Novel RNA-based in situ hybridization for detection of Senecavirus A in pigs

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1 6 th Leman China Swine Conference Nanjing, China Tailored Diagnostic Strategies: Diagnostic Investigations and Monitoring Strategies 针对目标的诊断策略 : 诊断调查和监测策略 Jerry Torrison DVM, PhD & Fabio Vannucci DVM, PhD 杰瑞 托瑞森兽医博士和法比欧 费洛奇兽医博士

2 PRRS incidence & prevalence 蓝耳病发生率和患病率 Outbreak Investigation with virus sequences over time and space 通过病毒序列在时间和空间的分布进行疫情调查 TTS (time to stability) 到稳定的时间 Antimicrobial resistance 耐药性

3 State IL 伊利诺伊州 State MN 明尼苏达州 System 1 系统 1 System 3 系统 3

4

5

6 EWMA by State 按州看 EWMA

7 EWMA by State SUMMER 夏季 SPRING 春季

8 场点数 平均周数

9 Physiology 生理 Serum calcium, phosphorous and globulin concentrations 血清钙, 磷和球蛋白浓度 serum mineral concentration, mg/dl sow number Calcium Phos Globulin

10 Outline Diagnostic Investigation of Reproductive Disease 对于繁殖疾病的诊断性调查 Attempts to get away from the frustration: basics and challenges 尝试远离挫折麻烦 : 基础和挑战 Sampling strategies: fetal infections versus maternal illness 取样策略 : 胎儿感染与母体感染相较 Differentials: what to expect (?) 差异 : 该期待什么 (?) Still got nothing: bang your head against the wall (sow crate) 仍然什么都没有 : 拿头撞墙 ( 母猪栏 ) Applying new technologies (NGS): don t look too close 适用新的技术 ( 下一代基因测序 ): 不要看得太仔细 What does it mean? 那是什么意思? Case study: PCV3-associated abortion and myocarditis 案例 : 和猪圆环病毒 3 型有关的流产和心肌炎

11 Attempts Outlineto get away from the frustration 尝试远离麻烦 Understanding the basics 懂得最基础的 - Abortion = loss of progesterone from corpus luteum - 流产 = 因为黄体素的关系损失孕酮 - Disruption of the endocrine equilibrium of the pregnancy - 孕期内分泌失调 Abortions 流产 Return to service (RTS) 再配种 Stillbirths 死胎 Resorption Mummification 木乃化 Days skeletal Mating Implantation Fetus begins mineralization Farrowing 分娩配种着床 developing Organogenesis Immunity 胎儿免疫开始发育骨骼矿质化, 器官形成

12 Outline Attempts to get away from the frustration Understanding the challenges 了解挑战 - Same diagnostic questions: Who, When and How (?) different thought process - 一些诊断上的问题 : 谁, 何时, 如何?- 不同的思考过程 Fetal infection 胎儿感染 History of the farm and the clinical problem 农场历史以及临床问题 Pathogenesis of the potential pathogens causing abortion 潜在病原体的发病机理导致流产 Maternal illness 母体疾病

13 Outline Reproductive Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 History of the farm 农场历史 - Reproductive performance 繁殖能力 - Stage of gestation 妊娠阶段 - Sow illness: subpopulation (?) - 母猪的病 : 亚种群? - Diagnostic submissions 诊断提交

14 Reproductive Outline Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 Sampling strategies 取样策略 - Acute abortions versus recurring abortion in different stages may require multiple sampling over time 急性流产与在不同阶段反复流产可能需要随时间多次取样 - Likely not to sample/submit the first affected sow or abortions 不太可能提交或从第一头被感染母猪或第一次流产取样 - Serology 血清学 Sows 母猪 Fetus >65 days 大于 65 天的胎儿 o Identifying introduction of new pathogen acute, convalescent, pen/herd mates 确定新病原体的进入 - 急性的, 恢复期的, 圈 / 群里的同伴 o Monitoring for status for a specific pathogen 监测某一个具体病原体的状态 o Pathogen-specific: no reliable Se/Sp 特定病原 : 没有可靠的 Se/Sp o Total IgG/IgM: in-utero antigen exposure 总 IgG/IgM: 在子宫内对抗原的暴露

15 Outline Reproductive Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 Sampling strategies (Tissues) 取样策略 ( 组织 )

16 Outline Reproductive Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查

17 Outline Reproductive Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 Sampling strategies (Tissues) 取样策略 ( 组织 )

18 Reproductive Outline Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 Sampling strategies 取样策略 - Fetal infections 胎儿感染 o In general > day 14 post-infection o 基本上感染后 > 14 天 o Sow: seroconversion and no systemic infection (viremia or bacteremia) o 母猪 : 血清转化并且无系统性感染 ( 病毒血症或菌血症 ) o Fetus and/or placenta: pathogen detection (not equally distributed!) o 胎儿以及 / 或胎盘 : 发现病原 ( 不是均匀分布的!) o 4-6 fetuses/litter from at least 3 litters (assuming fetal infection 50%, litter of 12) o 至少 3 窝里的没窝 4 至 6 个胎儿 ( 假设胎儿感染率是 50%, 每窝 12 只 ) o Outcomes 结果 : Resorption RTS 再吸收 Reduced litters and abortions 减少的窝数和流产数 Mummification 木乃伊化 Stillbirths 死胎 Days 天数 Mating 配种 Implantation 着床 Bone mineralization 骨矿化 Immunity 免疫 Farrowing 分娩

