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1 硕 士 学 位 论 文 论 文 题 目 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 研 究 生 姓 名 指 导 教 师 姓 名 专 业 名 称 研 究 方 向 论 文 提 交 日 期 吴 邵 花 张 弘 妇 产 科 学 生 殖 内 分 泌 2013 年 03 月

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3 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 中 文 摘 要 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 中 文 摘 要 目 的 : 研 究 kisspeptin/gpr54 在 不 明 原 因 复 发 性 流 产 患 者 母 胎 界 面 中 的 表 达 以 及 导 致 复 发 性 流 产 可 能 的 发 病 机 制 方 法 : 1 临 床 研 究 : 免 疫 组 织 化 学 方 法 检 测 32 例 不 明 原 因 复 发 性 流 产 ( unexplained recurrent spontaneous abortion,ursa) 患 者 和 35 例 正 常 妊 娠 者 绒 毛 和 蜕 膜 组 织 中 kisspeptin GPR54 PR 和 PIBF 的 表 达 情 况 2 动 物 实 验 :(1) 建 立 自 然 流 产 模 型 CBA/J DBA/2 及 正 常 妊 娠 模 型 CBA/J BALB/c, 分 别 于 妊 娠 第 9d 和 14d 处 死 取 胎 盘 组 织 进 行 kisspeptin GPR54 PR 和 PIBF 的 免 疫 组 织 化 学 染 色, 并 计 数 吸 收 ( 流 产 ) 胚 胎 数 (2) 上 述 自 然 流 产 模 型 孕 鼠 随 机 分 为 实 验 组 与 对 照 组, 自 受 孕 之 日 起 隔 日 皮 下 注 射 黄 体 酮 注 射 液 2mg/ 只 为 实 验 组, 注 射 等 量 的 注 射 用 茶 油 孕 鼠 为 对 照 组, 分 别 于 妊 娠 第 9d 和 14d 处 死 取 胎 盘 组 织 进 行 kisspeptin GPR54 PR 和 PIBF 的 免 疫 组 织 化 学 染 色, 并 计 数 吸 收 ( 流 产 ) 胚 胎 数, 比 较 各 组 之 间 的 差 异, 观 察 黄 体 酮 干 预 后 对 kisspeptin GPR54 PR 和 PIBF 表 达 的 影 响 结 果 : 1 URSA 患 者 绒 毛 kisspeptin GPR54 PIBF 的 表 达 均 明 显 低 于 正 常 妊 娠 者 (P<0.05), 绒 毛 PR 呈 阴 性 ; 蜕 膜 组 织 kisspeptin PR PIBF 的 表 达 明 显 低 于 正 常 妊 娠 者 (P<0.05), 而 GPR54 的 表 达 无 明 显 差 异 2 自 然 流 产 模 型 CBA/J DBA/2 与 正 常 妊 娠 模 型 CBA/J BALB/c 相 比, 前 者 妊 娠 第 9d 和 14d 胚 胎 吸 收 率 均 高 于 后 者 (29.17% vs 9.09%,27.27% vs 5.41%) (P<0.05) 同 时 CBA/J DBA/2 小 鼠 母 胎 界 面 kisspeptin GPR54 PR 和 PIBF 的 表 I

4 中 文 摘 要 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 达 均 明 显 低 于 CBA/J BALB/c 小 鼠 (P<0.05) 3 孕 激 素 可 使 CBA/J DBA/2 小 鼠 胚 胎 吸 收 率 下 降, 并 检 测 到 母 胎 界 面 kisspeptin GPR54 PR 和 PIBF 的 表 达 增 强 (P<0.05) 结 论 : 1 URSA 患 者 母 胎 界 面 绒 毛 和 蜕 膜 kisspeptin 表 达 下 降, 提 示 kisspeptin 及 其 受 体 GPR54 的 表 达 异 常 与 URSA 患 者 流 产 发 病 有 关 2 URSA 患 者 母 胎 界 面 kisspeptin 与 PIBF 的 表 达 之 间 存 在 正 相 关 关 系, 提 示 kisspeptin/gpr54 的 作 用 机 制 可 能 与 P/PR 及 PIBF 相 关 3 孕 激 素 补 充 上 调 kisspeptin 及 PIBF 的 表 达, 降 低 流 产 率, 提 示 kisspeptin 在 自 然 流 产 发 生 机 制 中 起 重 要 作 用 关 键 词 :Kisspeptin;PIBF; 复 发 性 流 产 作 者 : 吴 邵 花 指 导 老 师 : 张 弘 II

