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1 行 政 院 原 子 能 委 員 會 委 託 研 究 計 畫 研 究 報 告 醫 療 用 骨 材 臨 床 前 生 物 試 驗 之 應 用 研 究 Application study of pre-clinical biological testing for orthopedic biomaterials 計 畫 編 號 : INER083 受 委 託 機 關 ( 構 ): 國 立 台 北 科 技 大 學 計 畫 主 持 人 : 方 旭 偉 教 授 聯 絡 電 話 : Ext address:[email protected] 核 研 所 聯 絡 人 員 : 伍 德 馨 博 士 蔡 寧 真 報 告 日 期 :100 年 11 月 30 日

2 目 錄 目 錄...I 中 文 摘 要...1 ABSTRACT...3 壹 計 畫 緣 起 與 目 的...4 一 計 畫 緣 起... 4 二 計 畫 目 的 貳 研 究 方 法 與 過 程...11 一 細 胞 毒 性 測 試 : 二 細 胞 貼 附 試 驗 三 內 毒 素 試 驗 四 協 助 建 立 動 物 實 驗 模 式 參 主 要 發 現 與 結 論...25 一 實 驗 結 果 ( 一 ) 細 胞 毒 性 測 試 ( 二 ) 細 胞 貼 附 測 試 二 結 論 肆 參 考 文 獻...31 i

3 中 文 摘 要 近 年 來 國 內 天 然 人 為 造 成 之 工 安 事 故 等 意 外 益 增, 常 造 成 傷 患 嚴 重 骨 缺 陷 骨 折 斷 裂 或 骨 髓 炎 造 成 鄰 近 關 節 攣 縮 和 急 性 骨 髓 炎 等 傷 害, 本 計 畫 將 選 用 具 有 良 好 生 物 相 容 性 材 料 混 合 加 工 製 程 之 複 合 骨 材, 同 時 作 其 生 物 體 外 適 應 性 測 試 及 活 體 相 關 試 驗, 探 討 複 合 骨 材 應 用 其 標 準 動 物 實 驗 模 式 及 活 體 內 之 藥 理 反 應 等 本 研 究 材 料 之 來 源 包 含 以 以 感 溫 性 單 體 N- 異 丙 基 丙 烯 醯 胺 (N-isopropyl acrylamine,nipaam) 丙 烯 酸 (Acrylic acid, AAC) 以 及 交 聯 劑 N,N'- 亞 甲 基 雙 丙 烯 醯 胺 (N,N-mathylene bisacrylamide,nmba) 製 作 而 成 之 高 強 度 及 低 摩 擦 水 膠 以 及 可 作 為 重 建 骨 缺 損 材 料 之 生 物 可 吸 收 的 生 物 載 體 新 式 的 醫 療 用 複 合 骨 材 所 採 用 實 驗 方 法 為 將 已 合 成 之 醫 療 用 複 合 骨 材 進 行 細 胞 毒 性 細 胞 貼 附 實 驗 以 及 熱 原 試 驗 本 研 究 使 用 MTT assay 與 LDH assay 方 法 針 對 三 種 合 成 不 同 形 式 之 醫 療 用 複 合 骨 材 進 行 細 胞 毒 性 評 估, 實 驗 結 果 顯 示 出 三 種 型 式 的 複 合 骨 材 皆 具 有 低 細 胞 毒 性 與 良 好 的 生 物 相 容 性 在 細 胞 貼 附 實 驗 部 分, 利 用 MTT 與 LDH assay 進 行 細 胞 貼 附 材 料 表 面 生 長 情 況 評 估 MTT assay 實 驗 結 果 顯 示 由 於 細 胞 於 材 料 表 面 生 長 情 形 與 在 培 養 盤 中 生 長 有 所 差 異, 所 以 細 胞 於 材 料 表 面 存 活 率 不 高 使 用 LDH assay 測 試 細 胞 毒 性 (cell cytoxicity), 實 驗 結 果 顯 示 材 料 依 然 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性 且 具 有 低 細 胞 毒 性 透 過 符 合 醫 療 器 材 管 理 風 險 評 估 1

4 ISO 精 神 規 範, 本 研 究 最 終 建 立 合 宜 的 新 型 醫 療 用 骨 材 材 料 開 發 上 市 流 程 2

5 Abstract With the increasing need of biomedical implants for orthopedic diseases, the orthopedic biomaterials become the focused items in biotechnology industry. The purpose of this project is to carry out the related experiments to evaluate the biological responses of the testing orthopedic biomaterials. We are going to perform the biocompatibility tests for a composite bone graft material made of N-isopropyl acrylamine, N,N-mathylene bisacrylamide, and acrylic acid. It is attempted to apply this hydrogel with high strength and low friction characteristics for bone re-construction. To analyze the effect of cytotoxicity tests with three types composite bone graft material on L929 cell line for comparison, MTT and LDH assay of composite bone graft material extracts was used to treat on L929 cells and measured with OD570 and OD340 three days. The OD570 indicated good cell viability which up to 85% of control by MTT assay. The composite bone graft material also shows low cell toxicity according to results of LDH assay. By applying the ISO based risk assessment procedures, it is expected to develop an appropriate testing procedure for new developed orthopedic biomaterials. 3

6 壹 計 畫 緣 起 與 目 的 一 計 畫 緣 起 配 合 政 府 將 高 價 值 生 物 和 生 醫 技 術 工 業 納 入 國 內 經 濟 發 展 重 點 項 目, 而 兩 兆 雙 星 產 業 計 劃 亦 將 生 醫 產 業 列 為 積 極 推 動 要 項, 因 應 使 經 濟 發 展 之 重 點, 且 近 年 來 國 內 天 然 人 為 造 成 之 工 安 事 故 等 意 外 益 增, 常 造 成 傷 患 嚴 重 骨 缺 陷 骨 折 斷 裂 或 骨 髓 炎 造 成 鄰 近 關 節 攣 縮 和 急 性 骨 髓 炎 等 傷 害 因 而 痛 苦 炎 等 傷 害 因 而 痛 苦, 本 計 劃 將 選 用 具 有 良 好 生 物 相 容 性 材 料 混 合 加 工 製 程 之 複 合 骨 材 同 時 作 其 生 物 體 外 適 應 性 測 試 及 活 體 相 關 試 驗, 探 討 複 合 骨 材 應 用 其 標 準 動 物 實 驗 模 式 及 活 體 內 之 藥 理 反 應 等 骨 缺 損 的 癒 合 需 靠 兩 端 的 骨 組 織 新 生 堆 疊 而 結 合, 臨 床 上 對 於 骨 折 之 處 理, 可 藉 由 骨 釘 骨 板 等 醫 療 器 材 提 供 骨 固 定 (bone fixation) 不 僅 可 以 提 供 缺 損 處 力 學 的 支 持, 也 可 以 幫 助 骨 缺 損 間 距 在 臨 界 缺 損 (critical defect) 以 內 直 接 癒 合 (direct bone healing) 而 當 骨 缺 損 間 距 過 大 時, 則 須 使 用 間 接 癒 合 (indirect bone healing) 方 式 進 行 修 復 首 先 形 成 將 整 個 血 腫 患 部 包 圍, 待 新 生 血 管 長 出 後, 再 逕 行 刺 激 骨 組 織 再 生 並 使 深 入 缺 損 區 域 由 臨 床 經 驗 告 知 當 骨 缺 損 之 間 距 拉 大 後, 其 間 接 性 骨 癒 合 的 能 力 則 相 對 的 下 降 許 多 此 時 便 需 要 進 行 骨 移 植 手 術 以 輔 助 間 接 骨 癒 合 的 進 行 所 以 具 可 塑 性 (shapeable) 或 可 注 射 式 (injectable) 之 骨 填 補 材, 不 僅 具 操 作 便 利 性, 更 能 迅 速 且 密 合 地 置 入 無 特 定 形 狀 之 骨 缺 損 區 域 減 少 可 能 之 傷 口 的 感 染 及 疤 痕 的 產 生, 降 低 病 患 的 疼 痛 不 適 在 市 場 分 析 與 現 況 方 面, 生 物 可 吸 收 高 分 子 材 料 具 有 生 物 分 解 性 (Biodegradable) 與 生 物 吸 收 性 (Biobsorbable) 及 生 物 相 容 4

7 性 (Biocompatible) 之 特 性, 基 於 此 特 性, 生 物 吸 收 性 材 料 在 醫 療 用 途 上 佔 有 相 當 重 要 的 地 位, 先 進 國 家 均 投 入 大 量 資 源 進 行 學 術 研 究 與 產 品 開 發 目 前 全 世 界 生 醫 材 料 的 產 值 已 超 過 40 億 美 金, 依 據 英 國 DRA 統 計 醫 療 用 骨 材 之 總 產 值 已 超 過 120 億 美 金 綜 合 國 內 外 醫 療 材 料 產 品 發 展 趨 勢 之 演 變, 與 隨 著 國 人 經 濟 收 入 的 逐 年 增 加, 生 活 品 質 的 快 速 提 昇, 對 醫 療 品 質 日 益 的 重 視, 未 來 對 生 物 高 分 子 材 料 產 品 及 其 需 求 勢 必 大 幅 成 長 各 國 法 規 針 對 醫 療 器 材 管 理 尤 其 是 植 入 式 醫 材 管 理 辦 法 對 於 安 全 性 的 考 量 相 當 嚴 謹 不 但 在 人 體 適 用 性 上, 要 做 到 不 引 起 毒 性, 不 過 敏, 且 所 使 用 的 材 料 一 定 要 能 抗 菌 滅 菌 乃 至 於 生 物 可 分 解, 其 製 品 更 要 低 單 價 才 能 符 合 醫 院 經 營 上 的 考 量 本 計 畫 擬 針 對 醫 療 用 骨 材, 同 時 參 考 ISO 以 及 臨 床 前 試 驗 規 範 等, 設 計 一 套 標 準 生 物 相 容 性 檢 測 流 程, 在 實 驗 進 行 同 時, 收 集 大 量 實 驗 數 據 作 為 本 研 究 之 醫 療 用 骨 材 進 行 系 統 化 體 外 生 物 適 應 性 評 估 之 依 據 5

8 本 研 究 材 料 之 來 源 包 含 以 感 溫 性 單 體 N- 異 丙 基 丙 烯 醯 胺 (N-isopropyl acrylamine,nipaam) 丙 烯 酸 (Acrylic acid, AAC) 以 及 交 聯 劑 N,N'- 亞 甲 基 雙 丙 烯 醯 胺 (N,N-mathylene bisacrylamide, NMBA) 製 作 而 成 之 高 強 度 及 低 摩 擦 水 膠 以 及 可 作 為 重 建 骨 缺 損 材 料 富 含 有 血 小 板 膠 之 生 物 可 吸 收 的 生 物 載 體 新 式 的 醫 療 用 複 合 骨 材 目 前 研 究 水 膠 所 面 臨 的 挑 戰 為 提 供 足 夠 強 度 之 水 膠 應 用 於 脊 椎 骨 關 節 軟 骨 肌 腱 與 韌 帶 等 結 締 組 織 上 利 用 水 膠 取 代 以 上 之 組 織, 於 活 體 內 外 必 須 具 備 極 低 的 表 面 摩 擦 及 磨 耗 性, 適 當 的 彈 性 模 數 與 高 機 械 強 度, 例 如, 含 有 70% 水 分 的 關 節 軟 骨 在 數 百 MPa 及 一 百 萬 次 循 環 應 力 作 用 下 呈 現 非 常 低 的 磨 耗 係 數 但 是 目 前 以 天 然 及 合 成 材 料 製 備 的 水 膠 都 不 具 備 合 乎 關 節 軟 骨 置 換 所 需 要 的 機 械 強 度, 目 前 研 究 水 膠 普 遍 的 機 械 強 度 均 在 10-2 ~10-1 MPa 之 間, 仍 不 足 以 應 用 於 脊 椎 骨 關 節 軟 骨 肌 腱 與 韌 帶 等 組 織 上, 本 研 究 團 隊 過 去 已 成 功 研 發 出 具 有 高 機 械 強 度 以 及 彈 塑 性 質 的 醫 療 用 骨 填 補 材 料, 將 會 是 很 適 合 取 代 脊 椎 骨 關 節 軟 骨 等 組 織 的 組 織 工 程 材 料 一 般 常 用 的 骨 移 植 的 來 源 主 要 有 三 個 : 自 體 異 體 異 種 的 骨 填 補 物, 但 臨 床 使 用 上 各 有 其 風 險 自 體 骨 移 植 : 感 染 風 險 最 低 骨 融 合 情 況 最 佳 的 方 式, 但 是 為 了 取 得 自 體 骨, 需 要 再 進 行 手 術, 而 且 取 走 部 份 的 骨 頭 可 能 會 造 成 骨 頭 的 應 力 改 變, 甚 是 造 成 骨 折, 而 且 無 法 取 得 大 量 的 骨 組 織 同 時 自 體 骨 的 吸 收 常 是 不 可 預 期 (un-predictable resorption) 異 體 移 植 : 來 自 於 他 人 捐 贈 的 骨 頭, 一 般 保 存 在 骨 銀 行 中, 可 ㄧ 次 取 得 較 大 量 的 骨 組 織, 但 是, 即 使 組 織 已 經 過 病 毒 篩 檢 6