19 Outline Reproductive Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 Sampling strategies 取样策略 - Maternal illness (acute phase of the disease) 母体疾病 ( 疾病的急性期 ) o Sow: may not have seroconverted opportunity for pathogen detection o 母猪 : 可能还没有血清转化 发现病原的机会 o Fetus and/or placenta: primary pathogen may not be present (but send it out!) o 胎儿以及 / 或胎盘 : 主要病原可能还未呈现 ( 但是把送出去!)

20 Outline Reproductive Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 Gross lesions 组织病变

21 Reproductive Outline Disease: Diagnostic Investigations 生殖疾病 : 诊断性调查 Gross lesions 肉眼病变 Viral abortion 病毒堕胎 Elizabeth Macarthur Agricultural Institute, NSW, Australia Bacterial and fungal abortion 细菌及真菌堕胎 Usually clustering of affected animals 通常感染动物聚集在一起 Variable: size and immune status of the herd 变数 : 群大小和免疫状态 Primary, secondary/opportunistic 主要, 次要 / 机会主义的 Fetal icterus 胎儿黄疸 Splenomegaly 脾肿大 Placental hemorrhage and necrosis 胎盘性产前出血和坏死 Culture 培养 - Placenta, lung, stomach contents 胎盘, 肺, 胃内容物

22 Reproductive Outline Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 Micro lesions 微小病灶 Bacterial and fungal abortion 细菌和真菌堕胎 Viral abortion 病毒堕胎 Nonsuppurative or Lymphocytic hint* 非化脓性或淋巴细胞性 提示 * - Encephalitis 脑炎 - Myocarditis 心肌炎 - Vasculitis 血管炎 Suppurative (usually) 化脓性的 ( 通常 ) - Pneumonia 肺炎 - Placentitis 胎盘炎 (Brucella suis) ( 猪布鲁氏杆菌 ) (Chlamydia sp) ( 衣原体 )

23 Reproductive Outline Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 Infections of the fetus 胎儿感染 PRRSv 蓝耳病病毒 CSF 猪瘟 Leptospira 细螺旋体 PRV 伪狂犬病毒 PCV2 猪圆环病毒 2 型 PPV (1 and 2) 猪细小病毒 (1 和 2) BVD 牛病毒性腹泻 EMCV 脑心肌炎病毒 Teschovirus, Enterovirus 猪肠病毒, 肠病毒 Opportunistic bacterial infections 机会性细菌感染 Brucella suis (placenta)* 布鲁氏杆菌 ( 胎盘 ) Chlamydia sp (placenta)* 衣原体 ( 胎盘 ) Maternal illness 母体疾病 PRRSv 蓝耳病病毒 CSF 猪瘟 Leptospira 细螺旋体 Influenza virus A 甲型流感病毒 Zearalenone 毒素 Erysipelas 丹毒

24 Reproductive Outline Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 Zearalenone (toxin-associated abortion) 毒素 ( 毒素相关联堕胎 ) - Fusarium roseum: estrogenic mycotoxin 粉红廉孢 : 动情素性霉菌毒素 Prepuberal gilts 发情前小母猪 Cycling gilts/sows 循环后备 / 母猪 Pregnant sows 怀孕母猪 - Diagnosis 诊断 : Dietary level 日粮水平 (ppm) >30 Clinical findings 临床发现 Vulvovaginitis and Prolapses 外阴阴道炎和下垂 Anestrous and Pseudopregnancy 休情及假怀孕 Reduce litter due to early embryonic death 由于早期胚胎死亡造成幼崽数减少 - Contaminated feed no longer available - 拿不到已经污染的饲料 - Clinical and transient 临床和暂时的

25 Outline Reproductive Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查

26 减压 在此撞头 说明 : 1. 找个坚硬的表面 2. 按照圆圈里的说明去做 3. 重复第二项直到失去知觉 4. 如果失去知觉, 停止减压活动

27 Reproductive Outline Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 Next Generation Sequencing (NGS) pathogen/emerging variant discovery 下一代基因测序 病原 / 发新发变异的发现 DNA/RNA extraction DNA/RNA 提取 Whole sequencing of clinical sample 临床样本的完全测序