5 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 英 文 摘 要 Study on relationship between dysfunction of Kisspeptin/GPR54 and the pathogenesis of unexplained recurrent spontaneous abortion Abstract Objective: To investigate the expression of kisspeptin/gpr54 at maternal-fetal interface of women with unexplained recurrent spontaneous abortion(ursa) and the probable pathogenesis of recurrent spontaneous abortion. Methods: 1. Clinical research: Trophoblastic and decidual tissues were collected from 32 URSA women who miscarried a genetically normal fetus and 35 women who had voluntary abortion. Kisspeptin, GPR54, PR and PIBF were investigated with immunohistochemistry. 2. Animal experiments: (1) The resorption-prone mating of CBA/J DBA/2 mice were established as the model of spontaneous abortion and the nonabortion-prone mating of CBA/J BALB/c mice were used as the model of normal pregnancy. The placenta tissues were collected on day 9 and day 14 of gestation, then kisspeptin, GPR54, PR and PIBF were investigated with immunohistochemistry. The embryo resorption rate was separately counted on the two days. (2) Choosing the resorption-prone mating of CBA/J DBA/2 mice, which were divided equally into two groups, the group injected with progesterone every two days after mating was the experimental group, the other one injected with tea oil at the same dose on the same days was the control group. The placenta tissues were collected on day 9 and day 14 of gestation, and kisspeptin, GPR54, PR and PIBF were investigated with immunohistochemistry. The embryo resorption rate was also separately counted. Expression differences of kisspeptin, GPR54, PR and PIBF were compared between the two groups in order to observe the changes of kisspeptin, GPR54, PR and PIBF expression induced by progesterone. Results: 1. Kisspeptin, GPR54 and PIBF expression in syncytiotrophoblasts were significantly III

6 英 文 摘 要 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 decreased in URSA women as compared to controls (P <0.05). Kisspeptin, PR and PIBF expression in deciduas were significantly decreased in URSA women as compared to controls (P <0.05). GPR54 expression in deciduas nearly had no difference among study groups and controls. PR expression was negative in deciduas both of the two groups. 2. The embryo resorption rate of the resorption-prone mating of CBA/J DBA/2 mice on day 9 and day 14 of gestation were significantly higher than that of the nonabortion-prone mating of CBA/J BALB/c mice (29.17% vs 9.09%,27.27% vs 5.41%) (P <0.05). And the expression of kisspeptin, GPR54, PR and PIBF at maternal-fetal interface of spontaneous abortion mouse models were significantly lower than the normal pregnancy mouse models (P <0.05). 