中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(12): RASSF1A MGMT DAPK p16 RARβ 启动子甲基化和表达与肺癌 A549 细胞对顺铂敏感性的初步研究董子鹤侯玉

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1 中国细胞生物学学报 Chinese Journal of Cell Biology 2011, 33(12): RASSF1A GT DAPK p16 RARβ 启动子甲基化和表达与肺癌 A549 细胞对顺铂敏感性的初步研究董子鹤侯玉磊李程华吴永昌陈辉 ( 重庆医科大学附属第一医院检验科, 重庆 ) 摘要有研究表明, 多个基因甲基化引起的表达改变可能是肿瘤对化疗药物敏感性的调控因素之一为了寻找肺腺癌 A549 细胞对顺铂敏感性的生物标志, 该研究以肺腺癌 A549 细胞及对顺铂耐受的同源 A549 细胞 (A549-DDP) 为研究对象, 甲基化特异性 PCR (SP) 检测五个候选基因 (RASSF1A GT DAPK p16 RARβ) 的甲基化状态, RT-PCR 检测候选基因在 mrna 水平的表达结果显示 : 在 A549 细胞中, RASSF1A GT p16 呈低甲基化状态和高表达 ; 顺铂耐受的 A549- DDP 细胞中, 这三个基因均以甲基化状态为主, mrna 表达明显下调 ; 但 RARβ 仅在 A549-DDP 细胞中呈非甲基化和高表达, DAPK 的甲基化和表达水平在两个细胞亚型间无明显差异 A549-DDP 细胞经去甲基化试剂 (5-aza-CdR) 作用后, RT-PCR 检测显示 : RASSF1A GT 在 A549-DDP 细胞中的 mrna 表达水平上调, 并呈明显的剂量依赖和时间依赖关系研究结果提示, RASSF1A GT p16 RARβ 基因甲基化修饰导致的 mrna 表达改变可能是调控肺腺癌 A549 细胞对顺铂敏感性的因素之一 RASSF1A GT p16 RARβ 甲基化谱作为肺癌对顺铂敏感性的生物标志, 值得进一步研究关键词 DNA 甲基化 ; 顺铂 ; 甲基化 PCR; 肺癌 A549 细胞株肺癌是我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一, 大部分肺癌患者发现时已属晚期, 以顺铂为基础的化学药物成了延长患者生存期的主要措施之一但对顺铂的耐受是目前临床面临的难题, 临床迫切需要针对顺铂敏感性的实验室检查, 来指导肺癌患者的个体化化疗基因甲基化是表观修饰最主要的方式, 是几乎所有肿瘤的共同特征来自临床的研究显示 : RASS- F1A (Ras association domain family 1A) GT (O 6 - methylguanine DNA methyltransferase) DAPK (death associated protein kinase) p16 RARβ (retinoic acid receptor β) 是非小细胞肺癌甲基化修饰发生频率较 [1] 高的几种抑癌基因, 有学者通过检测血浆或体液中 RASSF1A p16 等的甲基化状态, 成功地进行了肺 [2-3] 癌的辅助诊断和预后判断药理学家 Strathdee [4] 指出, 特定 DNA 的启动子甲基化是肿瘤对化疗药物敏感性反应的重要表观标志, 尤其是与 DNA 修复和凋亡相关的基因, 往往通过启动子甲基化作用, 增加 [5] 或降低肿瘤细胞对化疗药物的反应 Gaspar 等报道血浆中 GT 甲基化与恶性胶质瘤患者对化疗和放射疗法的敏感性高度相关但目前未见这些基因甲基化与非小细胞肺癌对顺铂敏感性关系的研究报道基于此, 本研究拟运用甲基化特异性聚合酶链反应 (methylation specific PCR, SP) 技术, 比较肺腺癌 A549 细胞株与其耐顺铂亚型的同源细胞株 (A549- DDP) 中 RASSF1A GT DAPK p16 RARβ 共 5 种抑癌基因的甲基化状态, 并进一步通过 RT-PCR 证实基因的异常甲基化导致其表达水平改变, 期望筛选出与肺癌 A549 细胞顺铂敏感性相关的基因甲基化谱作为潜在的实验室指标, 为进一步的研究打下基础 1 材料与方法 1.1 材料细胞株人肺腺癌耐药株 A549-DDP 及其亲本细胞 A549 细胞株由重庆医科大学附属第一医院邱峰教授惠赠, 其中, A549-DDP 细胞是在人肺腺癌细胞收稿日期 : 接受日期 : 重庆市自然科学基金 (No.2008BB5392) 资助项目通讯作者 Tel: , huichen@cqmu.edu.cn