28 Reproductive Outline Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 Next Generation Sequencing (NGS) pathogen/emerging variant discovery 下一代基因测序 病原 / 新变异的发现 ~ <1% potential sequences of interest 小于 1% 的重要的潜在序列

29 Reproductive Outline Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 NGS current challenges 下一代基因测序法当前挑战 - Data analysis and interpretation: normal virome within the sample - 数据分析和解读 : 样本里 正常的 病毒组 - Potential biases on sample prep: DNA virus, RNA virus, bacteria 准备样本时潜在的偏差 :DNA 病毒,RNA 病毒, 细菌 - Turnaround: >3weeks 时间 : 大于 3 周 - Cost: $ 300/sample 花费 : 一个样本 300 美金 - Lack of correlation with lesions or morphological changes in the tissues 与组织病变和形态改变缺乏相关性 o Combine with other techniques for detection of the potential pathogen in the tissues 与其它技术合并来发现组织里的潜在病原 Immunohistochemistry (IHC) 免疫组织化学 Antibody-based assay 以抗体为基础的检测 In situ hybridization (ISH) 原位杂交法 Sequence-based assay 以序列为基础的检测

30 Reproductive Outline Disease: Diagnostic Investigations 繁殖疾病 : 诊断性调查 Immunohistochemistry (IHC) 免疫组织化学 In situ hybridization (ISH) 原位杂交法 Antibody-based assay 以抗体为基础的化 Sequence-based assay 以序列为基础的化验验

31 Case Outline study: PCV3-associated reproductive failure 案例 : 猪圆环病毒 3 型关联的繁殖失败 Chronic/recurrent diagnostic investigation (abortions and postweaning wasting) 慢性 / 反复诊断性调查 ( 流产及断奶后消瘦 ) Findings 发现 : - Fetus 胎儿 : viral epicarditis 病毒心外膜炎 - Nursery 保育 : viral myocarditis, vasculitis + bacterial infections 病毒心肌炎, 血管炎 + 细菌感染 NGS 下一代基因测序 - ~50 seqs pcv-like (SFBeef and PorkNW2/USA/2009) - ~1600 seqs pcv-like (SFBeef and PorkNW2/USA/2009) - ~80 seqs pcv-like (SFBeef and PorkNW2/USA/2009) - Background (?): Astrovirus 4, Rota, hepacivirus, PCMV

32 Case Outline study: PCV3-associated reproductive failure 案例 : 猪圆环病毒 3 型关联的繁殖失败 In situ hybridization: probes PCV-like and Astrovirus 4 原位杂交法 : 探查猪圆环病毒相似体及星状病毒 4 - Astrovirus 4: negative 星状病毒 4: 阴性 - PCV-like (PCV3): positive 猪圆环病毒相似体 (3 型 ): 阳性

33 Outline Case study: PCV3-associated reproductive failure 案例 : 猪圆环病毒 3 型关联的繁殖失败

34 Outline Case study: PCV3-associated reproductive failure 案例 : 猪圆环病毒 3 型关联的繁殖失败 Going forward 进一步 - Commonly found in the US swine population 对于美国猪群很常见 o Recombinant ELISA 重组酶联免疫吸附 : 55% positive 55% 阳性 (Palinski et al 2017) n=83 o Retrospective PCR screening by UMN-VDL 明大兽医诊断实验室进行的聚合酶链反应回顾检查 (Miller et al, unpublished) n= PCV3+ (~27%) 99 PCV2+ (~21%) 43 PCV2/3+ (~9%) o Ongoing 进行中 : Retrospective PCR screening by UMN-VDL 明大兽医诊断实验室进行的聚合酶 链反应追溯检查 (Zhen et al, unpublished) n=74 15 PCV3+ (20%)

35 Outline Case study: PCV3-associated reproductive failure 案例研究 : 猪圆环病毒 3 型关联的繁殖失败 PCV2 versus PCV3 猪圆环病毒 2 型与 3 型比较 - Genetic 遗传 o Capsid proteins: amino acid sequence with 37% identity o 衣壳蛋白 : 氨基酸序列 37% 相似 - Clinical (nonspecific): can be indistinguishable - 临床 ( 非特异 ): 可能无法分辨 o Abortion, PDNS, post-weaning wasting o 流产, 猪皮炎肾病综合征, 断奶后消瘦 - Diagnosis strategies: PCV2-like 专断策略 : 与 2 型相似 o PCV3: lymphoid depletion not a remarkable feature o 3 型 : 淋巴损耗并不是一个突出特征 o Co-infection may occur 协同感染可能会发生

36 Outline Case study: PCV3-associated reproductive failure 案例 : 猪圆环病毒 3 型关联的繁殖失败 PCV3: is this real (?) 猪圆环病毒 3 型 : 这是真的吗? - Koch s postulate no (yet) Koch 的假定 还不确定 - Vaccine cross-protection seems unlikely - 疫苗的交叉保护 看上去有可能

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