3. Progesterone reduced the embryo resorption rate of the spontaneous abortion mouse models and increased the expression of kisspeptin, GPR54, PR and PIBF at maternal-fetal interface(p<0.05). Conclusion: 1. The lower expression of kisspeptin at maternal-fetal interface of URSA women indicates that dysfunction of kisspeptin/gpr54 is associated with unexplained recurrent spontaneous abortion. 2. The expression of kisspeptin at maternal-fetal interface is collaborative with the expression of PIBF, which indicates that kisspeptin/gpr54 system s mechanism of action may be related to P/PR and PIBF. 3. The supplement of progesterone can increase the expression of kisspeptin and PIBF and reduce the embryo resorption rate, indicating that kisspeptin plays an important role in the pathogenesis of unexplained recurrent spontaneous abortion. Key words: kisspeptin; progesterone-induced-blocking-factor (PIBF); recurrent spontaneous abortion. Written by : Wu Shaohua Supervised by: Zhang Hong IV

7 目 录 引 言...1 第 一 部 分 Kisspeptin/GPR54 在 URSA 患 者 母 胎 界 面 的 表 达...5 材 料 与 方 法...5 结 果...9 讨 论...13 结 论...16 第 二 部 分 Kisspeptin/GPR54 与 自 然 流 产 小 鼠 发 病 关 系 以 及 孕 酮 干 预 的 研 究...17 材 料 与 方 法...17 结 果...20 讨 论...26 结 论...29 参 考 文 献...30 综 述...35 中 英 文 对 照 缩 略 词 表...43 攻 读 硕 士 学 位 期 间 公 开 发 表 的 论 文 及 科 研 成 果...44 致 谢...45

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9 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 引 言 引 言 复 发 性 流 产 (Recurrent spontaneous abortion, RSA) 是 指 连 续 2 次 或 2 次 以 上 发 生 于 妊 娠 28 周 之 前 的 妊 娠 产 物 或 胎 儿 丢 失, 而 流 产 多 数 是 发 生 在 同 一 妊 娠 月 份, 临 床 经 过 与 一 般 流 产 相 同 复 发 性 流 产 病 因 复 杂, 涉 及 遗 传 解 剖 内 分 泌 感 染 免 疫 及 环 境 污 染 等 因 素, 还 包 括 精 神 心 理 及 其 他 一 些 特 发 性 因 素 除 上 述 因 素 外, 目 前 仍 有 约 50% 的 患 者 未 发 现 明 确 的 致 流 产 因 素 [1], 称 为 不 明 原 因 复 发 性 流 产 (unexplained recurrent spontaneous abortion,ursa) URSA 是 妇 产 科 一 种 常 见 病, 高 发 病, 由 于 病 因 不 明, 临 床 上 对 其 诊 断 和 治 疗 方 面 仍 存 在 较 多 难 点 近 年 来, 众 多 学 者 对 该 疾 病 的 研 究 充 满 热 情, 深 入 研 究 其 可 能 病 因 和 发 病 机 制, 对 临 床 上 该 疾 病 的 诊 断 与 治 疗 具 有 重 大 意 义 目 前 研 究 表 明 kisspeptin 及 孕 酮 诱 导 阻 断 因 子 (progesterone-induced blocking factor,pibf) 与 复 发 性 流 产 密 切 相 关 在 此 前 长 达 十 余 年 的 研 究 中, 对 kisspeptin 的 研 究 主 要 着 重 于 其 作 为 一 个 肿 瘤 转 移 抑 制 分 子 的 功 