9 降 低 抗 原 反 應, 仍 是 有 感 染 藉 血 液 傳 播 的 疾 病 之 風 險, 如 : 肝 炎 愛 滋 病 梅 毒 等 等 異 種 移 植 : 來 自 動 物 的 骨 頭, 大 多 為 牛 或 猪, 在 經 過 特 殊 的 處 理 後 用 來 植 入 骨 缺 損 中, 但 是 其 引 起 的 免 疫 反 應 較 前 兩 者 大, 而 且 也 可 能 被 傳 染 人 畜 共 通 疾 病 為 降 低 施 行 手 術 的 風 險, 避 免 免 疫 感 染 等 問 題, 目 前 有 許 多 組 織 工 程 的 研 究 將 注 意 力 轉 移 到 含 有 骨 整 合 性 植 體 (osseointerated implants) 的 開 發 上, 並 且 目 前 已 有 許 多 研 究 結 果 發 表 引 導 骨 組 織 再 生 (Guided bone regeneration, GBR) 就 是 利 用 具 骨 引 導 或 是 骨 誘 導 的 材 料 來 幫 助 骨 缺 損 的 修 補 而 理 想 的 骨 填 補 材 料 而 言 需 要 具 備 下 列 要 素 :(1) 生 物 相 容 性 (compatibility), 材 料 在 植 入 後 必 須 要 和 植 入 處 的 組 織 共 存 而 不 引 發 免 疫 反 應 (2) 骨 誘 導 性 (osteoinductive), 可 促 進 骨 性 組 織 分 化 及 增 生 的 生 長 激 素 的 分 泌 (3) 骨 引 導 性 (osteoconductive), 填 補 材 料 的 結 構 如 : 孔 洞 大 小 (pore size) 孔 洞 率 (porosity) 機 械 強 度 以 及 生 物 降 解 性 (biodegradability) 目 前 臨 床 常 使 用 之 骨 傳 導 基 質 (osteoconductive scaffold) 成 份 係 混 合 60% 的 hydroxyapatite 及 40% Tricalcium phosphate, 由 於 缺 乏 骨 誘 導 能 力 (osteoinduction) 所 以 骨 質 新 生 之 能 力 有 限, 僅 限 於 implant 之 邊 緣 所 以 具 可 塑 性 (malleable) 或 可 注 射 式 (injectable) 之 骨 填 補 材, 不 僅 具 操 作 便 利 性, 更 能 迅 速 且 密 合 地 置 入 無 特 定 形 狀 之 骨 缺 損 區 域 減 少 可 能 之 傷 口 的 感 染 及 疤 痕 的 產 生, 降 低 病 患 的 疼 痛 不 適 目 前 在 市 售 之 具 可 塑 性 骨 填 補 材 商 品 中, 產 品 上 採 用 海 綿 狀 脫 鈣 骨 基 質 (demineralized bone matrix, DBM) 之 異 體 骨 以 不 同 載 7

10 體 (carrier) 混 合 黏 接, 形 成 具 有 可 塑 性 之 凝 膠 (gel) 或 黏 土 (putty) 狀 之 骨 填 補 材, 如 Dynagraft (GenSci) 採 用 PF-127(Pluronic ) 為 載 體 製 成 黏 土 狀 Osteofil SoloCervical Allograft(Regeneration Technologies) 則 是 以 膠 原 蛋 白 (collagen) 為 載 體 Grafton (Osteotech) 則 採 用 丙 三 醇 (glycerol) 為 載 體, 以 增 加 黏 稠 度 之 方 式 賦 予 產 品 良 好 之 可 塑 性 另 一 方 面 亦 可 使 用 磷 酸 鈣 鹽 類 粉 體 與 磷 酸 溶 液 混 合 後, 形 成 具 有 可 注 射 性 (injectable) 而 且 在 37 時 可 因 水 合 作 用 產 生 自 我 硬 化 (self-setting) 之 磷 酸 鈣 骨 水 泥 (calcium phosphate cement, CPC), 市 售 商 品 包 括 BoneSource (Stryker Leibinger) α-bsm (Etex), 與 Norian SRS (Skeletal Repair System)(Synthes) 等, 然 而 上 述 產 品 雖 操 作 便 利, 但 在 固 化 時 間 與 機 械 物 性 方 面 仍 有 改 善 空 間, 同 時 這 些 產 品 均 無 骨 誘 導 能 力 ( osteoinductive potential) 關 於 誘 導 骨 質 新 生 因 子 之 研 究, 其 中 最 為 廣 泛 討 論 的 是 骨 生 長 激 素 (Bone Morphogenetic Protein; BMP) 但 在 臨 床 的 使 用 上, BMP 的 使 用 仍 有 許 多 限 制, 例 如 用 量, 可 能 之 副 作 用, 仍 有 許 多 不 確 定 之 因 素, 同 時 價 格 昂 貴, 所 以 臨 床 使 用 之 文 獻 極 為 有 限, 美 國 FDA 也 不 再 允 許 臨 床 使 用 長 久 以 來, 我 們 都 知 道 當 組 織 受 傷 後, 血 小 板 會 聚 集 於 血 管 受 損 之 位 置 形 成 platelet aggregate, 發 揮 止 血 之 功 能, 但 近 年 來 的 研 究 發 現 血 小 板 細 胞 質 內 之 α 顆 粒, 儲 存 有 許 多 生 長 因 子 如 Platelet derived growth factor (PDGF), Transforming growth factor (TGF),Vascular endothelial growth factor(vegf) 以 及 Epidermal growth factor (EGF) 而 間 葉 幹 細 胞 的 細 胞 膜 上 有 這 些 生 長 因 子 的 接 收 體 (receptor) 當 這 些 生 長 因 子 與 細 胞 膜 上 的 接 受 體 結 合 後, 會 誘 導 間 葉 幹 細 胞 成 為 骨 先 驅 細 胞 8

