中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(7): Aza-CdR 对膀胱癌细胞生长及 hsa-mir-203 表达的影响申健张越肖伟凡陈景亮马纪孙奋勇 * ( 暨南大学生命科学技

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添盛冉
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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(7): Aza-CdR 对膀胱癌细胞生长及 hsa-mir-203 表达的影响申健张越肖伟凡陈景亮马纪孙奋勇 * ( 暨南大学生命科学技术学院生物工程研究所, 广州 ) 摘要许多研究表明, mirnas 在肿瘤中失活与特定的遗传和表观遗传机制改变有关, hsamir-203 在膀胱癌组织和细胞中表达下调并扮演着抑癌基因的角色为了验证 hsa-mir-203 在膀胱癌细胞中是否受 DNA 甲基化抑制, 采用去甲基化抑制剂 5-Aza-CdR(5- 氮 -2 - 脱氧胞苷 ) 处理 5637 和 BIU-87 膀胱癌细胞, MSP 和 RT-PCR 检测表明, hsa-mir-203 的启动子在 5637 和 BIU-87 细胞中存在完全的甲基化, 而 5-Aza-CdR 能逆转 hsa-mir-203 启动子的甲基化状态, 恢复 hsa-mir-203 的表达 MTT 法测定显示, 5-Aza-CdR 使 5637 和 BIU-87 膀胱癌细胞增殖受到明显抑制, 并呈时间和剂量依赖性同时, 流式细胞仪检测显示, 5-Aza-CdR 使 5637 和 BIU-87 膀胱癌细胞周期阻滞于 G 0 /G 1 期因此, 5-Aza-CdR 能抑制膀胱癌细胞 5637 和 BIU-87 增殖并干扰其细胞周期 hsa-mir-203 启动子异常甲基化是其在膀胱癌细胞中低表达的重要机制, 5-Aza-CdR 能逆转 hsa-mir-203 基因的甲基化, 恢复 hsamir-203 的表达, 为 hsa-mir-203 作为膀胱癌去甲基化治疗的靶标提供了科学依据关键词 5-Aza-CdR; hsa-mir-203; 膀胱癌 ; DNA 甲基化膀胱癌在我国占恶性肿瘤的第八位, 是一种常 [1] 见的发病率高危害严重的泌尿系统肿瘤膀胱癌的发生是多因素多步骤的复杂病理变化过程, 既有内在的遗传因素, 又有外在的环境因素, 但确切 [2] 的病因还有待于进一步证实近几年来, mirna 与人类肿瘤的关系已成为关注的热点, 研究表明, mirna 的表达水平在许多肿瘤细胞组织中发生 [3] 异常, 它们可能起到原癌基因和抑癌基因的作用表观遗传修饰重要方式之一 DNA 甲基化也是 [4] 引起 mirna 表达水平异常的重要机制国内外研究发现, 在多种人类肿瘤中 hsa-mir-203 通常扮演着抑癌基因的角色且异常低表达, 而 hsa-mir-203 启动子序列发生超甲基化可能是导致其表达下调的主要因素我们首次在膀胱癌细胞株 5637 和 BIU-87 中通过检测 hsa-mir-203 的甲基化状态以及在改变其甲基化状态后的 hsa-mir-203 表达与细胞生长状态的改变, 探讨在膀胱癌细胞株中该 mirna 的表达与其甲基化状态的相关性本实验室保存细胞培养于含 10% 小牛血清的 MEM 培养基 (Gibco 公司 ) 中主要试剂 5-Aza-CdR 和 MTT 为 Sigma 公司产品 ; 总 RNA 抽提试剂 TRIZOL 购自 Invitrogen 公司 ; RT-PCR 试剂盒和 DNA 抽提试剂盒购自 TaKaRa 公司 ; EZ-DNA-Methylation-Gold Kit 购自美国 ZYMO RE- SEARCH 引物序列 hsa-mir-203 