2 1344 研究论文系 A549 的基础上, 以顺铂作为诱导药物, 采用逐步递增浓度的方法, 最终使顺铂的维持浓度达到 2 μg/ml A549-DDP 细胞在培养过程中加入 2 μg/ml 的顺铂以维持其耐药性状主要试剂顺铂购自美国 Sigma 公司, DNA 提取试剂盒购自天根生化科技 ( 北京 ) 有限公司, 甲基化修饰试剂盒购自 Zymo 公司, RNA 提取试剂盒逆转录试剂盒 TaqDNA 聚合酶均购自 TaKaRa 公司, RP- I-1640 培养基与新生牛血清购自美国 Gibco 公司 1.2 方法 SP 检测五种基因在 A549 及 A549-DDP 中的甲基化状态 (1) 基因组 DNA 抽提 : 常规培养 A549 及 A549-DDP 细胞 ( 加入 2 μg/ml 的顺铂以维持 A549-DDP 细胞耐药性状 ), 胰酶消化贴壁细胞 A549 和 A549-DDP, 离心弃液加入细胞裂解液与蛋白酶 K, 严格按试剂盒说明抽提 DNA 所得 DNA 溶液在紫外分光光度计中检测浓度 ; (2) 基因组 DNA 的亚硫酸氢盐处理 : 按 ZYO 试剂盒说明书操作, 用亚硫氢酸盐法对基因组 DNA 的胞嘧啶进行转化 : 取基因组 DNA 约 1 000~1 500 ng, 与 CT 转化剂混匀后避光条件下进行温度变性 : 98 ºC 10 min, 64 ºC 2.5 h 反应溶液经洗涤脱硫, 用于下一步 PCR 反应 ; (3) PCR 反应 : 参考文献 [6-9] 设计 RASSF1A GT p16 RARβ DAPK 基因甲基化特异性 PCR 引物, 引物序列退火温度及产物长度见表 1 PCR 反应体系 25 μl, 其中 : PCR buffer (g 2+ ): 表 1 RASSF1A GT p16 RARβ DAPK 甲基化特异性 PCR 引物 Table 1 ethylation primers for RASSF1A, GT, p16, RARβ and DAPK 基因引物序列退火温度 (ºC) 产物长度 (bp) Genes Primers Sequences Temperature (ºC) Length (bp) RASSF1A S: 5 -GGG TTT TGC GAG AGC GCG-3 A: 5 -GCT AAC AAA CGC GAA CCG S: 5 -GGT TTT GTG AGA GTG TGT TTAG A: 5 -CAC TAA CAA ACA CAA ACC AAA C-3 GT S: 5 -TTT CGA CGT TCG TAG GTT TTC GC-3 A: 5 -GCA CTC TTC CGA AAA CGA AAC G S: 5 -TTT GTG TTT TGA TGT TTG TAG GTT TTT GT A: 5 -AAC TCC ACA CTC TTC CAA AAA CAA AAC A-3 p16 S: 5 -TTA TTA GAG GGT GGG GCG GAT CGC-3 A: 5 -GAC CCC GAA CCG CGA CCG TAA S: 5 -TTA TTA GAG GGT GGG GTG GAT TGT A: 5 -CAA CCC CAA ACC ACA ACC ATA A-3 RARβ S: 5 -TCG AGA ACG CGA GCG ATT CG-3 A: 5 -GAC CAA TCC AAC CGA AAC GA S: 5 -TTG AGA ATG TGA GTG ATT TGA A: 5 -AAC CAA TCC AAC CAA AAC AA-3 DAPK S: 5 -GGA TAG TCG GAT CGA GTT AAC GTC-3 A: 5 -CCC TCC CAA ACG CCG A S: 5 -GGA GGA TAG TTG GAT TGA GTT AAT GTT A: 5 -CAA ATC CCT CCC AAA CAC CAA-3 注 : : 甲基化引物 ; : 非甲基化引物 ; S: 正义链 ; A: 反义链 Note: : methylation primer; : unmethylation primer; S: sense primer; A: antisense primer. 2.5 μl; dntp: 2 μl; 引物各 1 μl; TaKaRa LA Hot start Taq: 0.15 μl; 亚硫酸氢盐修饰后的 DNA: 5 μl; 双蒸水补足至 25 μl 反应条件: 95 ºC 预变性 5 min, 95 ºC 变性 30 s, 退火 50 s, 72 ºC 延伸 30 s, 共 35 个循环, 72 ºC 延伸 10 min 产物于 2% 琼脂糖凝胶中电泳 15 min RT-PCR 检测五种基因在 A549 及 A549-DDP 中的 mrna 表达参照文献 [10-13] 设计引物, 其中 GAPDH 作为内参基因引物序列退火温度及片段长度见表 2 收集 A549 及 A549-DDP 细胞, 按 TRIzol 试剂盒说