11 (osteogenic precursor cell) 產 生 類 骨 質 (osteoid) Weibrich G. et al 年 以 類 成 骨 細 胞 進 行 體 外 測 試, 針 對 不 同 濃 度 的 血 小 板 膠 會 刺 激 類 成 骨 細 胞 生 長, 從 而 推 論 於 體 內 試 驗 終 將 會 影 響 成 骨 新 生 速 度 [9] 臨 床 上 也 有 使 用 在 病 患 局 部 口 腔 手 術 中 協 助 組 織 受 損 癒 合 的 研 究 本 研 究 團 隊 經 產 學 合 作, 與 國 內 美 瑞 世 生 物 科 技 公 司 及 法 國 Human plasma product services 合 作 研 發 製 成 可 以 製 作 凝 血 酶 之 thrombin generation device (TGD), 此 一 裝 置 已 經 衛 生 署 許 可 上 市 ( 許 可 証 字 號 : 衛 署 醫 器 製 字 第 號 ) 在 93 年 及 94 年 國 科 會 的 計 劃 中 我 們 己 經 能 成 功 的 自 製 血 小 板 膠, 並 使 用 於 大 白 兔 及 臨 床 病 患 修 補 顱 骨 缺 損, 結 果 証 實 骨 質 新 生 程 度 相 當 理 想. 人 體 實 驗 論 文 [Cranioplasty using osteoconductive scaffold and platelet glue] 巳 於 2008 年 為 Journal of Trauma 接 受 刊 登 95 年 國 科 會 計 劃 中, 我 們 將 此 生 物 醫 材 應 用 於 大 白 鼠 眼 眶 底 骨 折 之 修 補, 結 果 証 實 生 物 適 應 性 骨 質 新 生 程 度 相 當 理 想 因 此 自 96 年 開 始, 本 研 究 小 組 向 國 科 申 請 連 續 性 三 年 之 研 究 用 於 臨 床 眼 眶 底 部 粉 碎 性 骨 折 病 患 之 修 復, 臨 床 實 驗 已 於 99 年 7 月 結 束 本 計 畫 選 用 以 感 溫 性 單 體 N- 異 丙 基 丙 烯 醯 胺 (N-isopropyl acrylamine,nipaam) 丙 烯 酸 (Acrylic acid, AAC) 以 及 交 聯 劑 N,N'- 亞 甲 基 雙 丙 烯 醯 胺 (N,N-mathylene bisacrylamide,nmba), 成 功 製 備 高 強 度 奈 米 複 合 水 膠 支 架 此 支 架 具 備 良 好 的 孔 洞 聯 結 性, 利 於 細 胞 營 養 物 之 流 通 ; 含 水 率 85 %, 利 於 搭 載 生 長 因 子 ; 壓 縮 強 度 高 達 42 MPa, 細 胞 在 培 養 的 過 程 中, 仍 可 維 持 支 架 結 構 的 完 整 性, 因 此 非 常 適 合 做 為 培 養 骨 細 胞 及 攜 帶 血 小 板 膠 之 支 9

12 架 前 期 於 三 總 團 隊 實 驗 中 已 證 明 於 眼 窩 骨 骼 修 復 去 有 良 好 效 果, 材 料 材 質 柔 軟 及 可 塑 性 高, 本 身 具 有 優 秀 的 骨 傳 導 性 質, 具 有 促 進 骨 癒 合 效 果 以 及 空 間 維 持 的 效 能, 幫 助 骨 缺 損 部 位 組 織 修 復 癒 合 為 完 整 高 值 化 醫 療 奈 米 複 合 骨 材 臨 床 前 試 驗 評 估, 協 助 國 內 臨 床 醫 療 應 用 技 術 發 展, 本 計 畫 透 過 符 合 醫 療 器 材 管 理 風 險 評 估 ISO 精 神 規 範, 建 立 合 宜 的 新 型 醫 療 用 骨 材 材 料 開 發 上 市 流 程 未 來 研 究 則 希 望 透 過 累 積 的 經 驗 數 據, 應 用 於 臨 床 應 用 導 向 活 體 動 物 試 驗 設 計, 統 計 高 單 價 醫 用 奈 米 複 合 骨 材 植 入 動 物 實 驗 情 形, 配 合 顯 微 放 設 攝 影 機 造 影 及 組 織 切 片 等 技 術, 逐 次 評 估 附 合 生 醫 成 品 新 生 骨 形 成 面 積 礦 物 質 沉 積 狀 況 等 骨 組 織 型 態 評 估 二 計 畫 目 的 本 研 究 應 用 新 型 醫 療 奈 米 複 合 骨 材 混 合 血 小 板 膠 於 臨 床 前 試 驗 提 供 生 物 相 容 性 檢 測 與 體 內 植 入 物 內 毒 素 檢 測 分 析 技 術 可 細 分 為 以 下 三 點 工 作 說 明 1. 建 立 已 合 成 之 醫 療 用 複 合 骨 材 之 細 胞 毒 性 和 細 胞 貼 附 主 要 實 驗 及 結 果, 以 作 其 生 物 體 外 適 應 性 評 估 2. 共 同 建 立 此 醫 療 用 骨 材 之 標 準 植 入 較 大 型 動 物 實 驗 模 式, 逐 次 評 估 其 生 物 體 內 安 全 性 3. 逐 步 依 序 建 置 醫 療 用 骨 材 之 內 毒 素 試 驗 標 準 模 式 及 技 術 10