甲基化检测引物序列, 甲基化引物 : 5 -GGG TCG TGG AGG ATT AGT C-3 ( 正向引物 ), 5 -AAA CGA CTA AAC TCC GAA CG-3 ( 反向引物 ); 非甲基化引物 : 5 -GGG TTG TGG AGG ATT AGT T-3 ( 正向引物 ), 5 -AAA CAA CTA AAC TCC AAA CA-3 ( 反向引物 ); hsa-mir-203 RT-PCR 引物序列 : 5 -ctc aac tgg tgt cgt gga gtc ggcaat tca gtt gag CTA GTG GT-3 (RT 引物 ), 5 -aca ctc cag ctg ggg TGA AAT GTT TAG GAC CA-3 ( 正向引物 ), 5 -CTC AAC TGG TGT CGT GGA-3 ( 反向引物 ); U6 RT-PCR 引物 : 5 -ctc gct tcg gca gca cat-3 1 材料与方法 1.1 材料细胞株膀胱癌细胞株 5637 和 BIU-87, 由收稿日期 : 接受日期 : 国家自然科学基金 (No ) 资助项目通讯作者 Tel: , sunfenyong@263.net

2 申健等 : 5-Aza-CdR 对膀胱癌细胞生长及 hsa-mir-203 表达的影响 767 ( 正向引物 ), 5 -aac gct tca cga att tgc gt-3 ( 反向引物 ) 引物由上海生工合成 1.2 方法 Aza-CdR 配制将 5-Aza-CdR 按 10 mmol/l 浓度溶于 ph7.4 PBS 溶液后, 分装成 100 μl/ 管, 储存于 70 ºC 备用 MTT 法测定 5-Aza-CdR 对膀胱癌细胞增殖活性的影响取处理前的对数生长期的膀胱癌 5637 和 BIU- 87 细胞, 消化后计数, 调整细胞浓度为个 /ml, 按每孔 10 3 个细胞接种于 96 孔培养板共接种 6 块板, 每组 5 个孔, 接种 24 h 后去上清, 加入含 5-Aza-CdR 的培养液, 使其终浓度分别为 0 μmol/l 0.5 μmol/l 2.5 μmol/l 5.0 μmol/l 和 10.0 μmol/l, 继续放入 37 ºC, 5% CO 2 培养箱培养, 每天更换含 5-Aza-CdR 的新鲜培养基然后在第 1 天第 2 天第 3 条第 4 天和第 5 天各时间点分别取一板, 每孔加入 MTT 溶液 (5 g/l) 20 μl, 继续孵育 4 h, 终止培养, 弃去培养液, 每孔加入 150 μl 二甲亚砜, 震荡 10 min, 选择 490 nm 波长, 在酶标仪上测定各孔的吸光度值流式细胞仪 (FCM) 检测 5-Aza-CdR 对膀胱癌细胞周期的影响在 6 孔培养板已传代培养 24 h 后的膀胱癌 5637 和 BIU-87 细胞中, 分别加入 0 μmol/l 0.5 μmol/l 2.5 μmol/l 5.0 μmol/l 和 10.0 μmol/l 的 5-Aza-CdR, 每天更换含 5-Aza-CdR 的新鲜培养基, 待 72 h 后分别回收细胞, 以胰酶消化并 r/min 离心 5 min 收集细胞, PBS 洗涤细胞 3 次, 75% 乙醇固定, 用 RNase A( 终浓度为 0.1 g/l) 消化 30 min, 加入 0.05 g/l 碘化丙锭 (PI)250 μl, 室温避光染色 30 min 后上机检测, 测定细胞周期, 每组实验重复 3 次 MSP 方法检测膀胱癌细胞中的甲基化状态收集经 0 μmol/l 和 5.0 μmol/l 和 10.0 μmol/l 5-Aza-CdR 处理 72 h 的 5637 和 BIU-87 细胞, 按 DNA 抽提试剂盒 (TaKaRa 公司 ) 步骤抽提基因组 DNA 分别取 500 ng DNA 按 EZ Methyl-ation-Gold Kit 的操作步骤进行重亚硫酸盐处理, 纯化回收 DNA 用于甲基化特异 PCR 分析甲基化特异性 PCR 引物设计选择位于 hsamir-203 前体序列上游富含 CpG 位点区域 PCR 反应循环条件 : 94 ºC 变性 45 s, 61 ºC 退火 90 s, 72 ºC 延伸 60 s, 共 38 个循环甲基化引物扩增长度为 142 bp, 非甲基化引物扩增长度为 140 bp RT-PCR 分析 5-Aza-CdR 处理膀胱癌细胞中 hsa-mir-203 的表达收集不同浓度 5-Aza-CdR 处理的 5637 和 BIU-87 细胞, TRIZOL 试剂提取各组细胞总 RNA 用 DNase(Roche 公司 ) 消化 RNA 中痕量的 DNA, 再取 2 μg 总 RNA, 利用 Promega 公司的 Reverse Transcription System 将 RNA 逆转录成为 cdna 取 2 μl cdna 为模板进行 PCR 反应, 根据 TaKaRa 公司说明书配制 Real-time PCR 体系 (20 μl/ 体系 ), 应用 Lightcycler310 定量 PCR 仪 (Roche 公司 ) 行定量 PCR 检测, 每个样品 3 个复孔, PCR 两步法条件 : 95 ºC 10 s 预变性 ; 然后 95 ºC 5 s, 60 ºC 20 s, 共 40 个循环, 各样品采用 U6 作为内参应用 Light cycler software 4105 进行结果分析, 各样品 hsa-mir-203 相对表达率采用 2 C T 方法计算 1.3 统计学处理实验数据用 (x- ±s) 表示, 多个样本均数比较采用单因素方差分析, 两组均数比较采用 t 检验, 所有数据均由 SPSS 12.0 统计软件进行处理, P<0.05 为统计学上差异显著性 2 结果 Aza-CdR 对膀胱癌细胞增殖的影响经 0 μmol/l 0.5 μmol/l 2.5 μmol/l 5.0 μmol/l 和 10.0 μmol/l 5 个不同浓度 5-Aza-CdR 处理膀胱癌 5637 和 BIU-87 细胞 1~5 天后, 除了 0.5 μmol/l 5-Aza- CdR 处理 5637 和 BIU-87 细胞 1 天后未见细胞生长明显抑制, 其他作用浓度和时间, 随着 5-Aza-CdR 浓度增加, 抑制 5637 和 BIU-87 细胞生长的作用明显增强, 呈现明显的时间和剂量依赖性 ( 图 1) Aza-CdR 对膀胱癌细胞周期的影响膀胱癌 5637 和 BIU-87 细胞经不同浓度 5-Aza-CdR 处理 72 h 后, 流式细胞仪分析显示, 5637 和 BIU-87 细胞均在 2.5 μmol/l 5.0 μmol/l 和 10.0 μmol/l 5-Aza- CdR 处理后 G 0 /G 1 期的细胞数量明显增加, S 期和 G 2 /M 期的细胞数目明显下降 (P<0.05), 细胞阻滞在 G 0 /G 1 期 ( 图 2) Aza-CdR 对膀胱癌细胞中 hsa-mir-203 甲基化的影响 hsa-mir-203 基因启动子序列在膀胱癌 5637 和 BIU-87 细胞中为完全甲基化状态, 而在经过 10.0 μmol/l 5-Aza-CdR 处理 72 h 后, 则表现为不完全甲基化状态, 即该基因甲基化得到部分逆转 ( 图 3) 2.4 恢复人膀胱癌细胞中 hsa-mir-203 的表达经不同浓度 5-Aza-CdR 处理人膀胱癌细胞株 5637 和 BIU-87 细胞 72 h 后, RT-PCR 检测 hsa-mir-203 表达

A: 5637 cell; B: BIU-87 cell. *P<0.05 vs control group. 图 1 5-Aza-CdR 处理 5637 和 BIU-87 细胞对细胞增殖的影响 Fig.

