Science Vol. 11, No. 4 Aug., 2015 doi: 10. 3969/ j. issn. 2095-0780. 2015. 04. 016 1, 2, 1 1 1,,, 1 1, ( 1.,, 510300; 2., 535000) :,,, ( EG),, ( CK) ( P < 0. 05) EG,
5 期 周 舒 扬 等 : 黑 龙 江 省 玉 米 弯 孢 菌 叶 斑 病 病 原 鉴 定 及 其 产 细 胞 壁 降 解 酶 和 漆 酶 活 性 分 析 127 菌 分 离 形 态 学 鉴 定 工 作 当 前 黑 龙 江 省 玉 米 主 栽 品 种 缺 乏 抗 病 品 种, 玉 米 弯 孢 菌 叶
玉 米 科 学 2010,18(5):126~130 Journal%of%Maize%Sciences 文 章 编 号 : 1005-0906(2010)05-0126-05 黑 龙 江 省 玉 米 弯 孢 菌 叶 斑 病 病 原 鉴 定 及 其 产 细 胞 壁 降 解 酶 和 漆 酶 活 性 分 析 周 舒 扬 1, 杨 洪 一 1, 赵 敏 1, 梅 丽 艳 2 (1. 东 北 林 业 大 学
1449 1 相 对 校 正 因 子 的 相 关 方 法 1.1 内 标 多 控 法 研 究 发 现, 在 中 药 各 成 分 间 存 在 着 一 定 的 比 例 关 系, 只 要 各 成 分 的 量 符 合 该 比 例 关 系, 中 药 的 多 [6] 指 标 质 量 控 制 可 以 依 此 法
![1449 1 相 对 校 正 因 子 的 相 关 方 法 1.1 内 标 多 控 法 研 究 发 现, 在 中 药 各 成 分 间 存 在 着 一 定 的 比 例 关 系, 只 要 各 成 分 的 量 符 合 该 比 例 关 系, 中 药 的 多 [6] 指 标 质 量 控 制 可 以 依 此 法](/thumbs/40/22057924.jpg "1449 1 相 对 校 正 因 子 的 相 关 方 法 1.1 内 标 多 控 法 研 究 发 现, 在 中 药 各 成 分 间 存 在 着 一 定 的 比 例 关 系, 只 要 各 成 分 的 量 符 合 该 比 例 关 系, 中 药 的 多 [6] 指 标 质 量 控 制 可 以 依 此 法")
1448 相 对 校 正 因 子 在 中 药 多 指 标 测 定 中 的 应 用 研 究 进 展 1, 罗 祖 良 2, 仇 峰 1 1,, 韦 日 伟 2 1,, 覃 禹 2, 张 坤 1, 覃 洁 萍 2, 杨 美 华 1. 北 京 协 和 医 学 院 药 用 植 物 研 究 所, 中 草 药 物 质 基 础 与 资 源 利 用 教 育 部 重 点 实 验 室, 北 京 100193 2. 广
10期(182-402)
中 国 农 学 通 报 2010,26(10):337-342 Chinese Agricultural Science Bulletin 香 蕉 栽 培 管 理 技 术 研 究 概 况 1,2 高 广 平, 易 干 军 1 1, 魏 岳 荣 ( 1 广 东 省 农 业 科 学 院 果 树 研 究 所, 广 州 510640; 2 江 西 农 业 大 学, 南 昌 330045) 摘 要 : 综 述
symmetrical cutting patterns with various materials for visual designing; ii. This part combined costumes, bags and oilpaper umbrellas with the tradit
The Application of Chinese Paper Cutting Patterns to Bag,Costume Designs and oilpaper umbrella TSAI,Yi-lun LIN,Yu-wen Abstract Using bags and costumes is regarded as the extension of human body, and the
42 11, 2004, 100 ; MAHM- 40% [ 1 ] MOD [ 14 ] PCR,, [ 2-3 ] 2001 PCR,, ; [ 4 ] 5% 15% , 95%,, 30%, 80% [ 2, 5] PCR, ( Streptococcus agalactia
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11 3 2 0 1 5 6 South China Fisheries Science Vol. 11, No. 3 Jun., 2015 doi: 10. 3969/ j. issn. 2095-0780. 2015. 03. 007 PCR,,,,,, (,, 530021) : ( Streptococcus agalactiae), cfb TaqMan PCR,, ; DNA 3. 42
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國立中山大學學位論文典藏.PDF
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21 3 2002 5 GEO GRAPHICAL RESEARCH Vol1 21, No1 3 May, 2002 : 100020585 (2002) 0320313211, (, 210093) : GIS, ( ) :, ; 4 ;,, : ; ; ; : F12919 : A 1 20 40 80, 90 [1 ], 5, 4 : (1), [2,3 ] ; (2) [4,5 ], [6
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