董子鹤等 : RASSF1A GT DAPK p16 RARβ 启动子甲基化和表达与肺癌 A549 细胞对顺铂敏感性的初步研究 1345 表 2 RASSF1A GT p16 RARβ 和 DAPK 逆转录 PCR 引物 Table 2 Primers for amplifying RASSF1A, GT, p16, RARβ and DAPK 基因引物序列退火温度 (ºC) 产物长度

3 董子鹤等 : RASSF1A GT DAPK p16 RARβ 启动子甲基化和表达与肺癌 A549 细胞对顺铂敏感性的初步研究 1345 表 2 RASSF1A GT p16 RARβ 和 DAPK 逆转录 PCR 引物 Table 2 Primers for amplifying RASSF1A, GT, p16, RARβ and DAPK 基因引物序列退火温度 (ºC) 产物长度 (bp) Genes Primer sequences Temperature (ºC) Length (bp) RASSF1A S: 5 -GAT GAA GCC TGT GTA AGA ACC GTC CT-3 A: 5 -CAG ATT GCA AGT TCA CCT GCC ACT A GT S: 5 -GCC GGC TCT TCA CCA TCC CG-3 A: 5 -GCT GCA GAC CAC TCT GTG GCA CG p16 S: 5 -AGC CTT CGG CTG ACT GGC TGG-3 A: 5 -GCG CTG CCC ATC ATC ATG AC RARβ S: 5 -AAT TCA GTG AAC TGG CCA CC-3 A: 5 -GGC AAA GGT GAA CAC AAG GT DAPK S: 5 -CAG TTT GCG GTT GTG AAG AA-3 A: 5 -CCT GCA ACG AGT TCC AAG AT GAPDH S: 5 -GTC ACC AGG GCT GCT TTT AAC-3 A: 5 -TGA TGG GAT TTC CAT TGA TGA 明书提取总 RNA, DEPC 水溶解, 80 ºC 保存备用取总 RNA 500 ng 逆转录后 PCR, 反应条件如下 : 95 ºC 预变性 3 min, 94 ºC 变性 30 s, 退火 30 s, 72 ºC 延伸 30 s, 共 30 个循环 GAPDH 以相同条件反应 30 个循环产物在 2% 琼脂糖凝胶中电泳 15 min 去甲基化试剂对基因甲基化程度和表达水平的影响取对数生长期 A549-DDP 细胞, 以 10% 小牛血清 RPI-1640 培养基制成单细胞悬液, / 孔接种于 6 孔板, 每孔 2 ml 24 h 后, 分别加入浓度为 0, 1, 5, 10, 20, 40 μmol/l 的 5-aza-CdR 继续培养分别于 24, 48, 72, 96 h 提取细胞总 RNA, RT-PCR 检测 5-aza-CdR 对 A549-DDP 高甲基化基因 (RASSF1A GT p16) mrna 表达的影响, 方法和条件同前 2 结果 2.1 A549 细胞及 A549-DDP 细胞中五个基因甲基化状态的比较 SP 检测 A549 与 A549-DDP 细胞中 RASSF1A GT p16 RARβ DAPK 基因甲基化情况见图 1 SP 结果显示 : A549 细胞中, RASSF1A p16 及 -: 甲基化阴性对照 ; -: 非甲基化阴性对照 -: methylation control; -: unmethylation control. 图 1 A549 和 A549-DDP 细胞株中 RASSF1A GT p16 RARβ 和 DAPK 的甲基化状态 Fig.1 ethylation status of RASSF1A, GT, p16, RARβ and DAPK in A549 and A549-DDP cell lines

1346 研究论文 GT 基因主要呈未甲基化状态, 而在顺铂耐受的 A549-DDP 细胞中, 主要呈甲基化状态 ; 但 RARβ 的情况与前面三个基因刚好相反, 在 A549 细胞中呈甲基化状态, 而在顺铂耐受的 A549-DDP 细胞中呈非甲基化状态 ; 但 DAPK 基因在两个细胞亚型间均呈非甲基化状态 2.