3 768 研究论文不同浓度 5-Aza-CdR 处理人膀胱癌 5637 和 BIU-87 细胞 1~5 天 MTT 法分别于第一天第二天第三条第四天和第五天检测细胞的增殖能力 A: 5637 细胞 ; B: BIU-87 细胞各 5-Aza-CdR 浓度组与 0 μmol/l5-aza-cdr 对照组相比, *P<0.05 Bladder cancer 5637 and BIU-87 cells were treated by various concentration 5-Aza-CdR for 1~5day.The proliferation of cells was detected by MTT assay on 1st day, 2nd day, 3rd day, 4th day, 5th day. A: 5637 cell; B: BIU-87 cell. *P<0.05 vs control group. 图 1 5-Aza-CdR 处理 5637 和 BIU-87 细胞对细胞增殖的影响 Fig.1 The effect of 5-Aza-CdR on 5637 and BIU-87 cell growth 5-Aza-CdR 处理膀胱癌 5637 和 BIU-87 细胞 72 h 后流式细胞术检测细胞周期变化情况 A: 5637 细胞 ; B: BIU-87 细胞各 5-Aza-CdR 浓度组与 0 μmol/l 5-Aza-CdR 对照组相比, *P<0.05 Bladder cancer 5637 and BIU-87 cells were treated by 5-Aza-CdR for 72 h. Cell cycle phase distribution was analysesed by flow cytometry (FCM). A: 5637 cell; B: BIU-87 cell. *P<0.05 vs control group. 图 2 5-Aza-CdR 对膀胱癌细胞周期的影响 Fig.2 The effect of 5-Aza-CdR on bladder cancer cell cycle 10 μmol/l 5-Aza-CdR 处理膀胱癌 5637 和 BIU-87 细胞 72 小时后, 甲基化特异 PCR 实验 (MSP) 检测 hsa-mir-203 启动子序列甲基化情况 M: 甲基化引物扩增产物 ; U: 非甲基化引物扩增产物 ; H 2O 为阴性对照组 DNA from the indicated baldder cancer 5637 and BIU-87 cell was bisulfate-modified and analyzed for methylation of the hsa-mir-203 promoter by methylation-specific PCR analysis.the presence of a PCR product in lane U indicates unmethylated hsa-mir-203. The presence of a PCR product in lane M indicates the methylated hsa-mir-203, H 2O indicates negative control and BIU-87 cells were treated by 10 μmol/l 5-Aza-CdR for 72 h. 图 3 MSP 检测膀胱癌 5637 和 BIU-87 细胞中 hsa-mir-203 甲基化状态 Fig.3 Hsa-miR-203 methylation status analysis in bladder cancer 5637 and BIU-87 cell by methylation-specific PCR

4 申健等 : 5-Aza-CdR 对膀胱癌细胞生长及 hsa-mir-203 表达的影响 769 结果显示, 5637 和 BIU-87 细胞经 2.5 μmol/l 5.0 μmol/l 和 10.0 μmol/l 的 5-Aza-CdR 处理后恢复了 hsa-mir-203 的表达, hsa-mir-203 的表达水平与用药剂量有一定量效关系 ( 图 4) 不同浓度 5-Aza-CdR(0 μmol/l 0.5 μmol/l 2.5 μmol/l 5.0 μmol/l 和 10.0 μmol/l) 处理膀胱癌 5637 和 BIU-87 细胞后对 hsa-mir-203 表达的影响 A: 5637 细胞 ; B: BIU-87 细胞 ; 各 5-Aza-CdR 浓度组与 0 μmol/l 5-Aza-CdR 对照组相比, *P<0.05 Hsa-miR-203 relative express level in cell treated by different doses of 5-Aza-CdR (0 μmol/l, 0.5 μmol/l, 2.5 μmol/l, 5.0 μmol/l, 10.0 μmol/l). A: 5637 cell; B: BIU-87 cell. *P<0.05 vs control group. 图 4 人膀胱癌细胞中 5-Aza-CdR 诱导 hsa-mir-203 表达 Fig.4 5-Aza-CdR induced the expression of hsa-mir-203 in bladder cancer cell 3 讨论 mirna 是一类约为 18~25 个核苷酸 (nt) 的非编码单链小分子 RNA, 广泛参与机体生长发育免疫调节和肿瘤发生等生命活动过程 [5] 大多数 mirna 基因与蛋白编码基因具有相似的启动子结构, 由 RNA 多聚酶 Ⅱ 启动转录, 因此 mirna 的表达调控也受经典的表观遗传机制如 DNA 甲基化调控 [6], DNA 甲基化是指生物体在 DNA 甲基化转移酶 (DNA methyltransferase, Dnmts) 的催化下, 以 S- 腺苷甲硫氨酸 (SAM) 为甲基供体, 将甲基转移到 5- 胞嘧啶位上, 形成 5- 甲基胞嘧啶的过程 5- 甲基胞嘧啶是真核细胞 DNA 中唯一天然存在的修饰碱基, 其甲基化位点 90% 存在于二核苷酸 CpG 序列中, 该类调控模式的主要机制是调节细胞内一些关键基因表达 [7] 肿瘤中 DNA 甲基化表现为全基因组水平低甲基化, CpG 岛高甲基化, 基因组不稳定, 部分抑癌基因表达被抑制 [8] 许多 mirna 定位于 CpG 岛周围或位于其中, 在癌细胞中一些具有肿瘤抑制功能的 mirna 通常被 DNA 过度甲基化所沉默, 表明 mirna 甲基化与肿瘤发生发展密切相关 [9] DNA 甲基化导致基因沉默可由 DNA 去甲基化试剂加以逆转 5-Aza-CdR 是一种 DNA 甲基化酶抑制剂, 已通过 FDA 