13 貳 研 究 方 法 與 過 程 一 細 胞 毒 性 測 試 : 依 細 胞 幾 何 型 態 實 驗 觀 察 體 外 細 胞 毒 性 測 試 以 及 纖 維 母 細 胞 於 水 膠 表 面 之 培 養 等 方 式 評 估 醫 療 用 複 合 骨 材 細 胞 毒 性 測 試 1. 細 胞 活 性 測 試 (MTT assay) 3-(4,5- 二 甲 基 噻 唑 -2)-2,5- 二 苯 基 四 氮 唑 溴 鹽 (3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltet razolium bromide), 簡 稱 MTT, 為 黃 色 水 溶 性 固 體, 可 被 活 細 胞 粒 線 體 中 之 去 氫 (mitrchondrial succinate dehydrogenases) 代 謝 還 原 產 生 紫 色 的 沉 澱 物 formazan 因 僅 有 活 細 胞 內 才 存 在 具 活 性 之 粒 線 體 酵 素, 故 可 藉 助 測 定 formazan 產 量 的 多 寡 來 評 估 細 胞 之 存 活 率 其 步 驟 簡 述 如 下 : 將 待 測 活 性 之 細 胞 樣 本 中 的 培 養 液 吸 除 後, 以 PBS 沖 洗 數 次 加 入 1 ml 含 MTT 之 新 鮮 培 養 液 (0.5 mg MTT/mL), 並 置 於 37 之 培 養 箱 內 反 應 三 個 小 時 移 除 未 反 應 含 有 MTT 之 培 養 液 後, 添 加 500 μl DMSO, 使 用 vortex 震 盪 至 紫 色 formazan 顆 粒 完 成 溶 解 為 止 取 200 μl 溶 有 formazan 之 DMSO 於 酵 素 免 疫 分 析 儀 (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay) 下, 於 波 長 570 nm 下 測 量 其 吸 光 值, 參 考 波 長 為 650 nm 2. 乳 酸 去 氫 酶 (Lactate dehydrogenase: LDH) 測 試 : 研 究 使 用 Sigma 公 司 所 生 產 之 試 劑 組 (LDH ; St Louis, US)[Bowers and McComb, 1966], 分 析 不 同 反 應 時 間 下 收 集 的 細 胞 培 養 液 利 用 乳 酸 去 氫 酶 將 乳 酸 (Lactate) 氧 化 成 丙 酮 酸 (Pyruvate) 和 NADH (Reduced Nicotinamide Adenine 11

14 Dinucleotide) 的 一 種 催 化 過 程 當 NADH 生 成 時, 在 波 長 340nm 下 為 最 大 吸 光 值, 所 測 得 的 吸 光 值 愈 大 便 表 示 乳 酸 去 氫 酶 活 性 愈 高 此 試 劑 之 成 份 包 括 Lactate 50 mmol/l,nad 7 mmol/l, Buffer ph=8.9, 其 中 NAD (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) 是 作 為 此 酵 素 反 應 中 的 氫 離 子 接 受 器 總 反 應 時 間 為 4.5 分 鐘, 而 實 際 測 試 的 反 應 時 間 為 3 分 鐘, 溫 度 設 定 為 37 ( 因 不 同 的 溫 度 有 其 不 同 的 反 應 係 數 ), 以 公 式 換 算 求 得 真 正 的 LDH 活 性 濃 度 值, 公 式 如 下 : LDH (U/L) = A per min* TV* 1000/ 6.22* SV* LP A per min = change in absorbance per minute at 340nm TV = total volume (1.05 ml) 1000 = conversion of units per ml to units per liter 6.22 = milimolar absorptivity of NAD at 340nm SV = sample volume (0.05 ml) LP = light path (1 cm) LDH (U/L)= A per min* 1.05* 1000/ 6.22* 0.05= A per min* 3376 二 細 胞 貼 附 試 驗 1. 材 料 表 面 細 胞 貼 附 試 驗 (1) 將 薄 膜 以 酒 精 滅 菌 後, 置 於 無 菌 操 作 臺 靜 置 乾 燥 (2) 將 這 些 薄 膜 置 於 24-well 中 (3) 在 每 一 well 中 注 入 個 纖 維 母 細 胞 株, 為 細 胞 貼 附 測 試 的 起 始 個 數 將 此 24-well 培 養 皿 放 入 培 養 箱, 設 定 溫 度 為 37 及 5% CO2 24 小 時 後 觀 察 細 胞 的 生 長 情 況, 且 選 取 三 個 well 計 數 貼 附 在 對 照 組 polystyrene(ps) 12

15 上 的 細 胞 個 數, 以 此 數 目 當 作 材 料 放 入 前 PS 表 面 細 胞 貼 附 個 數 將 薄 膜 放 入 每 一 well 中, 使 薄 膜 平 貼 於 PS 表 面 上 的 細 胞, 放 入 培 養 箱, 設 定 溫 度 為 37 及 5%CO2 (4) 分 別 在 12 小 時 48 小 時 及 96 小 時, 以 0.3 ml 的 trypsin-edta 將 細 胞 株 打 下 來, 再 以 0.2 ml 的 PBS 溶 液 沖 洗, 收 集 成 0.5 ml 的 細 胞 溶 液 (5) 將 細 胞 懸 浮 液 以 trypsin blue 染 色 後, 利 用 位 相 差 顯 微 鏡 細 胞 計 數 纖 維 母 細 胞 的 個 數 (6) 記 錄 纖 維 母 細 胞 的 貼 附 與 生 長 個 數, 並 用 位 差 顯 微 鏡 拍 下 纖 維 母 細 胞 在 材 料 上 的 貼 附 及 生 長 狀 態 2. 亞 甲 藍 (Methylene blue) 染 色 觀 察 (1) 藥 品 配 製 a. 亞 甲 藍 溶 液 : 稱 取 0.02 克 的 Methylene blue dihydrate 及 0.1 克 的 Na2B4O7, 加 入 10 ml 的 去 離 子 水 中 (2) 實 驗 步 驟 a. 將 sample 以 PBS 清 洗 三 次 後, 以 4% paraformaldehyde 溶 液 作 細 胞 固 定, 室 溫 下 反 應 20 min b.pbs 清 洗 三 次,2 min/ 次 c. 去 離 子 水 清 洗 三 次,2 min/ 次 d. 加 入 亞 甲 藍 染 劑 約 5 sec 後, 以 去 離 子 水 進 行 退 染 e. 以 位 相 差 顯 微 鏡 進 行 觀 察 三 內 毒 素 試 驗 依 照 中 華 藥 典 第 六 版 附 錄 之 細 胞 內 毒 素 檢 驗 法 進 行 測 試 13