细胞中的表达明显高于 A549 细胞 DAPK 的表达在两细胞亚型间无明显差别结果显示基因表达水平与其甲基化状态成反比关系 2.3

4 1346 研究论文 GT 基因主要呈未甲基化状态, 而在顺铂耐受的 A549-DDP 细胞中, 主要呈甲基化状态 ; 但 RARβ 的情况与前面三个基因刚好相反, 在 A549 细胞中呈甲基化状态, 而在顺铂耐受的 A549-DDP 细胞中呈非甲基化状态 ; 但 DAPK 基因在两个细胞亚型间均呈非甲基化状态 2.2 A549 细胞及 A549-DDP 细胞中五个基因 mrna 表达水平的比较 RT-PCR 检测 A549 细胞与 A549-DDP 细胞中 RASSF1A GT p16 RARβ DAPK 的 mrna 表达水平见图 2 RT-PCR 显示 : A549 细胞中 RASSF1A GT p16 基因的 mrna 表达明显高于 A549-DDP 细胞株而 RARβ 在 A549-DDP 细胞中的表达明显高于 A549 细胞 DAPK 的表达在两细胞亚型间无明显差别结果显示基因表达水平与其甲基化状态成反比关系 2.3 去甲基化试剂对 A549-DDP 细胞 RASSF1A GT 和 p16 基因表达的影响不同浓度 5-aza-CdR 对 A549-DDP 细胞 RASS- F1A GT 和 p16 表达的影响 1~40 μmol/l 的 5-aza-CdR 作用 A549-DDP 48 h 后, RASSF1A GT 和 p16 的 mrna 表达情况见图 3 图 3 显示, 给药后 RASSF1A 和 GT mrna 的表达水平有不同程度提高, 其相对表达量在一定范图 2 A549 及 A549-DDP 细胞株中 RASSF1A GT p16 RARβ 和 DAPK 基因 mrna 表达 Fig.2 mrna expression of RASSF1A, GT, p16, RARβ and DAPK in A549 and A549-DDP cell lines 1-6: 5-aza-CdR 给药浓度分别为 0, 1, 5, 10, 20, 40 μmol/l; 7: A549 细胞株 ; : DNA 分子量标准 1-6: the concentrations of 5-aza-CdR were 0, 1, 5, 10, 20, 40 μmol/l; 7: A549 cell line; : DNA marker. 图 3 不同浓度 5-aza-CdR 作用后 A549-DDP 细胞株中 RASSF1A GT p16 mrna 的表达 Fig.3 mrna expression of RASSF1A, GT and p16 in A549-DDP cell line treated with different concentrations of 5-aza-CdR

5 董子鹤等 : RASSF1A GT DAPK p16 RARβ 启动子甲基化和表达与肺癌 A549 细胞对顺铂敏感性的初步研究 1347 围内呈剂量依赖性但 p16 的表达几乎未见变化 aza-CdR 作用不同时间对 A549-DDP 细胞 RASSF1A GT 和 p16 表达的影响 10 μmol/l 的 5-aza-CdR 作用 A549-DDP 细胞 24~96 h 后, mrna 的表达水平见图 4 提示随着去甲基化药物 (5-aza- CdR) 作用时间的延长, RASSF1A 和 GT 逐渐恢复表达, 给药 48 h 后, 两基因的表达相对稳定 1-4: 10 μmol/l 的 5-aza-CdR 作用时间分别为 24, 48, 72, 96 h 1-4: treated with 10 μmol/l of 5-aza-CdR for 24, 48, 72, 96 h. 图 4 10 μmol/l 的 5-aza-CdR 作用不同时间后 A549-DDP 细胞株中 RASSF1A 与 GT 的表达 Fig.4 Expression of RASSF1A and GT in A549-DDP cell line in different time duration after treated with 10 μmol/l 5-aza-CdR 3 讨论表观遗传学研究表明, DNA 的甲基化修饰能够 [14] 调控基因的转录 Teodoridis 等的研究表明, 参与细胞周期调控细胞凋亡通路及 DNA 修复的基因发生甲基化修饰而导致的表达沉默, 能够导致肿瘤细 [15] 胞发生获得性耐药吴俚蓉等报道 : A549-DDP 细胞株为 hlh1 部分甲基化细胞株, 5-aza-CdR 作用后可以部分逆转该细胞的耐药性状, 增强对顺铂的敏感性, 该研究提示基因甲基化可能参与了肺癌细胞 [16] 对顺铂的耐药 Glasspool 等认为, 以甲基化为主的表观遗传学修饰可能是获得性药物抵抗的潜在因素, 但临床化疗耐药的发生应是多个基因表达改变共同作用的结果本研究以 A549 细胞株及其顺铂耐药亚型 A549-DDP 细胞株为研究对象, 比较与肺癌发生发展和预后相关的五种抑癌基因的甲基化状态在两者间的差异, 本研究发现 : RASSF1A GT p16 的高甲基化和 RARβ 的非甲基化可能与 A549 细胞对顺铂的耐受有一定关系 RASSF1A 是被广泛研究的抑癌基因, 参与了肿瘤发生发展的全过程本研究中, A549-DDP 细胞是与 A549 细胞同源的顺铂耐受亚型, A549-DDP 细胞株中 RASSF1A 主要呈甲基化状态, 