认证用于选择性治疗脊髓发育不 [10] 良综合征 5-Aza-CdR 可嵌入 DNA 双链中与 DNA 甲基化酶形成稳定共价复合体, 从而导致甲基化酶活性下降, 使基因组甲基化相应降低, 重新激活肿瘤 [11] 抑制基因的表达, 恢复其功能本研究证实 5-Aza-CdR 对人膀胱癌 5637 和 BIU- 87 细胞系有显著的增殖抑制作用, 并呈浓度和时间依赖性同时, 随着 5-Aza-CdR 浓度的增加, G 0 /G 1 期的细胞数量明显增加, S 期和 G 2 /M 期的细胞数目明显下降, 出现 G 0 /G 1 期阻滞因此, 5-Aza-CdR 抑制人膀胱癌细胞增殖可能是由于甲基化沉默的基因重新表达干扰细胞周期所致 hsa-mir-203 位于人 14 号染色体, 在同一区域同时拥有约 12% 已发现的 mirna 基因, 该区域也是染色体上的不稳定区域目前研究表明, hsa-mir-203 在膀胱癌食道癌和 T 细胞淋巴瘤中都异常低表达, [12-14] [15] 充当抑癌基因的角色 Bo 等在膀胱癌中证实 [16] hsa-mir-203 异常低表达且为抑癌基因 Bueno 等在 T 细胞淋巴瘤中则证实了 hsa-mir-203 启动子发生高甲基化在肝癌中低表达的 hsa-mir-203 也受 DNA [17] 甲基化的调控我们研究考察了启动子甲基化对 hsa-mir-203 表达的影响, 甲基化特异性 PCR 检测证

5 770 研究论文实 hsa-mir-203 启动子在膀胱癌 5637 和 BIU-87 细胞中存在完全甲基化, 同时发现, 5-Aza-CdR 能够逆转 hsa-mir-203 启动子甲基化状态, 使 hsa-mir-203 得以重新表达, 并且与药物作用浓度存在一定的相关性由此证明, 5-Aza-CdR 能够使膀胱癌 5637 和 BIU-87 细胞中 hsa-mir-203 去甲基化, 使 hsa-mir-203 恢复其转录活性, 从而能够发挥 hsa-mir-203 的肿瘤抑制作用此外, 也证明了 hsa-mir-203 启动子甲基化是其在膀胱癌细胞中表达缺失的重要机制总之, 5-Aza-CdR 抑制膀胱癌细胞增殖可能与干扰细胞周期提高 hsa-mir-203 的表达有关, 在膀胱癌中 hsa-mir-203 的低表达与其启动子的异常甲基化修饰相关, 5-Aza-CdR 能逆转 hsa-mir-203 的甲基化, 恢复 hsa-mir-203 的表达, 为 hsa-mir-203 作为膀胱癌去甲基化治疗的靶标提供科学依据参考文献 (References) 1 Jemal A, Bray F, Center MM, Ferlay J, Ward E, Forman D. Global cancer statistics. CA Cancer J Clin 2011; 61(2): Dyrskjot L, Zieger K, Kruhoffer M, Thykjaer T, Jensen JL, Primdahl H, et al. A molecular signature in superficial bladder carcinoma predicts clinical outcome. Clin Cancer Res 2005; 11(11): Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell 2004; 116(2): Smith SS, Kaplan BE, Sowers LC, Newman EM. Mechanism of human methyl-directed DNA methyltransferase and the fidelity of cytosine methylation. Proc Natl Acad Sci USA 1992; 89(10): Kim VN, Nam JW. Genomics of microrna. Trends Genet 2006; 22(3): Yang N, Coukos G, Zhang L. MicroRNA epigenetic alterations in human cancer: One step forward in diagnosis and treatment. Int J Cancer 2008; 122(5): Lehmann U, Hasemeier B, Christgen M, Muller M, Romermann D, Langer F, et al. Epigenetic inactivation of microrna gene hsa-mir-9-1 in human breast cancer. J Pathol 2008; 214(1): Egger G, Liang G, Aparicio A, Jones PA. Epigenetics in human disease and prospects for epigenetic therapy. Nature 2004; 429(6990): Tao L, Wang W, Li L, Kramer PK, Pereira MA. DNA hypomethylation induced by drinking water disinfection by-products in mouse and rat kidney. Toxicol Sci 2005; 87(2): Chuang JC, Jones PA. Epigenetics and micrornas. Pediatr Res 2007; 61(5 Pt 2): 24R-9R. 11 Mack GS. Epigenetic cancer therapy makes headway. J Natl Cancer Inst 2006; 98(20): Bhagwat AS, Roberts RJ. Genetic analysis of the 5-azacytidine sensitivity of Escherichia coli K-12. J Bacteriol 1987; 169(4): Feber A, Xi L, Luketich JD, Pennathur A, Landreneau RJ, Wu M, et al. MicroRNA expression profiles of esophageal cancer. J Thorac Cardiovasc Surg 2008; 135(2): Gottardo F, Liu CG, Ferracin M, Calin GA, Fassan M, Bassi P, et al. Micro-RNA profiling in kidney and bladder cancers. Urol Oncol 2007; 25(5): Bo J, Yang G, Huo