16 本 法 係 利 用 Limulus polyphemus 之 循 環 阿 米 巴 變 形 細 胞 (circulating amebocyte) 水 性 抽 提 液 製 成 LAL(Limulus Amebocyte Lysate) 試 劑, 與 細 菌 內 毒 素 結 合 可 形 成 凝 膠 之 特 性, 以 已 知 濃 度 內 毒 素 標 準 品 稀 釋 液 及 檢 品 所 作 稀 釋 液, 與 已 知 效 價 之 LAL 試 劑 同 時 作 用 相 比 對, 以 測 定 檢 品 內 所 含 細 菌 內 毒 素 量 之 方 法 內 毒 素 是 由 格 蘭 氏 陰 性 菌 所 產 生 的 物 質, 易 引 發 人 體 的 過 敏 反 應 與 發 炎 反 應 本 研 究 將 依 上 述 標 準 逐 步 建 立 以 LAL 分 析 來 測 試 醫 療 用 骨 材 之 內 毒 素 試 驗 模 式, 及 先 期 技 術 四 協 助 建 立 動 物 實 驗 模 式 1. 本 計 畫 動 物 實 驗 模 式 建 立 採 用 之 研 究 方 法 與 執 行 步 驟 : (1) 水 膠 製 作 由 原 能 所 生 醫 材 料 研 究 團 隊 負 責 製 造 生 產, 該 研 究 團 隊 已 於 99 年 原 子 能 科 技 研 究 計 劃 中 已 能 成 功 製 成 孔 洞 性 水 膠 (2) 血 小 板 膠 製 作 由 三 軍 總 醫 院 整 形 外 科 陳 天 牧 教 授 負 責, 在 過 去 數 年 的 國 14

17 科 會 研 究 計 劃 中, 研 究 團 隊 已 能 自 製 血 小 板 膠, 其 生 物 安 全 性 也 已 獲 臨 床 實 驗 証 實 實 驗 操 作 前 抽 取 患 者 20~60 cc 的 血 液, 經 離 心 機 器 血 球 細 胞 分 離 機 (Sepax cell separation system, 衛 暑 醫 器 輸 字 第 號 ) 分 離 出 高 濃 度 的 血 小 板 濃 厚 血 漿 (PRP), 與 thrombin 以 體 積 1:1 進 行 混 合 製 成 血 小 板 膠 使 用 人 造 thrombin 係 以 血 漿 與 10% CaCl2 混 合, 注 入 國 內 自 行 研 發 生 產 之 thrombin generation device (TGD), 搖 晃 30 秒 後, 靜 置 30 分 鐘, 再 以 空 針 取 出 應 用 (3) 水 膠 與 血 小 板 膠 複 合 材 料 製 作 由 三 軍 總 醫 院 整 形 外 科 陳 天 牧 教 授 負 責, 於 動 物 實 驗 前 將 水 膠 材 料 與 血 小 板 膠 充 分 混 合 後 植 入 受 測 動 物, 並 進 行 縫 合 (4) 動 物 實 驗 以 大 鼠 顱 骨 植 入 複 合 植 體 觀 察 骨 缺 損 成 骨 狀 況 做 為 動 物 模 式, 動 物 分 組 如 下 (a) 實 驗 _1 組 (4 隻 大 白 鼠 ) 將 植 入 孔 洞 性 水 膠 混 合 血 小 板 膠, (b) 實 驗 _2 組 (4 隻 大 白 鼠 ) 將 植 入 孔 洞 性 水 膠 ( 粉 狀 ) 混 合 血 小 板 膠, (c) 陽 性 對 照 組 (4 隻 大 白 鼠 ) 將 僅 植 入 孔 洞 性 水 膠, (d) 陰 性 對 照 組 (4 隻 大 白 鼠 ) 將 不 植 入 任 何 物 質 15

18 (5)手術三個月後將犧牲動物 將植入物及周圍 2-4mm 取 出 評估方法包括 (a)巨觀檢查:觀察正常部位和植入的生醫複合物之間骨缺損 修復的癒合及組織發炎反應狀況 (b)顯微放射攝影(評估植入之生醫物質吸收 新生骨形成 及 礦 物 質 沈 積 ) 鼻 竇 標 本 經 70% 酒 精 固 定 二 天 後 經 Villanueva 骨染色劑染色約三週後 以不同濃度酒精脫水 再 16

19 以 丙 酮 脫 蠟, 然 後 再 放 入 甲 基 複 合 樹 脂 液 中, 每 日 抽 氣 並 加 入 新 的 monomer, 共 抽 氣 一 週, 最 後 進 入 包 埋 標 本 用 電 動 鋸 片 機 進 行 鋸 片 後, 先 進 行 顯 微 放 射 攝 影 術, 後 將 標 本 磨 成 約 µm 之 標 本 片, 再 利 用 Leica DMLB 螢 光 顯 微 鏡 配 合 硬 組 織 影 像 分 析 專 用 軟 體 osteomeasure 進 行 骨 組 織 形 態 學 評 估 以 顯 微 放 射 攝 影 儀 (Ohmic OM-603, Tokyo) 照 射, 並 以 高 相 差 X 光 底 片 顯 影 (high contrast X-ray film at 28 KV, 3 MA, for 40s) 由 此 可 分 析 出 植 入 的 生 醫 複 合 物 是 否 被 吸 收 以 及 新 生 骨 形 成 及 礦 物 化 沉 積 情 形 (c) 骨 組 織 形 態 學 評 估 ( 包 括 新 生 骨 面 積, 單 位 面 積 造 骨 細 胞 及 破 骨 細 胞 數 目, 單 位 面 積 造 骨 細 胞 及 破 骨 細 胞 數 目, 骨 小 樑 平 均 厚 度, 礦 物 質 沈 積 狀 態 ) 骨 組 織 形 態 學 評 估 主 要 包 括 有 以 下 幾 項 動 態 和 靜 態 參 數 : 新 生 骨 面 積, 單 位 面 積 造 骨 細 胞 及 破 骨 細 胞 數 目, 骨 小 樑 平 均 厚 度, 礦 物 質 沈 積 狀 態 17

20 (d) 病 理 切 片 標 本 製 作 將 動 物 犧 牲 後, 以 手 術 器 具 取 下 觀 察 部 位 進 行 標 本 製 作, 以 福 馬 林 溶 液 將 標 本 浸 泡 一 周 後, 進 行 脫 鈣, 以 石 蠟 包 埋 法 將 組 織 包 埋, 並 取 標 本 切 片 進 行 H&E stain 染 色 觀 察 骨 缺 損 部 位 修 復 情 形 (i) 標 本 照 片 植 入 水 膠 _1 18