其表达水平明显低于亲本 A549 细胞 ; 而 5-aza-CdR 在一定程度上可逆转 RASSF1A 的甲基化, 并呈剂量依赖和时间依赖关系, 这提示 RASSF1A 甲基化修饰及表达改变可能与 A549- DDP 耐受顺铂有关 Koul 等 [17] 研究提示 RASSF1A 等基因的甲基化与生殖细胞癌对顺铂抵抗有关, 也支持我们的结论 GT 是 DNA 修复基因, 其异常甲基化引起的表达沉默可能是细胞癌变的机制之一已有研究表明 : GT 的甲基化可作为非小细胞肺癌早期诊断的分子生物学标志 [18] 本研究发现 : A549-DDP 细胞中 GT 的甲基化水平高于其亲本细胞, GT 在耐药细胞株中的表达也相应明显降低, 5-aza-CdR 作 [19] 用后可部分上调其表达但 Hegi 等在恶性胶质瘤的研究中发现, GT 的高表达是其发生烷化剂耐药的机制之一, GT 的甲基化能够增加恶性胶质瘤病人烷化剂治疗的生存率, 这与我们在肺癌研究中的发现不一致, 是否与恶性肿瘤的组织来源不同有关, 值得进一步研究 p16 基因的编码产物 P16 蛋白是作用于细胞分裂周期的关键酶之一, 它直接作用于细胞周期抑制细胞增殖, 如表达缺失则致细胞永生化形成肿瘤本研究发现, 顺铂耐受的 A549-DDP 细胞, p16 发生完全甲基化状态致其表达沉默, 但 1~40 μmol/l 的去甲基化试剂 5-aza-CdR 均未能逆转 p16 的 mrna 表达, 我们不清楚为何 5-aza-CdR 不能逆转其表达, 计划在今后的实验中加大去甲基化试剂浓度和延长作用时间 RARβ 是重要的维甲酸受体临床研究显示, 非小细胞肺癌组织中 RARβ 甲基化频率较高 [20] 但本研究在细胞水平发现 : 耐药的 A549-DDP 细胞中 RARβ 呈非甲基化状态, 其表达明显高于 A549 细胞, 与 RASSF1A GT 在两个细胞株的甲基化和表达 [17] 情况刚好相反 Koul 等对男性生殖细胞瘤的研究显示, RARβ 的甲基化只发生在对顺铂敏感的男性生殖细胞瘤, 提示顺铂可诱导 RARβ 的去甲基化, 导致 RARβ 表达增强, 与我们的结果较吻合可见, RARβ 的甲基化可能是顺铂耐药的负性因素, 值得进一步研究证实本研究比较了肺癌 A549 细胞株及耐顺铂亚型 A549-DDP 细胞株中 RASSF1A GT DAPK p16

6 1348 研究论文 RARβ 五种抑癌基因的甲基化状态与 mrna 水平, 发现 A549 肺癌细胞对顺铂的耐受可能与 RASSF1A GT p16 的高甲基化和 RARβ 的低甲基化相关这为进一步研究非小细胞肺癌对顺铂的耐药机制提出了可供参考的方向, 至于 RASSF1A GT p16 RARβ 甲基化谱是否可作为肺腺癌细胞对顺铂化疗敏感性的实验室指标, 值得在细胞水平和临床病例中进一步研究参考文献 (References) 1 Fujiwara K, Fijimoto N, Tabata, Nishii K, atsuo K, Hotta K, et al. Identification of epigenetic aberrant promoter methylation in serum DNA is useful for early detection of lung cancer. Clin Cancer Res 2005; 11(3): 彭再梅, 山长婷, 王惠芳. 诱导痰 RASSF1A, P16 和 DAPK 基因启动子区甲基化在肺癌诊断中的价值. 中南大学学报 ( 医学版 ) 2010; 35(3): Fischer JR, Ohnmacht, Rieger N, Zemaitis, Stoffregen C, anegold C, et al. Prognostic significance of RASSF1A promoter methylation on survival of non-small cell lung cancer patients treated with gemcitabine. Lung Cancer 2007; 56(1): Strathdee G. Epigenetic markers and response to chemotherapy in cancer. Disease arkers 2007; 23(1/2): Gaspar N, arshall L, Perryman L, Bax DA, Little SE, Viana- Pereira, et al. GT-independent temozolomide resistance in pediatric glioblastoma cells associated with a PI3-Kinase-mediated HOX/stem cell gene signature. Cancer Res 2010; 70(22): Endoh H, Yatabe Y, Shimizu S, Tajima K, Kuwano H, Takahashi T, et al. RASSF1A gene inactivation in non-small cell lung cancer and its clinical implication. Int J Cancer 2003; 106(1): Kato, K Iida S, etake H, Takagi Y, Yamashita T, Inokuchi, et al. ethylated TS1 