K, Jiang H, Zhang L, Liu D, et al. micror- NA-203 suppresses bladder cancer development by repressing bcl-w expression. FEBS J 2011; 278(5): Bueno MJ, de Perez CI, de Gomez CM, Santos J, Calin GA, Cigudosa JC, et al. Genetic and epigenetic silencing of micror- NA-203 enhances ABL1 and BCR-ABL1 oncogene expression. Cancer Cell 2008; 13(6): Furuta M, Kozaki KI, Tanaka S, Arii S, Imoto I, Inazawa J. mir- 124 and mir-203 are epigenetically silenced tumor-suppressive micrornas in hepatocellular carcinoma. Carcinogenesis 2010; 31(5):

6 申健等 : 5-Aza-CdR 对膀胱癌细胞生长及 hsa-mir-203 表达的影响 771 Effects of 5-Aza-deoxycitydine on Proliferation of Bladder Cancer Cell Lines and Abnormal Methylation of hsa-mir-203 Shen Jian, Zhang Yue, Xiao Weifan, Chen Jingliang, Ma Ji, Sun Fenyong* (Institute of Genetic Engineering, Jinan University, Guangzhou , China) Abstract The inactivation of mirnas in tumors is related to specific genetic or epigenetic alterations according to the studies recently. hsa-mir-203, as a tumor suppessor gene, is down-regulated in bladder cancer tissues and bladder tumor cells. In order to study whether mir-203 is downregulated by DNA hypermethylation, bladder cancer cell lines 5637 and BIU-87 were treated by methylase inhibitor 5-Aza-2-deoxycytidine (5-Aza-CdR). By using MSP and RT-PCR, it indicated that the promoter of hsa-mir-203 is hypermethylated in 5637 and BIU-87. However, 5-Aza-CdR can reverse the aberrant hypermethylation of hsa-mir-203 s promoter and induce has-mir-203 expression. Moreover, 5-Aza-CdR displayed a growth inhitory effect on 5637 and BIU-87 cells in a dose- and timedependent manner after exposure to 5-Aza-CdR at different concentrations for different time. FCM analysis showed that cell cycles of 5637 and BIU-87 cells were blocked at G 0 /G 1 phase after 5-Aza-CdR treatment for 72 hours. Taken together, bladder cancer cell lines 5637 and BIU-87 cell growth could be inhibited and cell cycles could be blocked by 5-Aza-CdR. Hypermethylation of hsa-mir-203 promoter is an important mechanism of hsa-mir-203 down regulation in bladder cancer cell lines. Methylation could be reversed and hsa-mir-203 expression could be induced by 5-Aza-CdR. All of the above implies that hsa-mir-203 may serve as a demethylation therapeutic target in bladder cancer. Key words 5-Aza-CdR; hsa-mir-203 gene; bladder cancer ; DNA methylation Received: February 21, 2011 Accepted: April 19, 2011 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No ) *Corresponding author. Tel: , E- mail: sunfenyong@263.net

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼,

马丽媛, 等. 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat 细胞凋亡及其可能机制 1073 力争将茶油作为食用油的主流品种 [5] 茶麸系油茶果实榨除茶油后的废弃残渣, 药用名为茶子饼, 1072 基础研究 Basic Research www.tumorsci.org 肿瘤 2011 年 12 月第 31 卷第 12 期 TUMOR Vol. 31, December, 2011 DOI: 10.3781/j.issn.1000-7431.2011.12. 004 Copyright 2011 by TUMOR 油茶皂苷体外诱导人白血病 Jurkat

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