能, 最 初 Lee 等 利 用 差 异 显 示 技 术 偶 然 发 现 非 转 移 性 黑 色 素 瘤 细 胞 株 和 转 移 性 黑 色 素 瘤 细 胞 株 cdna 之 间 存 在 一 段 序 列 差 异, 将 其 转 导 入 转 移 性 黑 色 瘤 细 胞 中, 发 现 能 使 细 胞 转 移 能 力 下 降 90% 以 上, 遂 将 这 段 基 因 序 列 分 离 克 隆, 命 名 为 KiSS-1, 其 编 码 蛋 白 即 为 kisspeptin [2] 人 类 KiSS-1 前 体 是 由 145 个 氨 基 酸 构 成 的 多 肽 类 结 构 [3],kisspeptin 通 过 进 一 步 裂 解 能 产 生 多 种 水 解 产 物, 根 据 其 所 含 肽 的 不 同 数 目, 分 别 称 为 Kp-54 (metastin),kp-14,kp-13 和 Kp-10, 这 些 水 解 产 物 统 称 为 kisspeptins, 它 们 具 有 极 为 相 似 的 生 物 学 活 性 及 功 能 其 中 最 主 要 的 一 个 kisspeptin 肽 类 产 物 是 kisspeptin-54, 主 要 是 由 胎 盘 组 织 合 成 与 分 泌 [4], 这 一 发 现 就 促 使 学 者 们 来 研 究 kisspeptins 是 否 会 在 生 殖 方 面 发 挥 重 要 作 用 Horikoshi 等 研 究 发 现 kisspeptin 在 男 性 及 非 孕 期 妇 女 体 内 水 平 极 低, 在 妊 娠 早 期 开 始 升 高, 至 妊 娠 足 月 分 娩 期 达 到 高 峰, 并 在 产 后 5 天 左 右 迅 速 降 至 非 孕 期 的 低 水 平, 并 且 kisspeptin 在 胎 盘 高 表 达, 由 此 推 测 kisspeptin 参 与 胎 盘 的 发 育, 并 且 血 清 中 kisspeptin 主 要 来 自 于 胎 盘 [5] 2004 年 Bilban 等 研 究 发 现 kisspeptin-10 能 够 抑 制 滋 养 层 细 胞 的 迁 移 和 浸 润 [6], 这 就 表 明 kisspeptin 在 妊 娠 早 期 抑 制 滋 养 细 胞 浸 润 与 调 节 胚 胎 植 入 方 面 发 挥 关 键 作 用 2010 年 1

10 引 言 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 Ramaesh 巧 妙 地 分 离 了 正 常 胎 盘 的 小 动 脉, 在 特 殊 的 Matrigel 膜 包 被 的 支 架 上 培 养, 诱 导 观 察 其 出 芽 及 形 成 分 支 血 管 的 数 目, 并 施 以 不 同 浓 度 kisspeptin-10 作 用, 结 果 显 示, 与 对 照 组 相 比,kisspeptin-10 作 用 组 的 血 管 出 芽 及 管 样 分 支 结 构 形 成 明 显 减 少, 并 呈 剂 量 依 赖 性, 说 明 kisspeptin-10 在 体 外 能 抑 制 血 管 生 成 同 时 学 者 们 在 对 脐 静 脉 内 皮 细 胞 (human umbilical vein endothelial cell, HUVEC) 株 的 体 外 培 养 中 发 现, kisspeptin-10 不 影 响 HUVEC 的 生 存 和 凋 亡, 但 是 抑 制 其 增 殖 和 细 胞 迁 移, 并 且 呈 剂 量 依 赖 性 [7] 这 一 体 内 外 结 合 实 验 证 实 了 kisspeptin-10 对 血 管 发 育 的 调 控 表 现 为 抑 制 激 活 血 管 内 皮 的 增 殖 以 及 抑 制 新 生 血 管 的 生 成 由 于 kisspeptin-10 在 胎 盘 中 呈 现 高 表 达 状 态, 因 此 可 以 推 断 出 kisspeptin-10 参 与 胎 盘 中 血 管 再 生 及 侵 袭 能 力 的 调 控 研 究 发 现 kisspeptins 有 共 同 的 受 体, 是 最 大 的 膜 受 体 家 族 G 蛋 白 偶 联 受 体 (G protein-coupled receptpr,gpr) 中 的 一 类, 称 为 GPR54, 亦 称 为 hot7t175 或 者 AXOR12[3 8] GPR54 是 一 个 新 发 现 的 孤 G 蛋 白 偶 联 受 体, 其 广 泛 存 在 于 人 体 组 织 中, 其 中 胰 腺 及 胎 盘 组 织 中 表 达 量 最 高, 其 次 为 甲 状 腺 睾 丸 脾 肾 上 腺 及 淋 巴 结 等 器 官 Kisspeptin 与 GPR54 结 合 后, 通 过 激 活 磷 脂 酶 C 途 径, 执 行 重 要 的 功 能, 如 细 胞 生 长 增 殖 转 移 等 不 论 是 kisspeptin 还 是 其 受 体 GPR54, 胎 盘 组 织 中 这 二 者 的 含 量 都 是 相 当 丰 富 的 已 有 研 究 证 实 kisspeptin 与 GPR54 相 互 作 用, 是 下 丘 脑 - 垂 体 - 卵 巢 (hypothalamus -pituitary- ovary,hpo) 轴 中 重 要 的 调 控 分 子, 它 们 对 生 殖 的 调 控 涉 及 青 春 期 的 启 动 月 经 的 周 期 调 控 排 卵 的 诱 发 及 生 殖 周 期 的 节 律 调 节 等 [9] 如 前 所 