21 植 入 水 膠 _2 植 入 水 膠 _3 19

22 植 入 水 膠 _4 PRP 製 作 20

23 植 入 水 膠 +PRP_1 植 入 水 膠 +PRP_2 21

24 植 入 水 膠 +PRP_3 植 入 水 膠 +PRP_4 22

25 植 入 水 膠 ( 粉 )+PRP_1 植 入 水 膠 ( 粉 )+PRP_2 23

26 植 入 水 膠 ( 粉 )+PRP_3 以 上 各 組 標 本 情 況 看 來, 植 入 體 內 三 個 月 之 後 進 行 觀 察 發 現, 水 膠 無 降 解 現 象, 或 是 降 解 的 數 量 很 少, 肉 眼 無 法 分 辨 水 膠 植 入 大 鼠 體 內 後, 並 無 引 發 大 鼠 傷 口 感 染 或 是 死 亡 的 現 象, 顯 示 水 膠 材 料 具 有 生 物 相 容 特 性 部 分 水 膠 植 入 骨 缺 損 部 位 有 將 水 膠 頂 起 來 的 現 象, 顯 示 骨 缺 損 癒 合 速 度 與 水 膠 降 解 速 度 差 異 過 大, 骨 缺 損 癒 合 快, 水 膠 降 解 速 度 慢 但 大 多 數 標 本 材 料 與 骨 缺 損 部 位 密 合 度 良 好, 以 肉 眼 巨 觀 觀 察 並 無 水 膠 位 移 的 現 象 24

27 參 主 要 發 現 與 結 論 一 實 驗 結 果 ( 一 ) 細 胞 毒 性 測 試 使 用 MTT assay 分 析 細 胞 活 性 (OD570),LDH assay(od490) 分 析 細 胞 毒 性, 來 評 估 水 膠 材 料 毒 性 實 驗 步 驟 如 下 : 1. 接 種 細 胞.. 用 含 10%FBS 培 養 基 配 成 細 胞 懸 浮 液, 以 每 well 10 4 個 細 胞 接 種 到 96 well, 每 well 體 積 200μl. 2. 培 養 細 胞.. 於 細 胞 貼 壁 後, 依 L929 細 胞 株 培 養 條 件, 將 材 料 萃 取 液 混 和 培 養 基 進 行 培 養 24 小 時, 之 後 進 行 第 一 次 觀 察, 之 後 每 隔 24 小 時 觀 察 一 次, 總 共 觀 察 三 天 3. 呈 色.. 培 養 細 胞, 每 孔 加 MTT 溶 液 (5mg/ml 用 PBS <ph=7.4> 配 )20μl 繼 續 反 應 3 小 時 後, 停 止 反 應, 小 心 移 除 孔 內 培 養 上 清 液 每 孔 加 150μl DMSO, 振 蕩 10 分 鐘, 使 結 晶 物 充 分 融 解 4.. 比 色.. 選 擇 570nm 波 長, 在 ELSA reader 上 測 定 各 孔 光 吸 收 值, 記 錄 結 果 以 下 為 各 組 材 料 編 號 材 料 型 態 原 能 所 編 號 材 料 實 驗 編 號 水 膠 粉 狀 (99)-LAL-PAA-NIP+N1-I 粉 Hydrogel(P) 水 膠 塊 狀 (03)-IPAA+NIP-N1-1II(-a) Hydrogel-1(M)) 水 膠 塊 狀 PNI(PA)+N1-AII(S)-LAL Hydrogel-2(M) 25

28 1.MTT assay 實 驗 結 果 MTT assay of Various types of Hrdrogel Control Hydrogel(P) Hydrogel-1(M) Hydrogel-2(M) 0.3 OD Day_1 Day_2 Day_3 使 用 MTT assay 測 試 細 胞 存 活 率 (cell viability),l929 細 胞 株 與 材 料 萃 取 液 共 同 培 養 3 個 小 時 後 (Day_1) 進 行 波 長 570nm 吸 光 值 量 測, 並 且 在 共 同 培 養 24 小 時 (Day_2) 48 小 時 (Day_3) 分 別 量 測 OD570 吸 光 值 實 驗 結 果 顯 示 材 料 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性, 細 胞 存 活 率 皆 有 85% 以 上 2.LDH assay 實 驗 結 果 使 用 LDH assay 測 試 細 胞 毒 性 (cell cytoxicity),l929 細 胞 株 與 材 料 萃 取 液 共 同 培 養 3 個 小 時 後 (Day_1) 進 行 波 長 340nm 吸 光 值 量 測, 並 且 在 共 同 培 養 24 小 時 (Day_2) 48 小 時 (Day_3) 分 別 量 測 OD570 吸 光 值 實 驗 結 果 顯 示 材 料 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性 且 具 有 低 細 胞 毒 性 26

29 LDH assay of Various types of Hrdrogel OD Day_1 Day_2 Day_3 Negative-Control Hydrogel(P) Hydrogel-1(M) Hydrogel-2(M) Positive-Control ( 二 ) 細 胞 貼 附 測 試 由 於 材 料 為 塊 狀 不 透 光 彈 性 體, 所 以 將 細 胞 貼 附 其 上 後, 難 以 光 學 顯 微 鏡 直 接 觀 察, 故 於 細 胞 貼 附 於 材 料 表 面 後, 移 除 多 餘 細 胞, 使 用 MTT assay 與 LDH assay 分 析 貼 附 其 上 的 細 胞 活 性 將 材 料 製 成 薄 膜 與 培 養 基 混 合, 並 覆 蓋 過 材 料 將 一 定 數 量 的 細 胞 接 種 在 材 料 上 以 MTT LDH assay 測 試 在 材 料 表 面 細 胞 活 性 移 除 培 養 基, 並 以 PBS 清 洗 培 養 隔 夜 的 時 間, 在 顯 微 鏡 下 觀 察 其 生 長 情 形 27