and DAPK genes predict prognosis and response to chemotherapy in gastric cancer. Int J Cancer 2008; 122(3): Abbaszadegan R, oaven O, Sima HR, Ghafarzadegan K, A rabi A, Forghani N, et al. p16 promoter hypermethylation: A useful serum marker for early detection of gastric cancer. World J Gastroenterol 2008; 14(13): Kuroki T, Trapasso F, Yendamuri S, atsuyama A, Alder H, ori, et al. Allele loss and promoter hypermethylation of VHL, RAR-β, RASSF1A, and FHIT tumor suppressor genes on chromosome 3p in esophageal squamous cell carcinoma. Cancer Res 2003; 63(13): Narayan G, Arias-Pulido H, Koul S,Vargas H, Zhang FF, Villella J, et al. Frequent promoter methylation of CDH1, DAPK, RARβ, and HIC1 genes in carcinoma of cervix uteri: Its relationship to clinical outcome. ol Cancer 2003; 2: Lenz G, Hutter G, Hiddemann W, Dreyling. Promoter methylation and expression of DNA repair genes hlh1 and GT in acute myeloid leukemia. Ann Hematol 2004; 83(10): Ivanova1 TA, Golovina1 DA, Zavalishina LE, Volgareva G, Katargin AN, Andreeva YY, et al. p-regulation of expression and lack of 5 -CpG island hypermethylation of P16 INK4a in HPV-positive cervical carcinomas. BC Cancer 2007; 7: Koul S, Houldsworth J, ansukhani, Donadio A, ckiernan J, Reuter VE, et al. Characteristic promoter hypermethylation signatures in male. ol Cancer 2002; 1: Teodoridis J, Strathdee G, Plumb JA, Brown R. CpG-island methylation and epigenetic control of resistance to chemotherapy. Biochem Soc Trans 2004; 32(Pt6): 吴俚蓉, 胡春宏. HLH1 基因甲基化与非小细胞肺癌顺铂耐药方面的研究. 中国癌症杂志 2010; 20(7): Glasspool R, Teodoridis J, Brown R. Epigenetics as a mechanism driving polygenic clinical drug resistance. Brit J Cancer 2006; 94(8): Koul S, ckiernan J, Narayan G, Houldsworth J, Bacik J, Dobrzynski DL, et al. Role of promoter hypermethylation in Cisplatin treatmen response of male germ cell tumors. ol Cancer 2004; 3: 孔云明, 金永堂, 薛绍礼, 于在诚, 徐迎春, 陶文虎, 等. NSCLC 患者血浆和 GT 基因甲基化检测及临床意义. 肿瘤 2007; 127(9): Hegi E, Liu L, Herman JG, Stupp R, Wick W, Weller, et al. Correlation of O 6 -methylguanine methyltransferase (GT) promoter methylation with clinical outcomes in glioblastoma and clinical strategies to modulate GT activity. J Clin Oncol 2008; 26(25): 张晨烨, 金永堂, 徐鹤云, 张虎, 张伟民, 孙肖瑜, 等. P16 DAPK 和 RARβ 基因启动子 CpG 岛甲基化与非小细胞肺癌临床特征的关系. 中华医学遗传学杂志 2011; 28(1): 23-8.