述,kisspeptin 的 表 达 在 妊 娠 期 也 有 明 显 的 变 化, 那 么 kisspeptin 的 异 常 表 达 是 否 与 妊 娠 并 发 症 及 不 良 的 妊 娠 结 局 相 关 呢?Smets 等 曾 对 870 名 孕 妇 进 行 孕 期 随 访 研 究, 最 终 有 31 名 新 生 儿 为 小 于 孕 龄 儿 (small for gestational age, SGA), 出 生 体 重 为 2665±369g, 相 应 的 对 照 组 则 为 3623±334g (P<0.05), 而 两 组 孕 妇 在 孕 8-14 周 时 检 测 的 血 浆 kisspeptin (metastin) 水 平 分 别 为 1376±1317 pmol/l 和 2035±1260pmol/L (P<0.05), 提 示 孕 早 期 母 体 外 周 血 中 kisspeptin(metastin) 低 水 平 与 新 生 儿 的 低 体 重 有 关 [10] 2009 年 Armstrong 等 对 317 名 正 常 产 妇 118 名 胎 儿 宫 内 生 长 迟 缓 的 产 妇 以 及 57 名 子 痫 前 期 的 产 妇 进 行 回 顾 性 研 究, 对 她 们 在 妊 娠 16 到 20 周 的 血 浆 kisspeptin 甲 胎 蛋 白 (alpha fetoprotein,α-fp) 及 人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 (human Chorionic Gonadotropin,hCG) 水 平 进 行 了 对 比 分 析, 发 现 胎 儿 宫 内 生 长 迟 缓 及 子 痫 前 期 患 者 妊 娠 中 期 血 浆 kisspeptin 水 2

11 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 引 言 平 中 位 数 分 别 为 1164pg/ml 及 1109pg/ml, 均 低 于 正 常 妊 娠 者 (1188pg/ml)(P<0.05), 显 示 不 良 妊 娠 者 妊 娠 中 期 血 浆 kisspeptin 较 正 常 降 低 [11] 由 此 推 断,kisspeptin 在 妊 娠 期 的 异 常 表 达 确 实 与 妊 娠 并 发 症 及 最 终 的 不 良 结 局 相 关 孕 激 素 是 一 种 21-C 的 类 固 醇 激 素, 非 孕 期 排 卵 之 后, 卵 巢 颗 粒 细 胞 逐 渐 黄 体 化 并 形 成 部 分 黄 体, 在 黄 体 生 成 素 (luteinizing hormone,lh) 及 人 绒 毛 膜 促 性 腺 激 素 (hcg) 作 用 下 开 始 分 泌 孕 激 素, 接 下 来 胎 盘 将 成 为 孕 激 素 合 成 及 分 泌 的 主 要 部 位, 这 种 从 黄 体 到 胎 盘 的 转 变 一 般 发 生 在 LH 峰 之 后 的 36 天 左 右 [12] 尽 管 黄 体 产 生 孕 激 素 能 持 续 到 妊 娠 中 期, 但 孕 期 胎 盘 是 孕 激 素 的 主 要 来 源 部 位 孕 激 素 是 女 性 生 殖 过 程 中 极 为 重 要 的 一 种 激 素 排 卵 后 孕 激 素 可 使 腺 体 迂 曲 并 呈 分 泌 状 态, 使 基 质 血 管 增 多, 提 高 子 宫 内 膜 容 受 性, 有 效 促 进 子 宫 内 膜 蜕 膜 化, 利 于 胚 泡 着 床 并 维 持 妊 娠, 促 进 子 宫 生 长, 减 弱 子 宫 平 滑 肌 收 缩 性 并 抑 制 母 体 对 胚 胎 的 免 疫 排 斥 反 应 [13] 啮 齿 类 动 物 实 验 证 实, 经 卵 巢 切 除 或 RU486 治 疗 后 其 体 内 孕 激 素 处 于 低 水 平 或 低 活 性, 最 终 都 将 导 致 流 产 的 发 生 [14] 这 一 系 列 的 妊 娠 保 护 作 用 是 孕 激 素 与 孕 激 素 受 体 (progesterone receptor,pr) 相 结 合 后 发 挥 的, 因 为 通 过 基 因 靶 向 技 术 研 究 发 现, 在 PR 缺 失 的 小 鼠 中, 孕 激 素 不 能 有 效 地 诱 导 子 宫 内 膜 蜕 膜 化 [14] 胚 胎 作 为 一 种 半 同 种 异 体 移 植 物 能 诱 导 妊 娠 期 γ/δt 细 胞 表 达 PR, 高 浓 度 的 孕 酮 与 这 些 PRs 结 合 后 可 诱 导 淋 巴 细 胞 产 生 一 种 新 的 蛋 白 质 孕 酮 诱 导 阻 断 因 子 (PIBF) PIBF 最 初 是 由 Szekeres-Bartho 发 现 的, 健 康 妊 娠 妇 女 外 周 血 淋 巴 细 胞 在 孕 激 素 的 作 用 下 能 释 放 一 种 抑 制 细 胞 毒 性 和 前 列 腺 素 F2-α 合 成 的 相 对 分 子 量 为 的 蛋 白 质, 而 在 先 兆 早 产 的 患 者 中 缺 乏 这 类 蛋 白 质, 因 此 认 为 PIBF 与 调 节 妊 娠 免 疫 密 切 相 关 [15] 近 年 来 研 究 证 实 PIBF 通 过 作 用 于 磷 脂 酶 A2 而 干 扰 花 生 四 烯 酸 代 谢, 诱 导 Th2 偏 倚 的 免 疫 反 应, 并 通 过 调 节 NK 细 胞 活 性 发 挥 抗 流 产 效 应 [16] 通 常 外 周 血 