30 .MTT assay 實 驗 結 果 MTT assay of Various types of Hrdrogel Control Hydrogel(P) Hydrogel-1(M) Hydro-gel-2(M) 0.3 OD Day_1 Day_2 Day_3 使 用 MTT assay 測 試 細 胞 存 活 率 (cell viability),l929 細 胞 株 於 材 料 表 面 貼 附 (overnight) 後, 共 同 培 養 3 個 小 時 後 (Day_1) 進 行 波 長 570nm 吸 光 值 量 測, 並 且 在 共 同 培 養 24 小 時 (Day_2) 48 小 時 (Day_3) 分 別 量 測 OD570 吸 光 值 實 驗 結 果 顯 示 由 於 細 胞 於 材 料 表 面 生 長 情 形 與 在 培 養 盤 中 生 長 有 所 差 異, 所 以 細 胞 於 材 料 表 面 存 活 率 不 高 28

31 2.LDH assay 實 驗 結 果 1.0 LDH assay of Various types of Hrdrogel OD Day_1 Day_2 Day_3 Negative-Control Hydrogel(P) Hydrogel-1(M) Hydrogel-2(M) Positive-Control 使 用 LDH assay 測 試 細 胞 毒 性 (cell cytoxicity),l929 細 胞 株 於 材 料 表 面 貼 附 (overnight) 後, 共 同 培 養 3 個 小 時 後 (Day_1) 進 行 波 長 340nm 吸 光 值 量 測, 並 且 在 共 同 培 養 24 小 時 (Day_2) 48 小 時 (Day_3) 分 別 量 測 OD340 吸 光 值 實 驗 結 果 顯 示 材 料 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性 且 具 有 低 細 胞 毒 性 二 結 論 本 研 究 新 型 生 醫 材 料 為 以 感 溫 性 單 體 N- 異 丙 基 丙 烯 醯 胺 (N-isopropyl acrylamine,nipaam) 丙 烯 酸 (Acrylic acid, AAC) 以 及 交 聯 劑 N,N'- 亞 甲 基 雙 丙 烯 醯 胺 (N,N-mathylene 29

32 bisacrylamide,nmba) 製 作 而 成 之 高 強 度 及 低 摩 擦 水 膠 之 生 物 可 吸 收 的 生 物 載 體 新 式 的 醫 療 用 複 合 骨 材 本 次 研 究 試 著 將 材 料 製 作 成 為 三 種 型 式, 分 別 為 粉 狀 水 膠 彈 性 塊 材 具 彈 塑 性 塊 狀 水 膠, 並 透 過 符 合 醫 療 器 材 管 理 風 險 評 估 ISO 精 神 規 範, 已 成 功 建 立 合 宜 的 新 型 醫 療 用 骨 材 材 料 開 發 流 程 在 水 膠 材 料 進 行 體 外 試 驗 部 分, 先 進 行 水 膠 材 料 細 胞 毒 性 評 估, 以 MTT assay 量 測 水 膠 材 料 對 於 細 胞 存 活 率 的 影 響, 實 驗 結 果 發 現 水 膠 的 生 物 相 容 性 良 好, 細 胞 存 活 率 皆 在 85% 以 上 以 LDH assay 量 測 水 膠 材 料 對 於 細 胞 毒 性 的 影 響, 實 驗 結 果 發 現 水 膠 材 料 的 細 胞 毒 性 低, 顯 示 其 生 物 相 容 性 良 好 接 著 進 行 細 胞 與 材 料 表 面 貼 覆 試 驗, 目 的 在 於 量 測 細 胞 與 材 料 表 面 貼 附 親 和 性, 由 於 材 料 本 身 為 立 體 結 構, 且 不 具 透 光 性, 故 於 光 學 顯 微 鏡 下 並 無 法 判 斷 故 本 研 究 利 用 MTT 與 LDH assay 進 行 細 胞 貼 附 材 料 表 面 生 長 情 況 評 估 使 用 MTT assay 測 試 細 胞 存 活 率 (cell viability),l929 細 胞 株 於 材 料 表 面 貼 附 (overnight) 後, 共 同 培 養 3 個 小 時 後 (Day_1) 進 行 波 長 570nm 吸 光 值 量 測, 並 且 在 共 同 培 養 24 小 時 (Day_2) 48 小 時 (Day_3) 分 別 量 測 OD570 吸 光 值 實 驗 結 果 顯 示 由 於 細 胞 於 材 料 表 面 生 長 情 形 與 在 培 養 盤 中 生 長 有 所 差 異, 所 以 細 胞 於 材 料 表 面 存 活 率 不 高 另 一 方 面, 使 用 LDH assay 測 試 細 胞 毒 性 (cell cytoxicity),l929 細 胞 株 於 材 料 表 面 貼 附 (overnight) 後, 共 同 培 養 3 個 小 時 後 (Day_1) 進 行 波 長 340nm 吸 光 值 量 測, 並 且 在 共 同 培 養 24 小 時 (Day_2) 48 小 時 (Day_3) 分 別 量 測 OD340 吸 光 值 實 驗 結 果 顯 示 材 料 依 然 具 有 良 好 的 生 物 相 容 性 且 具 有 低 細 胞 毒 性 30

33 肆 參 考 文 獻 1.Hsu-Wei Fang*, Trends and Challenges of Cartilage Tissue Engineering, Biomedical Engineering 2.Chih-Hung Chang, Hsu-Wei Fang*, Yi-Ching Ho, Chun-Yen Lin, Chun-Hsiung Huang, Charng-Bin Yang, Combined effects of polyethylene wear particle size and dosage on macrophage responses, Biomedical Engineering-Applications, Basis and Communications, 22(4), pp , Hsu-Wei Fang*, Shiuh-Bin Fang, Jen-Shiu Chiang Chiau, Chun-Yan Yeung, Wai-Tao Chan, Chuen-Bin Jiang, Mei-Lien Cheng, Hung-Chang Lee, Inhibitory effects of Lactobacillus casei rhamnosus on Salmonella lipopolysaccharide-induced inflammation and epithelial barrier dysfunction in a co-culture model using Caco-2/peripheral blood mononuclear cells, Journal of Medical Microbiology, 5, pp , Bacterial endotoxin test. Chapter 85, USP version Transfusion and infusion assembles and similar Medical devices. Chapter 161, USP version Guideline on validation of the Limulus Amebocyte Lysate test as an end-product endotoxin test for human. animal parenteral drugs, biological products, and medical devices. Food and Drug Administration, U.S. Department of Health and Human Services. 31