7 董子鹤等 : RASSF1A GT DAPK p16 RARβ 启动子甲基化和表达与肺癌 A549 细胞对顺铂敏感性的初步研究 1349 The Relationship between the ethylation of RASSF1A GT DAPK p16 RARβ and the Sensitivity to Cisplatin in A549 Cell Line Dong Zihe, Hou Yulei, Li Chenghua, Wu Yongchang, Chen Hui* (Clinical Laboratories, the First Affiliated Hospital of Chongqing edical niversity, Chonqing , China) Abstract It was reported that the changes of multiple gene expression regulated by the methylation might be one of regulation factor in the sensitivity to chemotherapy. In order to search for the biomarker for the sensitivity to cisplatin in lung cancer, A549 cell line and its homologous cisplatin-resistant cell line (A549-DDP) were cultured. ethylation specific PCR (SP) was used to detect the methylation status of 5 candidate gene (RASSF1A, GT, DAPK, p16, RARβ). RT-PCR was used to detect the mrna expression of these 5 genes among the two cell lines. The results indicated, in A549 cell line, RASSF1A, GT, p16 were unmethylated and high expressed, and the three genes were hypermethylated and low expressed in A549-DDP cell line, but unmethylated status and high level of mrna expression of RARβ gene were found in A549-DDP only, and there was no difference in the methylation and expression of DAPK. Treated with demethylating agent (5-aza-CdR), the mrna expression of those three hypermethylation gene (RASSF1A, GT, p16) in A549-DDP was upregulated, the effect was dependent on the concentration of 5-aza-CdR and the time duration. The present study indicated that the mrna changes regulated by the methylation of RASSF1A, GT, p16, RARβ might be the possible reason for A549 s sensitivity to cisplatin. As a potential biomarker for the sensitivity to cisplatin, the methylation panel of RASSF1A, GT, p16, RARβ in lung cancer is deserved to be further investigated in clinic. Key words DNA methylation; cisplatin; methylation specific PCR; lung adenocarcinoma A549 cell line Received: August 2, 2011 Accepted: September 2, 2011 This work was supported by the Chongqing Natural Science Foundation (No.2008BB5392) Corresponding author. Tel: , huichen@cqmu.edu.cn

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分子生物学实验专题手册.ai >> 2002 Piscataway CRO OptimumGene TM CloneEZ ONE-HOUR Western TM THE TM Epitope Tag 36 36 39 40 41 41 41 45........................ 47 47 47 47 48............... 19 19 20 21 22............... 23 23 24

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