PIBF 浓 度 从 孕 7 周 开 始 逐 渐 上 升, 直 到 孕 37 周 为 止, 孕 41 周 以 后 PIBF 浓 度 会 急 剧 下 降 而 先 兆 早 产 患 者 孕 期 外 周 血 PIBF 水 平 不 能 像 正 常 妊 娠 者 一 样 上 升 [17] 对 这 些 先 兆 早 产 患 者 予 地 屈 孕 酮 治 疗 后, 外 周 血 孕 酮 和 PIBF 浓 度 明 显 提 高, 孕 周 也 随 之 延 长 2009 年 Hudic 等 对 比 研 究 30 名 孕 6-24 周 先 兆 流 产 的 女 性 及 20 名 正 常 妊 娠 妇 女 外 周 血 及 尿 液 中 PIBF 含 量 的 差 异, 结 果 得 出 先 兆 流 产 患 者 血 清 及 尿 液 中 PIBF 的 含 量 (19.5+/-12.9 ng/ml,214.4+/ ng/ml) 均 显 著 低 于 正 常 妊 娠 者 (45.3+/-33.7 ng/ml, 3

12 引 言 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 / ng/ml)[18] 由 此 看 来,PIBF 对 维 持 正 常 早 期 妊 娠 至 关 重 要 如 前 所 述, 孕 酮 通 过 作 用 于 妊 娠 淋 巴 细 胞 表 达 的 孕 酮 受 体 产 生 调 节 蛋 白 PIBF 而 对 妊 娠 起 到 保 护 作 用 朱 英 哲 等 通 过 比 较 先 兆 流 产 出 血 组 与 正 常 妊 娠 组 妊 娠 早 期 (4-10 周 ) 妇 女 外 周 血 清 中 的 性 激 素 浓 度 差 异 后 发 现, 孕 5-8 周 时 先 兆 流 产 出 血 患 者 血 孕 酮 值 明 显 低 于 同 期 正 常 妊 娠 者, 证 明 孕 酮 是 维 持 早 期 妊 娠 的 重 要 因 素 [19] 临 床 工 作 中, 对 于 孕 早 期 血 孕 酮 水 平 偏 低 的 宫 内 孕 患 者 给 予 孕 激 素 保 胎 治 疗, 可 提 高 妊 娠 成 功 率 迄 今 为 止, 有 多 年 研 究 证 实 kisspeptin/gpr54 和 PR/PIBF 体 系 对 整 个 妊 娠 过 程 起 到 了 重 要 作 用, 但 多 是 将 这 两 个 体 系 分 开 独 立 研 究, 且 更 着 重 于 外 周 血 中 各 因 子 的 表 达 情 况 本 研 究 主 要 探 讨 URSA 患 者 与 正 常 妊 娠 者 绒 毛 及 蜕 膜 组 织 中 这 二 个 体 系 表 达 情 况 及 其 可 能 的 相 关 性, 通 过 对 自 然 流 产 模 型 CBA/J DBA/2 予 不 同 时 段 孕 激 素 干 预, 研 究 母 胎 界 面 kisspeptin GPR54 PR 和 PIBF 表 达 的 变 化 情 况, 进 一 步 明 确 上 述 两 个 体 系 之 间 的 关 系, 探 讨 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 生 的 可 能 机 制, 并 为 临 床 诊 治 提 供 可 靠 的 依 据 4

13 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 第 一 部 分 第 一 部 分 Kisspeptin/GPR54 在 URSA 患 者 母 胎 界 面 的 表 达 复 发 性 流 产 在 育 龄 女 性 中 发 病 率 约 为 15%, 其 中 不 明 原 因 的 复 发 性 流 产 (URSA) 约 占 40-50%[20] URSA 通 常 发 生 于 同 一 妊 娠 月 份, 经 过 门 诊 常 规 检 查 排 除 解 剖 感 染 内 分 泌 等 常 见 致 流 产 因 素 以 外, 其 流 产 原 因 依 然 是 个 谜 面 对 这 些 患 者 的 生 育 要 求, 积 极 探 究 其 可 能 的 致 病 原 因, 提 高 生 育 率, 是 临 床 工 作 的 主 要 方 向 和 目 的 随 着 门 诊 上 该 疾 病 患 者 的 就 诊 率 逐 步 提 高, 临 床 取 材 方 便, 资 料 可 靠, 为 深 入 研 究 该 疾 病 提 供 良 好 的 资 源 本 研 究 旨 在 研 究 URSA 患 者 与 正 常 妊 娠 者 对 比, 其 母 胎 界 面 中 kisspeptin/gpr54 和 PR/PIBF 的 表 达 是 否 有 差 异, 并 进 行 相 关 性 分 析 材 料 与 方 法 1 材 料 1.1 研 究 对 象 选 取 2009 年 10 月 至 2011 年 5 月 就 诊 于 苏 州 大 学 附 属 第 二 医 院 计 划 生 育 门 诊 的 稽 留 流 产 ( 妊 娠 物 未 清 除 ) 患 者 为 实 验 组, 既 往 至 少 另 有 一 次 或 一 次 以 上 不 明 原 因 自 然 流 产 史 对 照 组 为 正 常 妊 娠 者 自 愿 要 求 终 止 妊 娠 实 验 组 : 复 发 性 流 产 患 者 32 例, 既 往 月 经 规 律, 此 次 妊 娠 以 来 无 明 显 感 染 及 服 药 史, 无 甾 体 类 激 素 服 用 史, 无 黄 体 酮 保 胎 治 疗 史, 并 排 除 以 下 因 素 : 解 剖 因 素 : 子 宫 各 种 畸 形 子 宫 肌 瘤 和 宫 颈 机 能 不 全 等 ; 内 分 泌 : 黄 体 功 能 不 足 ( 黄 体 期 雌 二 醇 和 孕 酮 测 定 ) 甲 状 腺 疾 病 糖 尿 病 等 疾 病 ; 免 疫 因 素 : 各 种 自 身 免 疫 性 疾 病 自 身 抗 体 阳 性 患 者 ( 抗 心 磷 脂 抗 体 抗 核 抗 体 以 及 抗 ENA); 感 染 因 素 :TORCH 支 原 体 和 衣 原 体 感 染 者 ; 染 色 体 因 素 : 患 者 夫 妇 双 方 的 染 色 体 畸 形, 胚 胎 染 色 体 异 常 超 声 提 示 胚 胎 停 止 发 育, 肉 眼 见 典 型 绒 毛 及 蜕 膜 组 织 对 照 组 : 正 常 妊 娠 自 愿 要 求 终 止 者 35 例, 超 声 提 示 正 常 宫 内 妊 娠, 探 及 妊 娠 囊, 5

14 第 一 部 分 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 胚 芽 与 孕 周 相 符, 并 探 及 胎 心 本 研 究 经 苏 州 大 学 附 属 第 二 医 院 伦 理 委 员 会 通 过, 所 有 研 究 对 象 均 签 署 知 情 同 意 书 1.2 标 本 收 集 妊 娠 产 物 自 宫 腔 刮 出 后, 立 即 将 新 鲜 绒 毛 及 蜕 膜 组 织 用 生 理 盐 水 漂 洗 除 去 血 液 后, 置 于 10% 甲 醛 中 固 定 小 时, 常 规 梯 度 脱 水 浸 蜡 石 蜡 包 埋, 连 续 切 片 每 张 组 织 切 片 厚 约 4um, 烤 干, 使 切 片 紧 密 粘 附, 待 HE 染 色 观 察 组 织 形 态 及 免 疫 组 化 检 测 组 织 中 kisspeptin GPR54 PR 和 PIBF 的 表 达 情 况 1.3 主 要 试 剂 (1)Kisspeptin 抗 体 ( 兔 源 KISS 1 多 克 隆 抗 体 ): 英 国 Biorbyt 公 司, 货 号 orb15892 (2)GPR54(KISS1R) 兔 抗 人 多 克 隆 抗 体 : 美 国 MBL 公 司, 货 号 LS-A1929 (3)PR 抗 体 ( 单 克 隆 兔 抗 人 孕 激 素 受 体 抗 体 ): 上 海 基 因 科 技 有 限 公 司, 货 号 GT (4)PIBF 多 克 隆 抗 体 : 美 国 Abbiotec 公 司, 货 号 (5)GTVision TM III 抗 鼠 / 兔 通 用 型 免 疫 组 化 检 测 试 剂 盒 : 上 海 基 因 科 技 有 限 公 司, 货 号 GK (6) 等 渗 PBS 液 :NaCl 8.00g,KCl 0.20g,Na 2 HPO 4 H 2 O 1.56g,KH 2 PO g, 加 水 至 1000ml, 高 温 高 压 灭 菌, 分 装 入 瓶,4 冰 箱 内 保 存 备 用 (7)0.01M 柠 檬 酸 修 复 液 : 柠 檬 酸 缓 冲 液 粉 包 1 包 溶 入 1000ml 蒸 馏 水 中 1.4 主 要 实 验 设 备 及 仪 器 (1) 徕 卡 (Leica) 切 片 机 RM2135 德 国 徕 卡 公 司 (2)PHY-III 病 理 组 织 漂 烘 仪 (3)BMJ-III 型 包 埋 机 常 州 中 威 电 子 仪 器 厂 常 州 中 威 电 子 仪 器 厂 (4) 电 热 恒 温 鼓 风 干 燥 箱 上 海 精 宏 实 验 设 备 有 限 公 司 (5) 隔 水 式 电 热 恒 温 培 养 箱 上 海 跃 进 医 疗 器 械 一 厂 (6)Zeiss 正 置 显 微 镜 (7)AxioVision Rel.4.8 计 算 机 图 像 处 理 系 统 德 国 Zeiss 公 司 德 国 Zeiss 公 司 (8) 移 液 器 :10ul 50ul 100ul 规 格 Gilson 公 司 6

15 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 第 一 部 分 2 方 法 2.1 组 织 形 态 学 检 查 HE 染 色 步 骤 : 经 固 定 包 埋 的 绒 毛 及 蜕 膜 组 织 切 片, 常 规 脱 蜡 入 水, 分 别 苏 木 素 伊 红 染 色, 二 甲 苯 透 明 后, 中 性 树 胶 封 片 具 体 步 骤 如 下 : 二 甲 苯 I 10 分 钟 二 甲 苯 II 10 分 钟 100% 酒 精 I 1 分 钟 100% 酒 精 II 1 分 钟 95% 酒 精 I 2 分 钟 95% 酒 精 II 2 分 钟 80% 酒 精 2 分 钟 70% 酒 精 2 分 钟 流 水 冲 洗 1 分 钟 蒸 馏 水 洗 1 分 钟 苏 木 素 染 色 1-3 分 钟 流 水 冲 洗 3 分 钟 0.5% 盐 酸 乙 醇 5 秒 流 水 冲 洗 2 分 钟 0.5% 伊 红 2-3 分 钟 蒸 馏 水 迅 速 冲 洗 80% 酒 精 30 秒 95% 酒 精 1 分 钟 100% 酒 精 I 2 分 钟 100% 酒 精 II 2 分 钟 二 甲 苯 I 2 分 钟 二 甲 苯 II 2 分 钟 中 性 树 胶 封 片 2.2 免 疫 组 织 化 学 染 色 法 检 测 kisspeptin GPR54 PR 和 PIBF 1 原 理 : 免 疫 组 织 化 学 又 称 免 疫 细 胞 化 学, 它 将 免 疫 学 原 理 技 术 和 组 织 病 理 学 制 片 方 法 巧 妙 地 结 合 起 来, 根 据 抗 原 与 相 应 抗 体 特 异 性 结 合 而 形 成 抗 原 - 抗 体 复 合 物 的 化 学 反 应, 通 过 使 标 记 抗 体 的 显 色 剂 ( 酶 荧 光 素 同 位 素 等 ) 显 色, 从 而 对 组 织 或 细 胞 内 抗 原 ( 或 抗 体 ) 进 行 定 位 定 性 定 量 的 研 究 以 等 渗 PBS 液 稀 释 kisspeptin GPR54 PR 和 PIBF 抗 体, 并 通 过 预 试 验 得 出 一 抗 的 最 佳 稀 释 度, 分 别 为 :kisspeptin 抗 体 1:150, GPR54 兔 抗 人 多 克 隆 抗 体 单 克 隆 兔 抗 人 孕 激 素 受 体 抗 体 PIBF 抗 体 均 为 1:100 DAB 工 作 液 的 配 制 : 实 验 前, 按 每 毫 升 B 液 (DAB 稀 释 液 ) 中 加 入 1 滴 C 液 (DAB 原 液 ) 2 操 作 步 骤 : 严 格 按 照 试 剂 盒 说 明 书 操 作, 所 有 标 本 均 为 一 次 性 检 测 完 成 (1) 石 蜡 切 片 经 58 烤 片, 浸 入 二 甲 苯 中 5 分 钟 3 次, 梯 度 酒 精 水 化 : 无 水 乙 醇 溶 液 3 分 钟 2 次 90% 乙 醇 溶 液 3 分 钟 80% 乙 醇 溶 液 3 分 钟 70% 乙 醇 溶 液 3 分 钟 流 水 冲 洗 5 分 钟 (2) 予 柠 檬 酸 缓 冲 液 高 温 高 压 抗 原 修 复 : 取 适 量 柠 檬 酸 缓 冲 液 置 于 压 力 锅 中, 大 火 加 热 至 沸 腾, 将 上 述 切 片 置 于 耐 高 温 的 染 色 架 上, 放 入 缓 冲 液 中, 继 续 加 热,2 分 钟 后 取 出 染 色 架, 迅 速 置 入 冷 水 中 冷 却, 再 用 PBS 缓 冲 液 冲 洗 3 分 钟 2 次 (3) 封 闭 内 源 性 过 氧 化 物 酶 : 将 切 片 平 放 于 湿 盒 中, 每 份 组 织 上 滴 加 过 氧 化 物 酶 阻 断 剂 (3% 过 氧 化 氢 50ul), 避 光 孵 育 15 分 钟 蒸 馏 水 冲 洗, 再 将 切 片 置 入 PBS 缓 冲 液 中, 浸 泡 5 分 钟 3 次, 取 出 并 擦 干 组 织 周 围 液 体 (4) 每 张 组 织 切 片 分 别 滴 加 ul 一 抗 工 作 液, 室 温 孵 育 30 分 钟,PBS 冲 洗 切 7

16 第 一 部 分 Kisspeptin/GPR54 表 达 异 常 与 不 明 原 因 复 发 性 流 产 发 病 关 系 的 研 究 片,PBS 缓 冲 液 中 浸 泡 5 分 钟 3 次, 取 出 并 擦 干 组 织 周 围 液 体 (5) 滴 加 ul A 液 (ChemMateTMEnVision+/HRP), 室 温 孵 育 30 分 钟 PBS 缓 冲 液 中 浸 泡 5 分 钟 3 次, 取 出 并 擦 干 组 织 周 围 液 体 (6) 滴 加 显 色 剂 DAB 工 作 液 ul, 室 温 孵 育 5 10 分 钟, 并 于 光 镜 下 控 制 显 色 显 色 完 全 后 用 蒸 馏 水 冲 洗 终 止 显 色 (7) 苏 木 精 复 染 十 余 秒 (8) 各 级 酒 精 (70% 100%) 脱 水, 每 级 3 分 钟 取 出 切 片 置 入 二 甲 苯 5 分 钟 3 次 (9) 中 性 树 胶 封 片, 显 微 镜 下 观 察 用 PBS 缓 冲 液 代 替 一 抗 做 阴 性 对 照 3 结 果 判 定 HE 染 色 做 组 织 学 对 照, 以 PBS 缓 冲 液 代 替 一 抗 作 阴 性 对 照 光 镜 下 ( 400) 观 察 阳 性 表 达 为 细 胞 核 或 细 胞 质 呈 棕 黄 色 对 实 验 结 果 进 行 半 定 量 判 定 : 染 色 强 度 依 次 为 0 分 ( 无 色 ) 1 分 ( 淡 黄 色 ) 2 分 ( 棕 黄 色 ) 3 分 ( 棕 褐 色 ); 染 色 范 围 以 染 色 细 胞 所 占 的 百 分 比 评 分 : 阳 性 细 胞 数 10% 为 0 分,11%~50% 为 1 分,51%~75% 为 2 分,>75% 为 3 分, 计 算 染 色 强 度 和 阳 性 百 分 比 的 乘 积 [21] 每 张 切 片 取 5 个 高 倍 视 野, 分 别 计 算 后 取 其 平 均 值 为 该 张 切 片 最 终 免 疫 组 化 结 果 ( 见 表 1-1) 染 色 强 度 表 1-1 免 疫 组 化 染 色 结 果 分 析 评 分 表 阳 性 细 胞 百 分 比 % 0-10(0) 11-50(1) 51-75(2) (3) 注 : 阴 性 :0 1 2 分, 阳 性 : 分 统 计 学 分 析 统 计 学 处 理 全 部 资 料 均 采 用 SPSS19.0 统 计 软 件 进 行 分 析, 研 究 对 象 基 本 数 据 用 均 数 ± 标 准 差 ( x±s) 表 示, 组 间 均 数 比 较 采 用 单 因 素 方 差 分 析 及 t 检 验 kisspeptin GPR54 PR 和 PIBF 免 疫 组 化 结 果 差 异 性 比 较 采 用 卡 方 检 验, 以 Kappa 检 验 分 析 了 解 kisspeptin 和 PIBF 表 达 的 相 关 性,P<0.05 表 示 差 异 具 有 统 计 学 意 义 8

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